Z Instytutu Inżynierii i Biotechnologii Żywności ART w Olsztynie Dyrektor: prof. dr hab. H. Kozłowska

ROCZN. PZH, 1986, XXXVII, Ńr 4

WŁADYSŁAW KORZENIOWSKI, BARBARA JANKOWSKA, ALEKSANDRA KWIATKOWSKA

DOBÓR METOD OZNACZANIA WITAMINY D W KRYLU I JEGO FRODUKTACH

Z Instytutu Inżynierii i Biotechnologii Żywności ART w Olsztynie Dyrektor: prof. dr hab. H. Kozłowska

Na podstawie doboru metod oznaczania witaminy D w krylu mro-

żonym сут, tuskanym i mączce przyjęto technikę zmydlania na

ciepło z dodatkiem przeciwutleniacza, oddzielenie witaminy D od po- zostałych związków niezmydlających się metodą chromatografii cienko-

warstwowej i ilościowe oznaczenie metodą spektrofotometryczną.

Kryl i jego produkty wykazują niską zawartość witaminy D.

W związku z możliwościami połowu oraz przetwórstwa kryla antark- tycznego, w Polsce w ostatnich latach przedmiotem licznych opracowań była charakterystyka fizyko-chemiczna tego skorupiaka [3, 12]. Wyniki badań wykazały między innymi, że frakcja tłuszczowa kryla zawiera stosunkowo dużą ilość substancji niezmydlających się, wśród których przypuszczalnie znajdują się również rozpuszczalne w tłuszczach wita- miny: A, Di E[11]. Taką możliwość potwierdza występowanie znacz- nych ilości witamin, zwłaszcza A i D nie tylko w rybach lecz również w innych skorupiakach morskich [11].

W ramach prac dotyczących możliwości zastosowania kryla antark- tycznego w przetwórstwie i żywieniu zwierząt, oprócz analiz podstawo- wych składników bardzo: istotne jest określenie poziomu witamin, a przede wszystkim witaminy D, której obecność w paszy jest niezbęd- na, zwłaszcza przy żywieniu młodych organizmów. Z uwagi na odmien- ność surowca oraz z braku standardowej metody oznaczania witaminy D podjęto prace mające na celu dobór metody oznaczania tego związku w krylu i jego produktach.

We wstępnej fazie opracowania, znając aktualny stan badań z tego zakresu zdecydowano się na przyjęcie metod fizyko-chemicznych. De- cyzję tę podjęto po przeanalizowaniu licznych publikacji dotyczących oznaczania witaminy metodami fizyko-chemicznymi, które wykazały, że najskuteczniejsza w tym względzie jest metoda spektrofotometrii w ultrafiolecie J1, 5, 6, 10]. Pozwala ona na ustalenie rzeczywistej zawar- tości witaminy D i wyklucza możliwość niewłaściwej jej identyfikacji.

W niniejszych badaniach nie brano pod uwagę biologicznej metody oznaczania poziomu zawartości witaminy D z uwagi na jej kosztowność i długotrwałość.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Doboru metody oznaczania witaminy D w krylu i jego produktach dokonano przede wszystkim na wzorcu krystalicznym tego związku, firmy BH Chemicals LD Poole, England, stosowanym do celów biochemicznych, po uprzednim sprawdzeniu jego czystości spektrofotometrycznej.

Nr 4 Oznaczanie witaminy D w kryłu 297

Doświadczenia wykonano w dwóch etapach: w pierwszym badano wpływ ko- lejnych faz oczyszczania witaminy D na wyniki jej ilościowego oznaczania. Prze-

badano zmydlanie próby i izolację substancji niezmydlających się oraz oddzielenie

witaminy D od pozostałych związków, wchodzących w skład frakcji niezmydlają- cych się.

W końcowym etapie doświadczenia opracowaną metodą oznaczenia witaminy D; określono poziom tego związku w krylu mrożonym (całym i łuskanym) i mączce z kryla. Produkty te pochodziły z wyprawy Morskiego Instytutu Rybackiego, rejon szelfu Georgia.

Oznaczanie witaminy Dz

Witaminę D; oznaczano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 265

nm [6].

Zmydlanie próbek

W celu określenia wpływu techniki zmydlania na ilościowe wyniki cznaczania witaminy Ds zmydlano krystaliczną witaminę D łącznie z tłuszczem nie zawiera- jącym tego związku: na zimno, na ciepło w atmosferze azotu oraz na ciepło z przeciwutleniaczem. W tym celu do tłuszczu zawierającego witaminę D; dodano świeżo przygotowany 2 n alkoholowy roztwór KOH. Przy zmydlaniu na zimno po-

zostawiano próbki w szczelnie zamkniętych kolbach, w ciemnym pomieszczeniu

przez 24 godziny. Na ciepło zmydlanie wykonywano na łaźni wodnej w tempera- turze 80%C bezpośrednio po dodaniu alkoholowego roztworu KOH. Jako przeciw-

utleniacz stosowano hydrochinon. Po zmydleniu rozcieńczano próbki wodą desty-

lowaną i ekstrahowano witaminy D mieszaniną eteru etylowego i naftowego (1:2).

Ekstrakt eterowy płukano wodą i sączono przez sączek z bezwodnym siarczanem sodu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość rozpuszczano w alkoholu etylo- wym i odczytywano ekstrakcję przy długości fali 245 do 300 nm. i

Oczyszczanie witaminy D

. Вадапа witaminę oczyszczano techniką chromatografii cienkowarstwowej na Е w układzie rozpuszczalników cykloheksan: octan etylu

Metoda ekstrakcji witaminy D z żelu

Przebadano trzy rodzaje rozpuszczalników do ekstrakcji witaminy Dz z żelu,

którymi były: alkohol etylowy 96%o [4], chloroform [1] i eter naftowy [9]. Na

płytkę nanoszono określoną ilość wzorca witaminy Ds, a następnie zbierano pasek żelu wraz z witaminą do probówek zawierających po 5 ml alkoholu etylowego, chloroformu lub eteru naftowego. Zawartość probówek dokładnie wytrząsano, a po odwirowaniu płynu zlewano go znad osadu i odczytywano ekstynkcję przy dłu- gości fali 265 nm.

Oznaczanie witaminy D w krylu i jego produktach

Tłuszcz wyekstrahowany z 25 g kryla mrożonego lub mączki mieszaniną chlo-

roformu z metanolem 2:1 zmydlano przy użyciu 200 ml świeżo przygotowanego

2 n alkoholowego roztworu KOH metodą na zimno lub na ciepło z dodatkiem

przeciwutleniacza. Po zakończeniu procesu zmydlania ekstrahowano substancje nie zmydlające się. W tym celu próbkę rozcieńczono 50 ml wody destylowanej i ekstrahowano mieszaniną eterów: naftowego i etylowego 2:1. Rozpuszczalniki od- parowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w 0,5 ml chloroformu i natychmiast nanoszono na płytkę chromatograficzną z żelem krzemionkowym. Po rozwinięciu chromatogramu w układzie rozpuszczalników cykloheksan: octan etylu (3:1) płytkę suszono w atmosferze azotu i poprzez spryskanie zewnętrznych pasków stężonym kwasem siarkowym lokalizowano witaminę D. Żel z niespryskanych pasków zbie- rano do probówek, zalewano alkoholem etylowym i po odwirowaniu mierzona wartość ekstynkcji roztworu przy długości fali 265 nm. Ilość witaminy D odczyty- wano z krzywej wzorcowej.

298 W. Korzeniowski i inni Nr 4

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

Przebadany w pierwszym etapie wpływ techniki zmydlania próbek wykazał, że średni odzysk badanej witaminy w próbkach przy zmydle- niu na zimno wyniósł 85,83%. Z kolei w próbkach zmydlanych na ciepło bez przeciwutleniacza odzyskano średnio 28,40% witaminy D, a z zasto- sowaniem związku przeciwutleniającego 91,99% (tab. I).

Tak więc wykazano, że dla oznaczania witaminy D nieprzydatna jest technika zmydlania na ciepło bez zastosowania przeciwutleniacza, czyli ochronne działanie tylko gazu obojętnego jest niewystarczające.

Przy zastosowaniu metody zmydlania na zimno, pomimo wysokiego odzysku 85,83% (tab. I) otrzymano duży rozrzut uzyskanych wyników, sięgający 15%. Natomiast najwyższe ilości badanej substancji odzyskano w procesie zmydlania próbek na ciepło z dodatkiem przeciwutleniacza (tab. I). Uzyskane w ten sposób wyniki charakteryzował również niski,

nie przekraczający 10% rozrzut. ,

Tabela I. Ilość odzyskanej witaminy D3 po zmydleniu próbek łącznie z tłaszczem

Zmydlenie na zimno Zmydlenie na ciepło Zmydlenie na ciepło

Dodana z przeciwutleniaczem

Lp. ilość

ug odzysk odzysk odzysk

EB % Hg % НЕ %

l 1204800 j.m. 110 91,67 34 28,33 110 91,67

2 M 103 85,83 40 33,38 110 91,67

3 ss 107 89,17 40 33,33 100 83,33

4 „ 96 80,00 27 22,50 100 83,33

5 5 105 87,50 34 . 28,33 115 95,83

6 s 90 75,00 30 25,00 110 91,67

7 в 108 90,00 30 25,00 112 93,33

8 25 s 106 90 88,33 75,00 33 34 38,33 27,50 115 111 95,83 95,50

10 5 108 90,00 33 27,50 112 93,33

11 s 108 90,00 40 33,33 116 96,67

12 si 105 87,50 34 28,33 100 83,33

13 " — — — — 111 92,50

14 5 — — — — 120 100,00

15 » — m — — 96 80,00

Średnio - 103,0 _ 85,83 34,1 28,40 109,2 91,99

Powyższe badania sugerują więc celowość stosowania metody zmydla- nia na ciepło z przeciwutleniaczem oraz nieprzydatność metody zmyd- lania na ciepło bez przeciwutleniacza. W dalszej części doświadczenia stosowano więc zmydlanie próbek na ciepło z przeciwutleniaczem w at- mosferze azotu, a także zmydlanie na zimno, które pomimo pewnych wad (duży rozrzut wyników) jest jednak bardzo wygodne w wykonaniu.

Uzyskane wyniki, dotyczące wpływu metody zmydlania na ilość ozna-

czanej witaminy D w próbce potwierdziły badania między innymi Bolin-

gera [2], który podaje, że czysta witamina D w procesie alkalicznego

zmydlania przechodzi w 10—12% w prekalciferol, a około 1% tej wita-

miny ulega całkowitemu rozkładowi. Podobnie Jannecke [7] wykazał, że

zmydlanie witaminy D; alkoholowym roztworem KOH w temperaturze

80°C przez 30 minut powoduje częściowe przejście witaminy w prowi-

taminę.

Мг 4 Oznaczanie witaminy D w krylu 299

Następnym etapem doświadczenia było określenie zmian jakościowych witaminy, zachodzących pod wpływem zmydlania. Na podstawie odczy- tów wartości ekstynkcji wykreślono krzywe absorpcji próbek zawierają- cych witaminę D;, poddanych zmydleniu na zimno óraz zmydleniu na ciepło z przeciwutleniaczem i porównano je z przebiegiem krzywej ab- sorpcji witaminy D; nie poddawanej zmydleniu.

Stwierdzono że krzywa absorpcji witaminy D po zmydleniu na ciepło z dodatkiem hydrochinonu była bardzo podobna do krzywej wzorca tej witaminy nie poddawanej procesowi zmydlania. Zaocserwowano jedynie pewne nieznaczne zniekształcenia tej krzywej, w przedziale długości fali 265 do 285 nm. Z kolei krzywa absorpcji wyznaczona dla próbki zmyd- lanej na zimno charakteryzowała się niższymi wartościami ekstynkcji dla poszczególnych długości fali przeciętnie o wartość 0,1, co sugeruje występowanie zmian jakościowych oraz strat ilościowych tej witaminy.

Zasadniczym problemem analitycznym poprzedzającym ilościowe 0Z- naczanie witaminy D jest jej oddzielenie od pozostałych związków two- rzących grupę substancji niezmydlających się, a zwłaszcza karotenoidów i pokrewnych witaminie D steroli. W wyniku badań stwierdzono, że najskuteczniejsze jest oczyszczanie badanej witaminy za pomocą chro- matografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym w układzie roz- puszczalników cykloheksan: octan etylu 75:25 [8]. Następnie w celu określenia zmian ilościowych witaminy D izolowanej z mieszaniny sub- stancji niezmydlających się metodą chromatografii cienkowarstwowej, w pierwszej kolejności ustalono technikę ekstrakcji tego związku z żelu oraz dobór odpowiedniego rozpuszczalnika. Przedstawione w tabeli II wyniki wykazują różnice w ilości odzyskanej witaminy D w zależności od rodzaju rozpuszczalnika, bowiem średni odzysk badanej substancji wyniósł przy ekstrakcji eterem naftowym 90,32%, chloroformem 93,16%

i alkoholem etylowym 95,68%.

Tabela II. Hlość witaminy D odzyskanej z płytek bez rozwijania chromatogramu w zależności od stosowanego rozpuszczalnika

Tlość Alkohol etylowy Chloroform Kter naftowy

Lp dodana odzysk odzysk odzysk

EP ug % ug % ug %

1 215 215 100,00 195 90,67 203 94,42

2 215 208 96,74 207 96,27 203 94,42

3 215 207. 96,28 203 94,42 193 89,30

4 215 213 99,07 209 97,20 177 82,32

5 215 212 98,60 192 89,30 169 78,60

6 215 208 96,74 183 85,11 200 ‚ 93,02

7 215 203 94,42 203 94,42 203 94,42

8 215 193 89,76 209 97,20 190 88,37

9 215 203 94,42 211 97,13 207 96,28

10 215 219 97,67 203 94,42 185 86,04

11 215 210 97,67 203 94,42 - - 190 88,37

12 215 205 95,35 188 87,44 200 93,02

13 215 195 89,76 181 84,18 203 94,42

14 215 203 94,42 209 97,20 190 88,37

15 215 203 94,42 209 97,20 201 93,48

Srednio 205,7 95,68 200,3 93,16 194,2 90,32

300 W. Korzeniowski i inni Мг 4

Z uwagi na powyższe wyniki oraz fakt, że witamina D w roztworze chloroformowym jest bardzo podatna na utlenianie [4] zdecydowano, że w celu dalszych oznaczeń zostanie zastosowana ekstrakcja badanej wi- taminy alkoholem etylowym.

Kolejnym etapem badań było określenie wielkości odzysku tego związku po rozwinięciu chromatogramu, czyli po oddzieleniu od xozo- stałych substancji niezmydlających się. W tym celu na płytkę nanoszono określoną ilość wzorca witaminy D;, rozwijano chromatogram w ukia- dzie rozpuszczalników cykloheksan: octan i po rozwinięciu ekstrahowano witaminę alkoholem etylowym. Po odwirowaniu żelu odczytywano wartość ekstynkcji badanego roztworu przy 266 nm.

W wyniku analizy stwierdzono, że technika cienkiej warstwy umożii- wia odzyskanie 88,8% wzorca witaminy D, czyli o około 6,5% mniej niż po naniesieniu na płytkę z żelem (tab. III). Straty te są przypuszczalnie spowodowane przejściem pewnej ilości witaminy D w formy utlenione w wyniku stosunkowo długiego czasu rozwijania chromatogramu.

Z kolei rozrzut wyników, który mieścił się w przedziale od 83,25% do 95,81%, wskazuje na konieczność zachowania dużej staranności i spraw- ności manualnej przy zbieraniu żelu z płytki oraz ekstrakcji witaminy.

Ponadto oczyszczanie witaminy D na cienkiej warstwie musi być wyko- nane w ciemni z czerwonym źródłem światła, w przeciwnym razie do- chodzi do znacznie wyższych strat tego związku.

Tabela IIL ilość witaminy D; odzyskanej z płytek po rozwinięciu cliromatogramu

Tlość Odzysk | Ilość Odzysk

Lp. nanoszona ————————| p. | nanoszona —— 7

ug HB % | ug HB ‘о

1 215 186 86,51 9 215 206 95,81

2 215 179 83,25 10 215 186 85,11

3 215 188 87,44 и 215 180 83,72

4 215 206 95,81. 12 215 196 86,51

5 215 185 86,04 13 215 200 93,02

6 215 205 95,34 14 215 191 88,83

7 216 195 89,76 15 215 190 88,37

8 215 189 87,90

Średnio 191,1 88,88

Badania doboru metod oznaczania witaminy D; w krylu i produktach pochodnych sugerują ekstrakcję tłuszczu z badanych surowców miesza- niną chloroformu z metanolem 2:1, zmydlanie wyekstrahowanego tłusz- czu techniką na ciepło z przeciwutleniaczem lub na zimno oraz rozdział

Tabela IV. Zawartość witaminy Dz w krylu mrożonym, krylu łuskanym i mączce z kryla w zależności od techniki zmydlania i

Technika zmydłania

Rodzaj surowca

; ,

na zimno

z przeciwutleniaczem

a ciepło

HE jem. ug jm.

Kry! mrożony cały 100 g 114,6 4592 119,0 4760

Kryl mrożony łuskany 100 g 141,2 5648 149,6 5984

Mączka z kryla 100 g 173,0 6920 178,0 7120

Nr 4 Oznaczanie witaminy D w krylu 301

witaminy D; od substancji niezmydlających się, metodą chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym przy użyciu układu rozpusz- cząlników cykloheksan: octan etylu 3:1, a następnie ekstrakcję z żelu alkoholem etylowym i oznaczenie wartości ekstynkcji przy długości fali 265 nm.

Opracowana metoda oznaczania witaminy D3 zostala zastosowana do określenia poziomu tego związku w krylu mrożonym całym i łuskanym oraz mączce z kryla (tab. IV).

W wyniku oznaczenia stwierdzono średnią zawartość witaminy D; w krylu mrożonym całym przy zmydlaniu próbek na ciepło z przeciwutle- niaczem 4760 j.m., a przy zmydlaniu na zimno próbek z tego surowca 4592 j.m. Niewielkie różnice w ilości oznaczanej witaminy potwierdziły możliwość stosowania obu technik zmydlania dla tego typu surowca.

Podobne różnice w zależności od rodzaju zmydlania zaobserwowano przy określeniu ilości witaminy w krylu mrożonym łuskanym. Wyższą zawartość witaminy D w krylu mrożonym łuskanym niż w krylu mro-.

żonym całym należy między innymi tłumaczyć zmianami proporcji składników, spowdowanymi usunięciem pancerzy chitynowych przy łus- kaniu kryla.

Najwyższą zawartość witaminy D3 w przeliczeniu na 100 g produktu stwierdzono w mączce z kryla — 7120 j.m. w próbkach zmydlanych na ciepło z przeciwutleniaczem i 6920 j.m. w próbkach zmydlanych na zim- no. Pomimo tej pozornie najwyższej ilości badanego związku w mączce, w odniesieniu do 100 g tłuszczu ilość ta była niższa niż w tłuszczu kryla mrożonego i łuskanego.

Uzyskane wyniki nawet po uwzględnieniu strat w czasie przechowy- wania badanego materiału sugerują pogląd, że kryl i jego produkty nie stanowią liczącego się źródła witaminy D;.

WNIOSKI

Na podstawie doboru metod oznaczania witaminy D w krylu i jego produktach zaleca się:

1) technikę zmydlania próbek na ciepło z dodatkiem przeciwutlenia- cza w atmosferze azotu,

2) oddzielenie witaminy D od pozostałych związków niezmydlających się techniką chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym w układzie rozpuszczalników cykloheksan : octan etylu 3:1,

3) ilościowe oznaczenie witaminy D metodą spektrofotometryczną przy długości fali'265 nm.

Uzyskane wyniki ilościowego oznaczenia witaminy D w krylu i jego produktach wykazały niską zawartość tego związku w badanym ma-

teriale. .

В. Коженёвски. Б. Янковска, А. Квятковска

ПОДБОР МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА Ш В КРЫЛИ И ИЗДЕЛИЯХ ИЗ КРЫЛИ

Резюме

Исполнено исследования влияния очередных стадий очищения витамина О

на результаты его количественного обозначения. Обработанным методом прове-

дено анализ обозначения содержания витамина О в крыли и изделиях из крыли.

N

302 W. Korzeniowski i inni Nr 4

Рекомендируется технику омыления проб в тёплым в атмосфере азота с до- бавлением противокислителя отделения витамина О от других немыленных субстанций тонкослойным хроматографическим методом на кремнезёмным желе, применяя как растворители циклогексан и уксусный этил (3:1) и количествен- ное определение витамина Р слектрофотометрическим методом.

W. Korzeniewski B. Jankowska, A. Kwiatkowska

THE CHOICE OF METHODS FOR VITAMIN D DETERMINATION IN CRILL AND ITS PRODUCTS

Summary

The effects of successive stages of vitamin D purification on the results of its quantitative determinations were studied. The prepared method was used for the determination of vitamin D in crill and its products.

The suggested technique is that of warm saponification of the samples in nitrogen atmosphere with added antioxidant, followed by vitamin D separation from other non-saponiiiable substances by the method of thin-layer chromato- graphy on silica gel using as solvents cyclohexane and ethyl acetate (3:1) with spectrophotometric quantitative determination of vitamin D.

PISMIENNICTWO

1. LAi S. L.: Chemisch Vitamin D, Bestimmung in Lebertran. Z. Anal. Chem.

1972, 262, 278. — 2. Bolliger II. R., Kónig A.: Qantitative Bestimmung von Vitamin

D in Konzentraten Arzneimitteln und weiteren Kombinationspriparaten mittels

Diinnschicht-Chromatographie. Z. Anal. Chem. 1965, 124, 1. — 3. Bottino N. R:

Lipid composition of two species of Antarctic krill Euphausia superba and Eup- hausia crystallophias. Comp. Biochem. Physiol. 1975, 50, 479. — 4. Doboszyńska B., Lipka E.: Oznaczanie witaminy D w tranie z zastosowaniem metod fizyko-chemicz- nych. Chem. Anal. 1976, 21, 673. -— 5. Gałecka H., Pączek K., Wardyńska W.: Po- równanie fizyko-chemicznych metod badania witaminy D po chromatograficznym oddzieleniu od związków biologicznie czynnych. Acta Polon. Pharm. 1972, 29, 257. — 6. Gstirner F.: Chemisch — physikalische Vitaminbestimmungsmethoden. Stuttgart 1965. — 7. Janecke H., Maas-Goebels I.: Beobachtungen bei Vitaminbestimmungen.

Z. Anal. Chem. 1960/61, 178, 161. — 8. Nabholz A.: Chemical determination of vi- tamin D in dietetic products. Trav. Chim. Aliment. Hyg. 1977, 68, 86. — 9. Pawlik J. Szopa J.: Oznaczanie witaminy D w koncentratach witaminowych. Zesz. Nauk.

SGGW Warszawa-Wrocław 1974. — 10. Ropolewski A.: Kryl antarktyczny i jego eksploatacja. Gdynia MIR 1975.

11. Van der Veen J., Medwadowski B., Olcott H. S.: The lipids of krill Eup- hausia species and red crab Pleuroncodes planipes. Lipids 1971, 6. 481.

Dn. 1985.05.07.

10-719 Olsztyn-Kortowo.