PLATELIA Candida Ag Plus 1 płytka

(1)

PLATELIA™Candida Ag Plus

1 płytka — 96 62784

WYKRYWANIE ANTYGENU MANNANOWEGO CANDIDA W LUDZKIEJ SUROWICY LUB LUDZKIM OSOCZU W TEŚCIE IMMUNOENZYMATYCZNYM

881122– 2013/11

1- ZASTOSOWANIE

Platelia™ Candida Ag Plus jest immunoenzymatycznym testem z zastosowaniem mikropłytki kanapkowej (ang. sandwich microplate assay) do wykrywania krążącego antygenu mannanowegoCandidaw ludzkiej surowicy lub ludzkim osoczu.

2- WSKAZANIA DO STOSOWANIA

Rozpoznanie inwazyjnej kandydozy musi opierać się na połączeniu wykrywania przeciwciał i krążących antygenów.¹³

Platelia™Candida Ag Plus (nr kat. 62784) jest testem, który w połączeniu z testem Platelia™CandidaAb Plus (nr kat. 62785) przyczynia się do wcześniejszego diagnozowania¹¹ i poprawy czułości rozpoznania inwazyjnej kandydozy, jako części kompletnego podejścia diagnostycznego łączącego naturalne i jatrogenne czynniki ryzyka, jak również dane kliniczne i mykologiczne10, 13, 14. Ta kombinacja testów jest również integralną częścią klinicznych i laboratoryjnych procesów monitorowania pacjenta, jako pomoc w podejmowaniu decyzji terapeutycznych. ⁸

3- WARTOŚĆ KLINICZNA

Zakażenia Candida należą do najczęstszych przyczyn szpitalnych zakażeń grzybiczych; kandydemie są czwartą co do częstości przyczyną szpitalnych zakażeń krwi (ang. blood stream infections, BSI). 12, 15, 16

Inwazyjne kandydozy stanowią najgroźniejszą formę zakażenia Candida, ze śmiertelnością w zakresie od 30 do 70% u pacjentów z obniżoną odpornością. Ich rozpoznanie jest nadal trudne ze względu na brak swoistości objawów klinicznych i niskiej czułości posiewów z krwi. Rozpoznanie inwazyjnej kandydozy, prowadzące do rozpoczęcia odpowiedniego leczenia, jest zwykle oparte na połączeniu danych^2.. W tym kontekście w rozpoznaniu kandydozy układowej muszą być wykorzystane techniki serologiczne z bezpośrednimi metodami mykologicznymi. Wykrywanie antygenów krążących w surowicy lub osoczu poprawia rozpoznanie u pacjentów zagrożonych inwazyjną kandydozą10, 13, 14. Główne czynniki ryzyka obejmują neutropenię po chemioterapii lub leczeniu immunosupresyjnym (pacjenci z rakiem, pacjenci onkohematologiczni i po przeszczepach)^4,10, szerokie spektrum antybiotykoterapii, cewniki dożylne, żywienie pozajelitowe, dializę nerek, wszczepienie protezy (u pacjentów hospitalizowanych na oddziałach ogólnych i intensywnej opieki medycznej).^{5, 13, 16}

Wśródantygenów Candida, mannan jest polisacharydem niekowalencyjnie związanym ze ścianą komórkową drożdży i stanowi ponad 7% suchej masy C. albicans. Antygen ten wydaje się jednym z głównych markerów biologicznych do rozpoznania inwazyjnej kandydozy. Regularne monitorowanie pacjentów z grup ryzyka, łączenie wykrywania krążących antygenów mannanowych i przeciwciał przeciw-mannanowi jest pomocne w rozpoznaniu inwazyjnej kandydozy. ^{9, 10, 13}

4- PODSTAWY PROCEDURY

Platelia™Candida Ag Plus jest jednoetapowym immunoenzymatycznym testem z zastosowaniem mikropłytki kanapkowej do wykrywania krążącego antygenu mannanowego Candida w surowicy lub osoczu ludzkim. W teście wykorzystywane jest przeciwciało monoklonalne szczura (MAb), EBCA-1, które jest skierowany przeciwko oligomannozydom Candidaα 1-5 i zostało scharakteryzowane w poprzednich badaniach^{13, 14.}. Przeciwciało EBCA1 MAb jest wykorzystywane do:

• opłaszczenia studzienek mikropłytki i wiązania antygenu mannanowego

• wykrywania związanego na mikropłytce antygenu (odczynnik koniugatu: znakowane peroksydazą MAb).

Próbki surowicy lub osocza są poddawane obróbce cieplnej w obecności EDTA w celu oddzielenia kompleksów immunologicznych i wytrącenia białek surowicy, które mogłyby zakłócać przebieg reakcji testu immunologicznego. Obrobione próbki surowicy lub osocza i koniugatu dodawane są do dołków mikropłytki opłaszczonej przeciwciałem monoklonalnym.

Po inkubacji w temperaturze 37°C, poszczególne paski z dołkami są przemywane w celu usunięcia niezwiązanego materiału.

Jeśli nie ma krążącego antygenu mannanowego w próbce ludzkiej, powstaje kompleks: MAb przeciwko monoklonalne – mannan Ag - przeciwko monoklonalne MAb/peroksydaza.

Następnie dodawany jest roztwór chromogenu zawierający substrat peroksydazy i jest inkubowany w temperaturze pokojowej, co umożliwia wykrycie wszelkich kompleksów związanych w dołkach mikropłytki.

Reakcja enzymatyczna jest przerywana przez dodanie kwasu siarkowego 1 N. Absorbancja (gęstość optyczna) próbek ludzkich i roztworu kalibracyjnego jest określana z wykorzystaniem spektrofotometru ustawionym na wartość 450/620 nm.

(2)

5- ODCZYNNIKI

Odczynniki dostarczane są w ilości wystarczającej do wykonania 96 oznaczeń w maksymalnie 9 seriach.

Warunki przechowywania i termin ważności odczynników podano na etykietach na opakowaniu.

Przed użyciem odczekać, aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową (od +18 do 30°C). Bezpośrednio po użyciu doprowadzić temperaturę odczynników ponownie do wartości od +2 do 8°C. Niewykorzystane paski ponownie włożyć do torebki i szczelnie zamknąć. Nie usuwać środka suszącego.

Składnik Zawartość Ilość

R1 Microplate

Mikropłytka:

- 96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych

monoklonalnym przeciwciałem EBCA-1 przeciwko mannanowi. 1 R2

Concentrated Washing Solution

(20x)

Stężony roztwór do mycia (20x):

– bufor Tris NaCl (pH 7,4) – 2 %Tween^® 20

– Środek konserwujący: 0,04 % ProClin™300

1 x 70 ml

R3 Calibrator 0

Roztwór kalibracyjny 0 pg/ml (gotowy do użycia):

– Bufor Tris-NaCl-Trehalose, niezawierający oczyszczonego mannanu Candida albicans

– Środek konserwujący: 0,151 % ProClin™300

1 x 2,0 ml

R4a Calibrator 62.5

Roztwór kalibracyjny 62,5 pg/ml (gotowy do użycia):

– Bufor Tris-NaCl-Trehalose

– Oczyszczony mannan Candida albicans – Środek konserwujący: 0,151 % ProClin™300

1 x 2,0 ml

R4b Calibrator 125

1 x 2,0 ml

R4c Calibrator 250

1 x 2,0 ml

R4d Calibrator 500

1 x 2,0 ml

R0 Negative Control

Kontrola ujemna:

– Ludzka surowica nie zawierająca mannanu

– Środek konserwujący: 0,3% ProClin™ 300 2 x 1,5 ml

R5 Positive Control

Kontrola dodatnia:

- Ludzka surowica zawierająca mannan – Środek konserwujący: 0,15% ProClin™300

2 x 1,5 ml

R6 Conjugate

Koniugat (gotowy do użycia):

– Monoklonalne przeciwciało anty-mannanowe znakowane peroksydazą

– Purpura bromokrezolowa

– Środek konserwujący: 0,15% ProClin™300

1 x 17 ml

R7 Sample Treatment

Solution Roztwór do obróbki próbki (gotowy do użycia):

– Roztwór kwasu EDTA ze środkiem konserwującym 1 x 10,5 ml R9 Chromogen TMB Roztwór chromogenu TMB (gotowy do użycia):

– Roztwór 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyny (< 0,1 %), H2O2 (<1,0 %) 1 x 28 ml

R10 Stopping Solution Roztwór przerywający reakcję (gotowy do użycia):

– Roztwór kwasu siarkowego 1N 1 x 28 ml

6- OSTRZEŻENIA DLA UŻYTKOWNIKÓW 1. Tylko do diagnostyki in vitro

2. Wyrób przeznaczony wyłącznie do stosowania przez personel medyczny.

3. Nie zaleca się stosowania testu z próbkami innymi niż próbki surowicy lub osocza krwi ludzkiej.

(3)

4. Kontrola ujemna R0 i kontrola dodatnia R5 są przygotowywane z ludzkiej surowicy, która została przetestowana i nie stwierdzono jej reagowania w kierunku przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2 oraz przeciwciał anty-HCV, a także dla antygenu HBs dla testów ze znakiem CE. Niemniej jednak z wszystkimi odczynnikami należy postępować, jak gdyby mogły być źródłem zakażenia. Wszystkie testy powinny być przeprowadzone zgodnie z normą OSHA dotyczącą patogenów przenoszonych przez krew, poziomu 2 bezpieczeństwa biologicznego lub innymi odpowiednimi praktykami bezpieczeństwa biologicznego.

5. Stosować odzież ochronną, w tym fartuch laboratoryjny, ochronę oczu/twarzy i rękawiczki jednorazowego użycia (syntetyczne, zalecane są rękawice niezawierające lateksu); z odczynnikami zestawu i próbkami pacjentów należy postępować zgodnie z wymaganymi dobrej praktyki laboratoryjnej (ang. Good Laboratory Practices, GLP). Po wykonaniu testu należy dokładnie umyć ręce.

6. Nie pipetować ustami.

7. W pomieszczeniach, w których dokonywane są badania na próbkach lub odczynnikach z zestawu nie wolno palić tytoniu, pić napojów ani spożywać posiłków.

8. Unikać rozpryskiwania próbek lub roztworów.

9. Wycieki biologiczne niezawierające kwasu należy dokładnie zetrzeć skutecznym środkiem dezynfekującym. Nadającymi się do użycia środkami dezynfekującymi są między innymi: rozcieńczony do 10% wybielacz (0,5% roztwór podchlorynu sodu), etanol 70% lub 0,5% Wescodyne Plus™. Materiały użyte do wycierania wycieku mogą wymagać usuwania jako odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.

OSTROŻNIE: Nie umieszczać w autoklawie roztworów zawierających wybielacz.

10. Wycieki zawierające kwas należy odpowiednio usunąć (wytrzeć) lub zobojętnić wodorowęglanem sodu, a miejsce wycieku spłukać i wytrzeć do sucha; jeśli wyciek zawiera materiał stanowiący zagrożenie biologiczne, miejsce wycieku wytrzeć jednym z chemicznych środków dezynfekcyjnych.

11. Wszystkie próbki i materiał użyte do przeprowadzenia testu utylizować jak materiał potencjalnie zakaźny. Wszelkie chemiczne odpady laboratoryjne i odpady stwarzające zagrożenie biologiczne należy traktować i utylizować zgodnie z wszystkimi obowiązującymi przepisami.

12. Zalecenia dotyczące zagrożeń i środków ostrożności związanych z substancjami chemicznymi znajdującymi się w tym zestawie testowym można znaleźć na piktogramach zamieszczonych na etykietach oraz w informacjach zamieszczonych na końcu niniejszej instrukcji obsługi. Karta charakterystyki substancji jest na stronie www.bio-rad.com.

7- ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DLA UŻYTKOWNIKÓW

1. ZAMROŻONE PRÓBKI SUROWICY LUB OSOCZA PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ FAŁSZYWE WYNIKI DODATNIE Z POWODU SKAŻENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI.

2. Nie używać zestawów ani odczynników z zestawów po upływie terminu ważności.

3. Nie mieszać odczynników z innych zestawów, które mają różne numery partii, z wyjątkiem roztworu do mycia (R2, oznakowanie*: 20x kolor zielony), chromogen (R9, oznakowanie*: TMB kolor turkusowym) i roztwór przerywający reakcje (R10, oznakowanie*: 1N kolor czerwony), pod warunkiem, że te odczynniki są ściśle równoważne i że ten sam numer partii jest używany w danym przebiegu testu.

UWAGA: W przypadku roztworu do mycia (R2, oznakowanie na etykiecie: 20x kolor zielony), chromogenu (R9, oznakowanie na etykiecie*: TMB kolor turkusowym) i roztworu przerywającego reakcje (R10, oznakowanie na etykiecie*: 1N kolor czerwony) możliwe jest użycie odczynników innych niż te zawarte w zestawie, pod warunkiem, że te odczynniki są stosowane w ramach danego przebiegu testu i ten sam numer partii odczynnika jest używany w serii oznaczeń.

UWAGA: Roztwór do mycia (R2. oznakowanie*: 20X kolor zielony) nie może być mieszany z roztworem do mycia (R2, oznakowanie*: 10X kolor niebieski) dostarczane w zestawach odczynników Bio-Rad.

* na etykiecie fiolki

4. Co najmniej 30 minut przed użyciem odczekać, aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową (od +18 do +30°C).

5. Używać szklanych naczyń, dokładnie umytych i opłukanych wodą destylowaną. Rekomendowana jest praca z naczyniami jednorazowego użytku.

6. Sprawdzić pipety i inny sprzęt pod kątem dokładności i poprawności działania.

7. Ostrożnie przygotować lub rozcieńczyć odczynnik R2, unikając zanieczyszczenia.

8. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na metale lub jony metali. Nie dopuścić do kontaktu metalowych elementów z różnymi roztworami zawierającymi koniugaty lub roztworami substratów.

9. Do ręcznego pipetowania roztworów kalibracyjnych, kontroli i próbek, należy używać osobnych końcówek pipet, aby zapobiec przenoszeniu próbek.

10. Aby zapewnić odpowiednie umycie dołków należy wykonać zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że każdy z dołków jest całkowicie napełniany, a następnie całkowicie opróżniany. Płukanie musi być wykonywane z użyciem płuczki mikropłytek.

11. Nie dopuścić do wyschnięcia mikropłytki między zakończeniem mycia, a dodaniem odczynników.

12. Nie używać tego samego pojemnika do dawkowania koniugatu i substratu.

13. Podczas przechowywania lub inkubacji unikać wystawiania roztworu chromogenu TMB na działanie silnego światła. Nie dopuścić do kontaktu roztworu chromogenu z czynnikiem utleniającym.

14. Roztwór chromogenu (R9) musi być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiej barwy oznacza, że odczynnika nie należy używać i należy go wyrzucić.

15. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu przerywającego reakcję z czynnikami utleniającymi, metalami lub jonami metali.

16. Nie zwracać nadmiaru niezużytego koniugatu do oryginalnego pojemnika.

(4)

8- PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW Mikropłytka (R1)

Każda tacka nośnika płytki z 12 paskami zapakowana jest w oddzielną torebkę. Przeciąć torebkę nożyczkami, tuż pod szczelnym zamknięciem. Otworzyć torebkę i wyjąć tackę nośnika płytki. Ponownie umieścić w oryginalnej torebce tackę nośnika płytki zawierającą nieużywane paski. Ostrożnie szczelnie zamknąć torebkę i odstawić w temperaturę do + 2-8°C.

Po otwarciu zamkniętej próżniowo torebki paski mikrodołków są stabilne przez 8 tygodni przy przechowywaniu w temperaturze + 2-8°C w szczelnie zamkniętejoryginalnej torebce wraz z umieszczonym wewnątrz środkiem suszącym.

Roztwór do mycia (R2)

Przygotować roztwór do mycia, dwudziestokrotnie rozcieńczając stężony roztwór wodą destylowaną: 50 ml roztworu do mycia R2 w 950 ml destylowanej wody. Użyć 400 ml roboczego roztworu do mycia jednej kompletnej 12-paskowej mikropłytki, z wyłączeniem objętości martwej z powodu użytego sprzętu). Roboczy roztwór do mycia można przechowywać przez 14 dni w temperaturze +2-30°C.

Po otwarciu stężonego roztworu do mycia przechowywanego w temperaturze +2-30°C, zachowuje on trwałość do terminu ważności umieszczonego na etykiecie (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń).

Roztwór kalibracyjny 0 (R3), roztwór kalibracyjny 62,5 (R4a), roztwór kalibracyjny 125 (R4b), roztwór kalibracyjny 250 (R4c), roztwór kalibracyjny 500 (R4d):

Roztwory kalibracyjne są gotowe do użycia.

Po otwarciu, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8°C zachowują trwałość przez 8 tygodni (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń).

Kontrola ujemna (R0), kontrola dodatnia (R5):

Kontrola ujemna (R0) i kontrola dodatnia (R5) muszą być poddawane obróbce cieplnej z EDTA w roztworze kwasu (R7), tak jak próbki od pacjentów, aby była możliwa kontrola etapu ogrzewania.

Po otwarciu, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8°C zachowują trwałość przez 8 tygodni (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń).

Koniugat (R6), roztwór do obróbki próbki (R7), roztwór chromogenu TMB (R9):

Odczynniki są gotowe do użycia.

Po otwarciu, te odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8°C zachowują trwałość przez 8 tygodni (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń).

Roztwór przerywający reakcję enzymatyczną (R10):

Odczynnik jest gotowy do użycia.

Po otwarciu ten odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8°C, zachowuje trwałość do terminu ważności umieszczonego na etykiecie (pod warunkiem nieobecności zanieczyszczeń).

9- PRÓBKI

1. Test wykonywany jest na próbkach surowicy lub osocza pobranych na EDTA, antykoagulantach heparyny sodu lub cytrynianu sodu .

2. Przy obróbce cieplnej, przetwarzaniu i przechowywaniu próbek krwi należy stosować się do poniższych wskazówek:

– Próbkę krwi pobrać zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.

– Przed odwirowaniem surowicy odczekać do pełnego uformowania się skrzepu wszystkich próbek.

– Zawsze utrzymywać szczelnie zamknięte probówki.

– Po odwirowaniu oddzielić surowicę lub osocze i umieścić w szczelnie zamkniętej probówce.

– Próbki można przechowywać w temperaturze +2-8°C, jeśli w ciągu 5 dni zostanie wykonane badanie przesiewowe.

– Jeśli testu nie można wykonać w ciągu 5 dni, zamrozić próbki w temperaturze -20°C (lub w temperaturze -80°C).

– Próbki surowicy lub osocza mogą być poddane najwyżej 5 cyklom zamrażania/rozmrażania. Wcześniej zamrożone próbki należy dokładnie wymieszać po rozmrożeniu przed badaniem.

3. Na wyniki testu nie ma wpływu obecność w próbce 60 g/l ludzkiej albuminy lub 120 g/l całkowitego białka, bądź 200 mg/l niezwiązanej bilirubiny albo 200 mg/l związanej bilirubiny, próbki lipemiczne na poziomie zawartości równoważnika trioleiny (trójglicerydu) 30 g/l lub 5 mg/l cholesterolu bądź hemolizowanie próbki na poziomie zawartości hemoglobiny 2 g/l.

4. Nie podgrzewać surowicy ani osocza.

10- PROCEDURA OZNACZANIA Materiały dostarczone

Patrz część ODCZYNNIKI.

Wymagane materiały, które nie wchodzą w skład zestawu

1. Woda sterylna destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania stężonego roztworu do mycia.

2. Bibuła chłonna.

3. Rękawiczki jednorazowe.

4. Gogle lub okulary ochronne.

5. Podchloryn sodu (domowy wybielacz) i wodorowęglan sodu.

6. Pipety lub pipety wielokanałowe bądź automatyczne albo półautomatyczne, regulowane lub wstępnie ustawione pipety bądź pipety wielokanałowe do pomiaru i dozowania 10 μl do 1000 μl i 1 ml, 2 ml oraz 10 ml.

(5)

7. Probówki z polipropylenu 1,5 do mikrowirówek, szczelne zatyczki, odporne na ogrzewanie do 120°C (blok grzejny) lub do 100°C (wrząca łaźnia wodna).

- Probówki z nakrętkami: probówki stożkowe 1,5 ml, nr kat. Bio-Rad 224-0010 lub równoważne.

LUB

- Probówki z nasadkami: probówki EZ Micro Test, 1.5 ml, nr kat. Bio-Rad 223-9480 lub równoważne.

8. Zatyczki do mikroprobówek (VWR nr kat. 6054001 lub równoważne). Zatyczki bezpiecznie uszczelniają probówki, uniemożliwiając ich otwarcie podczas zmian temperatury lub ciśnienia. Niewielki uchwyt ułatwia wyjmowanie mikroprobówek z bloku grzejnego lub wrzącej łaźni wodnej, co pozwala uniknąć ryzyka poparzenia.

9. Stołowa wirówka laboratoryjna na polipropylenowe probówki 1,5 ml, osiągająca prędkość wirowania do 10 000 g.

10. Jeśli do obróbki surowicy używany jest blok grzejny:

• Blok grzejny. Zaleca się poniższe modele bloków grzejnych:

– model jednoblokowy: Grant nr kat. QBD1 (VWR nr kat. 460-0074) – model dwublokowy: Grant nr kat. QBD2 (VWR nr kat. 460-0076)

• Blok dla bloków grzejnych: oba bloki grzejne (QBD1, QBD2) muszą być używane z blokiem Grant, nr kat. QB-E1 (VWR, nr kat. 460-8517).

Jeśli do obróbki serum używana jest wrząca łaźnia wodna:

– ruchomy wieszak mikrowirówki

– wrząca łaźnia wodna, której temperaturę można ustawić termostatem na 100°C.

11. Probówki miarowe o pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml.

12. Pojemnik na odpady biologicznie niebezpieczne.

13. Mieszadło Vortex.

14. Inkubator do mikropłytek, którego temperaturę można ustawić termostatem na 37°C ± 1°C (*).

15. Automatyczna lub półautomatyczna myjka mikropłytek (*).

16. Czytnik mikropłytek z filtrami 450 nm i 620 nm (*).

(*) Udzielamy szczegółowych informacji na temat sprzętu zalecanego przez nasz dział usług technicznych.

Przygotowanie próbek

Kontrola ujemna (R0) i kontrola dodatnia (R5) muszą być poddane obróbce w tym samym czasie co wszystkie próbki pacjenta przez dodanie 100 µl roztworu do obróbki próbki (R7). Roztworów kalibracyjnych R3, R4a, R4b, R4c i R4d, które są gotowe do użycia, nie wolno poddawać tej obróbce.

1. Pipetą pobrać 300 µl każdej próbki pacjenta, kontroli ujemnej (R0) oraz kontroli dodatniej (R5) do poszczególnych polipropylenowych probówek 1,5 ml.

2. Do każdej probówki dodać 100 µl roztworu do obróbki próbki (R7).

3. Energiczne mieszając lub wirując, dokładnie wymieszać. Szczelnie zamknąć probówki, aby nie doszło do ich otwarcia podczas podgrzewania. Nie przekłuwać zatyczki.

4. Opcja z zastosowaniem bloku grzejnego:

Przez 6 minut podgrzewać probówki w bloku grzejnym w temperaturze 120°C. Probówki muszą być umieszczone w bloku tylko po osiągnięciu przez niego zadanej temperatury. (*)

LUB

Opcja z zastosowaniem wrzącej łaźni wodnej:

W przypadku korzystania z wrzącej łaźni wodnej: podgrzewać probówki przez 3 minuty w temperaturze 100°C. (*) Probówki muszą być umieszczone w bloku tylko po osiągnięciu przez niego zadanej temperatury.

5. Ostrożnie wyjąć gorące probówki z bloku grzejnego lub wrzącej łaźni wodnej i umieścić w wirówce. Wirować z prędkością 10 0000 g przez 10 minut.

6. Supernatant stosuje się do wykrywania antygenu mannanowego. Przetestować supernatant, stosując następującą procedurę. Test należy wykonać w ciągu dwóch godzin po obróbce cieplnej surowicy lub osocza.

(*) Ścisłe przestrzeganie zalecanej temperatury i wyznaczonego czasu obróbki, jak również stosowanie zalecanych materiałów są niezbędne dla przeprowadzenia udanego testu. Nie polegać na temperaturze wyświetlanej przez urządzenie, ale sprawdzić, czy temperatura jest zgodna ze specyfikacją, stosując skalibrowany czujnik temperatury, który będzie dopasowany do probówki zawierającej olej mineralny: temperatura 120°C, musi zostać osiągnięta wewnątrz probówki w bloku grzejnym i 100°C we wrzącej łaźni wodnej.

UWAGA:

• Wszystkie próbki poddane obróbce zgodnie z tą procedurą można stosować w teściePlatelia™AspergillusAg, ponieważ procedury obróbki próbek są identyczne w obu testach.

• Nie przechowywać próbek (kontrola ujemna, kontrola dodatnia i próbki pacjenta) po obróbce cieplnej.

Procedura wykonywania testu immunoenzymatycznego (EIA) Ściśle przestrzegać proponowanego protokołu wykonywania testu.

Przestrzegać zasad dobrych praktyk laboratoryjnych.

• Co najmniej 30 minut przed użyciem odczekać, aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową (od 18 do 30°C).

• Podczas każdego przebiegu celem zweryfikowania wyników testu należy stosować wszystkie roztwory kalibracyjne, kontrolę ujemną i dodatnią.

Postępować zgodnie z poniższymi punktami:

1. Przygotować tabelę identyfikacji roztworów kalibracyjnych, kontroli ujemnej, kontroli dodatniej i próbek pacjentów według następującego planu:

• A1: Kontrola dodatnia R5 (supernatant obrabianej kontroli)

• B1: Roztwór kalibracyjny 500 pg/ml (R4d)

(6)

• C1: Roztwór kalibracyjny 250 pg/ml (R4c)

• D1: Roztwór kalibracyjny 125 pg/ml (R4b)

• E1: Roztwór kalibracyjny 62,5 pg/ml (R4a)

• F1: Roztwór kalibracyjny 0 pg/ml (R3)

• G1: Kontrola ujemna R0 (supernatant obrabianej kontroli)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R5 S2 S10

B R4d S3 S11

C R4c S4

D R4b S5

E R4a S6

F R3 S7

G R0 S8

H S1 S9

2. Wyjąć uchwyt płytki i paski mikrodołków (R1) z etui ochronnego. Do etui włożyć z powrotem wszystkie paski, które nie będą używane, wraz ze środkiem osuszającym i ponownie dokładnie zamknąć etui.

3. Odmierzyć pipetą100 µlsupernatantu obrabianej próbki pacjenta i dawkować 100 µl supernatantu obrabianych kontroli R0 i R5 do odpowiednich dołków.

4. Następnie pipetą odmierzyć i dawkować 100 µl

R4d, R4c, R4b, R4a i R3 zgodnie z sekwencją płytki.

UWAGA: Na tym etapie można kontrolować rozkład zakresu roztworów kalibracyjnych: odpowiednie dołki pokazują odcienie kolorów od pomarańczowego (R4d) do jasnożółtego (R3).

5. Przed użyciem wymieszać zawartość fiolki R6 przez jej odwracanie. Jeśli używana jest pipeta wielokanałowa, pobrać tylko objętość potrzebną do jednego przebiegu: na każde 2 paski po 8 studzienek konieczne jest 2,5 ml koniugatu.

6. Dodać po 100 µl roztworu koniugatu (R6) do każdego dołka.

7. Przykryć mikropłytkę samoprzylepną folią – cała jej powierzchnia musi być przykryta i wodoszczelna.

8. Natychmiast poddać mikropłytkę inkubacji w temperaturze 37°C (±1°C) w suchym inkubatorze do mikropłytek przez 90 ± 10 minut.

9. Przygotować roboczy roztwór do mycia (patrz część 8).

10. Zdjąć folię samoprzylepną z płytki. Zaaspirować zawartości wszystkich dołków do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne (zawierające podchloryn sodu). Umyć mikropłytkę 5 razy w myjce do mikropłytek (przy użyciu 800 μl roboczego roztworu do mycia). Po ostatnim umyciu odwrócić mikropłytkę do góry dnem i delikatnie opukać nad chłonną bibułą w celu usunięcia pozostałości cieczy.

11. Szybko dodać 200 µl roztworu chromogenu (R9) do każdego dołka, unikając ekspozycji na jasne światło.

12. Inkubować mikropłytkę w temperaturze (+19-25°C), w ciemności, przez 30+/-5 minut. Przy tym etapie inkubacji nie stosować folii samoprzylepnej.

13. Dodać po 100 μl roztworu przerywającego reakcję (R10) do każdego dołka, w tej samej kolejności i w tym samym rytmie, co przy dodawaniu roztworu chromogenu. Dobrze wymieszać.

14. Dokładnie wytrzeć spód każdej płytki.

15. Odczytać gęstość optyczną każdego dołka przy 450 nm (filtr referencyjny: 620 nm). Mikropłytki muszą być odczytane w ciągu 30 minut od dodania roztworu przerywającego reakcję (przed odczytem paski muszą zawsze znajdować się z dala od światła).

16. Przed przepisaniem wyników sprawdzić zgodność pomiędzy wydrukiem czytnika, a planem rozkładu próbek w mikropłytce.

11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WERYFIKOWANIA TESTU)

Przy każdym wykonaniu testu na każdą mikropłytkę należy nanosić roztwory kalibracyjne i kontrole.

Zweryfikowany test musi spełniać następujące kryteria:

Gęstość optyczna (OD):

OD R4a > 0,280 OD R0 < OD R4a

Stosunki gęstości optycznych:

OD R4a /OD R3 > 1,25 OD R4b / OD R4a > 1,15 OD R4c / OD R4b > 1,15 OD R4d / OD R4c > 1,20

Stężenie mannan w kontroli dodatniej R5:

Stężenie R5 musi być równe stężeniu wskazanemu na fiolce ± 30%.

(7)

12- INTERPRETACJA WYNIKÓW Wykreślanie krzywej kalibracyjnej

Krzywą kalibracyjną wyznacza się w oparciu o 5 punktów granicznych dla zakresów stężeń (punktów kalibracyjnych). 0 pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml and 500 pg/ml. Wykreślić krzywą kalibracyjną [OD = funkcja (pg/ml)] poprzez odnotowanie wartości OD dla roztworów kalibracyjnych R3, R4a, R4b, R4c i R4d na osi rzędnych (osi Y), a następnie odpowiadających im stężeń wyrażonych w pg/ml na osi odciętych (osi X).

Wybrać linie łączące poszczególne punkty graniczne dla zakresów stężeń.

Oznaczanie stężenia mannan (pg/ml) w próbkach testowych

Stężenie mannanu podawano jako pg/ml może być ustalane na podstawie krzywej kalibracyjnej dla każdej próbki testowej.

Interpretacja wyników

• Próbki o stężeniu mniejszym niż 62,5 pg/ml(C < 62,5)są uważane za „ujemne” dla antygenu mannanowego.

• Próbki o stężeniu w zakresie od 62,5 do 125 pg/ml (62,6 ≤ C < 125) są uważane za „pośrednie” dla antygenu mannanowego.

• Próbki o stężeniu równym lub większym niż 125 pg/ml(C ≥ 125)są uważane za „dodatnie” dla antygenu mannanowego.

• Punkty graniczne zastosowane do wykreślenia krzywej kalibracyjnej nie pozwalają na dokładne oznaczenia stężeń mannanu powyżej 500 pg/ml.

Aby określić dokładniej stężenia próbek o bardzo wysokim wyniku dodatnim, badanie musi zostać wykonane ponownie po wstępnym rozcieńczeniu do 1/5 supernatantu obrabianej próbki (nowe obrabianie) w roboczym buforze do płukania R2 (patrz część 8).

Stężenie w próbkach o bardzo wysokim wyniku dodatnim zostanie obliczone przez pomnożenie takiego miana przez 5. Wynik

„pośredni” można potwierdzić poprzez pobranie nowej próbki od pacjenta w ciągu kilku tygodni od daty pobrania próbki, która dała wynik pośredni.

13- OGRANICZENIA PROCEDURY

1. Test o wyniku ujemnym nie może wykluczyć rozpoznania inwazyjnej kandydozy ze względu na bardzo niskie stężenie i szybką eliminację antygenu mannanowego podczas zakażenia.

Rozpoznanie inwazyjnej kandydozy można przeprowadzić tylko po uwzględnieniu danych klinicznych, terapeutycznych, radiologicznych, cytologicznych, bezpośrednich mykologicznych i danych serologicznych, przy czym każde z tych kryteriów należy interpretować z ostrożnością.

2. Ujemny wynik testu na obecność antygenu mannanowego należy również interpretować w powiązaniu z wynikami testu na obecność przeciwciał anty-mannanowymi: nawet w przypadku inwazyjnej kandydozy, antygen mannanowy jest trudniejszy do wykrycia u pacjentów z dodatnim wynikiem dla przeciwciał anty-mannanowych (patrz część 15- Skuteczność).

3. Skuteczność wykrywania antygenu mannanowego w surowicy lub osoczu jest związana z częstością testów wykonywanych dla pacjenta. Zaleca się regularne monitorowanie pacjentów z grupy wysokiego ryzyka i badania przesiewowe na obecność przeciwciał anty-mannanowych w celu zwiększenia czułości i wcześniejszego wykrycia dodatnich wyników testów.

4. Podczas badania próbek na obecność antygenu mannanowego należy przestrzegać procedury Platelia™ CandidaAg Plus oraz interpretacji wyników. Użytkownikom zestawów zaleca się – przed przeprowadzeniem testu – dokładne przeczytanie znajdującej się w opakowaniu ulotki. W szczególności, należy dokładnie przestrzegać procedury wykonywania testu dotyczącej pipetowania próbek i odczynników, mycia płytek i terminów oraz etapów inkubacji.

5. Dodanie próbek lub odczynników niezgodnie z zaleceniami procedury może spowodować wynik fałszywie ujemny. Należy rozważyć powtórzenie testów dodatkowych próbek, gdy istnieje kliniczne podejrzenie inwazyjnej kandydozy lub błędów proceduralnych.

6. W przypadku, gdy zawartość jednego dołka zostanie przelana do innego dołka w wyniku niedbałego posługiwania się mikropłytką lub złej techniki pipetowania przy dodawaniu odczynników, może dojść do skażenia dołków z ujemnymi próbkami pacjenta, próbkami pochodzącymi od pacjentów z wynikami dodatnimi.

7. Kryteria skuteczności testu Platelia™CandidaAg Plus nie zostały ocenione z próbki surowicy lub osocza noworodków bądź dzieci.

8. Kryteria skuteczności testu Platelia™CandidaAg Plus nie zostały ustalone dla ręcznego odczytu i/lub wizualnego ustalania wyników.

9. Zgłaszano reakcje krzyżowe u pacjentów otrzymujących wlewy ze środkami zwiększającym objętość osocza zawierającymi hydroksyetyloskrobię (np. Hesteril ^® 6%), stosowane w leczeniu uszkodzeń układu krążenia: hipowolemii, wstrząsu krwotocznego i wstrząsu septycznego.

10. Fałszywie dodatnie wyniki obserwowano w próbkach zawierających stężenie ludzkich gammaglobulin ≥ 60 g/l, a także w niektórych próbkach, które zostały przetestowane i uznane za reaktywne na obecność przeciwciał przeciwko toksoplazmie.

14- SPODZIEWANE WARTOŚCI

Częstość występowania antygenów mannanowych Candida mierzona za pomocą testu Platelia™ Candida Ag Plus oceniono z panelu 613 próbek od 51 pacjentów holenderskich (Ośrodek 1- Holandia), hospitalizowanych w związku z intensywną chemioterapią w leczeniu raka (patologia onkohematologiczna u 49 pacjentów i rak niehametologiczny u 2 pacjentów).

(8)

Spośród 613 próbek, 88 dało wynik dodatni, zaś 51 wynik pośredni, co dało częstość przypadków zakażeń 88/613 = 14,4% [IC 95%: 11,7-17,4%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 139/613 = 22,7 % [IC 95% CI: 19,4-26,2%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie. Spośród 51 poddanych testowi pacjentów, 23 miało co najmniej jedną próbkę o wyniku dodatnim, zaś pięciu miało co najmniej jedną próbkę o wyniku pośrednim przy braku wyników dodatnich, co dało częstość przypadków zakażeń 23/51 = 45,1 % [IC 5%: 31,1-59,7%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 37/51 = 72,6 % [IC 95% CI: 58,3-84,1%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie.

Spośród tych 51 pacjentów, 30 (388 próbek) nie wykazało udokumentowanej inwazyjnej kandydozy. Wśród tych ostatnich, 20 zostało skolonizowanych przez drożdże (12 Candida albicans, 7 Candida albicans związane z innym gatunkiem Candida i 1 skolonizowana przez co najmniej jeden gatunek Candida inny niż albicans). Czterech z tych pacjentów miało objawy kliniczne i dowody mikrobiologiczne powierzchownego zakażenia Candida. Ciężkie uszkodzenie bariery błony śluzowej wystąpiło u 24 pacjentów. Spośród odpowiednich 388 próbek, 41 dało wynik dodatni, zaś 43 wynik pośredni, co dało częstość przypadków zakażeń 41/388 = 10,6 % [IC 95%: 7,7-14,1%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 84/388 = 21,7% [IC 95% CI: 17,7- 26,1%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie. W odniesieniu do pacjentów, spośród 30 poddanych testowi, 10 miało co najmniej jedną próbkę o wyniku dodatnim, zaś pięciu miało co najmniej jedną próbkę o wyniku pośrednim przy braku wyników dodatnich, co dało częstość przypadków zakażeń 10/30 = 33,3 % [IC 5%: 17,3-52,8%] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne i 21/30 = 70,0 % [IC 95% CI: 50,6-85,3%] przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie.

15- CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA A. Badania odtwarzalności

• Dokładność w trakcie przebiegu (powtarzalność):

W celu dokonania oceny powtarzalności w ramach danego testu pięć próbek (dwie ujemne i trzy dodatnie) przetestowano 32 razy w tym samym przebiegu. Oznaczano stężenie każdej próbki i wyrażano w pg/ml.

Stężenie średnie, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (% CV) dla każdej próbki przedstawiono w poniższej tabeli:

Dokładność w trakcie przebiegu (powtarzalność)

N=32 Próbka ujemna

Próbka o wysokim wyniku ujemnym

Próbka o niskim wyniku

dodatnim

Próbka o średnim

wyniku dodatnim

Próbka o wysokim wyniku dodatnim

Średnie stężenie (pg/ml) 25,1 54,8 63,7 154,1 261,8

SD 4,11 5,20 4,27 8,01 16,93

CV % 16,3 % 9,5 % 6,7 % 5,2 % 6,5 %

• Dokładność między przebiegami (powtarzalność):

W celu oceny powtarzalności w ramach danego testu każdą z pięciu próbek (dwie ujemne i trzy dodatnie) przetestowano w dwóch powtórzeniach, w dwóch seriach dziennie, w okresie 20 dni. Oznaczano stężenie każdej próbki, wyrażane w pg/ml.

Stężenie średnie, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (% CV) dla każdej próbki przedstawiono w poniższej tabeli:

Dokładność między przebiegami (powtarzalność):

N=80 Próbka ujemna

Próbka o wysokim wyniku ujemnym

Próbka o niskim wyniku

dodatnim

Próbka o średnim

wyniku dodatnim

Próbka o wysokim wyniku dodatnim

Średnie stężenie (pg/ml) 24,1 55,0 70,0 161,6 264,9

SD 6,99 11,47 14,50 30,07 38,62

CV % 29,0 % 20,8 % 20,7 % 18,6 % 14,6 %

B. Reaktywność krzyżowa

Czynnik patologiczny Liczba

testowanych próbek

Liczba o wyniku dodatnim

Liczba o wyniku pośrednim

Aspergillus 10 0 1

Przeciwciała anty-dsDNA 10 0 0

Dodatnie przeciwciała ANA 10 0 0

Szpiczak (IgG i IgM) 20 0 1

Anty-Toxoplasma IgG 10 3 1

Ludzkie przeciwciała przeciwmysie

10 0 0

Czynnik reumatoidalny 10 0 0

C. Liniowość

Zakres liniowości testu Platelia™ Candida Ag Plus został ustalony w zakresie od 20 do 470 pg/ml z badań wykonanych na rozcieńczeniach 4 próbek dodatnich.

(9)

D. Badania kliniczne

Charakterystykę działania zestawu Platelia™ Candida Ag Plus poddawano ocenie w trzech ośrodkach z wykorzystaniem łącznie 852 próbek pochodzących od 505 pacjentów.

CZUŁOŚĆ

Czułość zestawu Platelia™ Candida Ag Plus została ustalona z panelu 436 próbek od 89 pacjentów hospitalizowanych w 2 ośrodkach (w Holandii, we Francji). Dystrybucja próbek:

• Ośrodek 1 (Holandia): 225 próbek pobranych od 21 pacjentów holenderskich zakwalifikowanych do leczenia nowotworowej choroby krwi w oddziale onkohematologicznym (19 przypadków) lub niedrobnokomórkowego raka (2 przypadki) z zastosowaniem intensywnej chemioterapii, a następnie, w razie potrzeby, przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych. U wszystkich tych pacjentów wystąpiła inwazyjna kandydoza mikrobiologicznie udowodniona na podstawie co najmniej jednej kultury dającej wynik dodatni dla Candida (z hodowli krwi lub z hodowli jałowej próbki tkanki). ¹⁷

• Ośrodek 2 (Francja): 211 próbek pobranych od 68 pacjentów francuskich, hospitalizowanych na różnych francuskich oddziałach intensywnej opieki medycznej lub onkohematologicznych w związku z inwazyjną kandydozą mikrobiologicznie udowodnioną na podstawie co najmniej jednej hodowli z krwi, która dala wynik dodatni dla Candida spp.

UWAGA: Panele próbki użyte w tych dwóch badaniach pochodzą od pacjentów, których próbki krwi zebrano w latach 1999 i 2007. Względna stabilność antygenu mannanowego i przeciwciał anty-mannanowych w tych próbkach w okresie mrożenia, a także po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania, sprawiają, że wyniki zależą od warunków przechowywania testowanego panelu. Wartości czułości testu wskazały, że prowadzenie retrospektywnych badań klinicznych może dawać niższe wyniki niż wartości uzyskane podczas prowadzenia prospektywnych badań klinicznych przy użyciu próbek pobranych niedawno.

Wyniki uzyskane w Ośrodku 1

21 pacjentów holenderskich przyjęto do szpitala na leczenie nowotworów krwi (ostra białaczka szpikowa, ostra białaczka limfatyczna, przewlekła białaczka limfatyczna, szpiczak mnogi, zespół mielodysplastyczny, niedokrwistość aplastyczna, i chłoniak nieziarniczy) lub niedrobnokomórkowego raka hematologicznego z zastosowaniem intensywnej chemioterapii, a następnie w razie potrzeby, przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych. U tych 21 pacjentów wystąpiła inwazyjna kandydoza mikrobiologicznie udowodniona na podstawie co najmniej jednej kultury dającej wynik dodatni dla Candida (z hodowli z krwi lub z hodowli jałowej próbki tkanki). Status tych pacjentów w związku z obecnością antygenu mannanowego Candida, wykrytego w teście Platelia™ Candida Ag Plus jest uznawany za dodatni, jeśli co najmniej jedna z próbek pobranych od tych pacjentów daje wynik dodatni. W przypadku braku próbek dających wynik dodatni, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała wynik pośredni oraz za ujemny, gdy wszystkie próbki pochodzące od pacjenta dawały wynik ujemny.¹⁷

Obok testu Platelia™ Candida Ag Plus te same próbki badano na obecność przeciwciał anty-mannanowych z zastosowaniem zestawu Platelia™ Candida Ab Plus^9. Status pacjentów w związku z obecnością antygenu mannanowego Candida lub przeciwciał przeciwko Candida jest uznawany za dodatni, jeśli co najmniej wyniki jednego lub dwu testów są dodatnie. W przypadku braku testu dającego wynik dodatni, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jeden lub dwa testy dają wynik pośredni oraz za ujemny, gdy te dwa testy dają wynik ujemny.

Kategorie pacjentów

Wyniki testu Platelia™ Candida Ag Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość

(pośrednie uważane za ujemne)

Czułość (pośrednie

uważane za dodatnie) dodatnie pośrednie ujemne

21 pacjentów (225 próbek), których co najmniej jedna

hodowla dała wynik dodatni dla Candidaspp. 13 (47) 3 (8) 5 (170)

61,9 % 95 % KI [38,4-81,9 %]

76,2 % 95 % KI [52,8-91,8 %]

Połączone wyniki Platelia™CandidaAg Plus i Platelia™Candida Ab Plus

Liczba pacjentów (liczba próbek)

uważane za ujemne)

21 pacjentów (225 próbek), których co najmniej jedna

hodowla dała wynik dodatni dla Candida spp. 15 (98) 4 (34) 2 (93)

71,4 % 95 % KI [47,8-88,7 %]

90,5 % 95 % KI [69,6-98,8 %]

(10)

Wyniki uzyskane w Ośrodku 2

68 francuskich pacjentów przyjęto na różne oddziały intensywnej opieki medycznej (chirurgia, przeszczepy, oparzenia, urazy, pneumonologia, itd.) lub onkohematologii (nowotworowa choroba krwi). U każdego z nich wystąpiła inwazyjna kandydoza, mikrobiologicznie udowodniona na podstawie co najmniej jednej hodowli krwi, która dała wynik dodatni dlaCandida(C.albicans, C.parapsilosis, C.norvegensis, C.glabrata, C.krusei lub C

.

tropicalis)^{6, 7, 14} w dniach przed lub po pobraniu badanych próbek.

Próbki krwi zbierano 6 dni (średnio) po pierwszej hodowli krwi, która dała wynik dodatni dla Candida (co najmniej 61 dni wcześniej, maksymalnie 67 dni później). Status tych pacjentów w związku z obecnością antygenu mannanowego Candida jest uznawany za dodatni, jeśli co najmniej jedna z próbek pobranych od pacjentów daje wynik dodatni. W przypadku braku próbek dających wynik dodatni, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jedna z próbek pochodzących od pacjenta dawała wynik pośredni oraz za ujemny, gdy wszystkie próbki dawały wynik ujemny.

Wyniki testu Platelia™ Candida Ag Plus Liczba pacjentów

(liczba próbek)

uważane za ujemne)

68 pacjentów (211 próbek), których co najmniej jedna hodowla krwi dała wynik dodatni dla Candida

spp.

35 (86) 7 (14) 26 (111)

51,5 % 95 % KI [39,0-63,8 %]

61,8 % 95 % KI [49,2-73,3 %]

- w tym 34 dla C. albicans (113 próbek) 22 (55) 6 (12) 6 (46)

64,7 % 95 % KI [46,5-80,3 %]

82,5 % 95 % KI [65,5-93,2 %]

- w tym 15 dla C. parapsilosis (37 próbek) 2 (3) 1 (1) 12 (33)

13,3 % 95 % KI [1,7-40,5 %]

20,0 % 95 % KI [4,3-48,1 %]

- w tym 12 dla C. glabrata (32 próbki) 7 (13) 0 (0) 5 (19)

58,3 % 95 % KI [27,7-84,8 %]

66,7 % 95 % KI [34,9-90,1 %]

- w tym 4 dla C. tropicalis (19 próbek) 4 (15) 0 (1) 0 (3) 100,0 % * 100,0 % *

- w tym 2 dla C. krusei (8 próbek) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % *

- w tym 1 dla C. norvegensis (2 próbki) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % *

*: Nie obliczono przedziału ufności 95% z powodu niewystarczającej wielkości próby.

Obok testu Platelia™ Candida Ag Plus te same próbki badano na obecność przeciwciał anty-mannanowych z zastosowaniem zestawu Platelia™ Candida Ab Plus⁹. Status pacjentów w związku z obecnością antygenu mannanowego Candida lub przeciwciał przeciwko Candida jest uznawany za dodatni, jeśli co najmniej wyniki jednego lub dwu testów są dodatnie. W przypadku braku testu dającego wynik dodatni, status uznawano za pośredni, kiedy co najmniej jeden lub dwa testy dają wynik pośredni oraz za ujemny, gdy te dwa testy dają wynik ujemny.

Połączone wyniki Platelia™ Candida Ag Plus i Platelia™

i Platelia™ Candida Ab Plus Liczba pacjentów

(liczba próbek)

uważane za ujemne)

68 pacjentów (211 próbek), których co najmniej jedna hodowla krwi dała wynik dodatni dla Candida

spp.

48 (122) 8 (40) 12 (49)

70,6 % 95 % KI [58,3-81.,0 %]

82,4 % 95 % KI [71,2-90,5 %]

- w tym 34 dla C. albicans (113 próbek) 28 (74) 2 (22) 4 (17)

82,4 % 95 % KI [65,5-93,2 %]

88,2 % 95 % KI [72,6-96,7 %]

- w tym 15 dla C. parapsilosis (37 próbek) 5 (7) 6 (15) 4 (15)

33,3 % 95 % KI [11,8-61,6 %]

73,3 % 95 % KI [44,9-92,2 %]

- w tym 12 dla C. glabrata (32 próbki) 11 (24) 0 (3) 1 (5)

91,7 % 95 % KI [61,5-99,8 %]

- w tym 4 dla C. tropicalis (19 próbek) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0 % * 100,0 % *

- w tym 2 dla C. krusei (8 próbek) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % *

- w tym 1 dla C. norvegensis (2 próbki) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % *

*: Nie obliczono przedziału ufności 95% z powodu niewystarczającej wielkości próby.

(11)

SWOISTOŚĆ

Swoistość została określona z panelu 416 próbek z 2 ośrodków francuskich, rozkład próbek jest następujący:

• Ośrodek 1: 200 próbek od 200 francuskich pacjentek monitorowanych pod kątem serologii toksoplazmozy w okresie ciąży i bez klinicznych objawów zakażenia Candida.

• Ośrodek 2: 219 próbek od 216 francuskich pacjentów dawców krwi.

Wyniki testu Platelia™ Candida Ag Plus Liczba pacjentów

(liczba próbek)

Specyficzność (pośrednie uważane za

dodatnie)

Specyficzność (pośrednie uważane za

ujemne) dodatnie pośrednie ujemne

200 kobiet w ciąży (200 próbek) monitorowanych

pod kątem serologii toksoplazmozy 3 2 195

97,5 % 95 % KI [94,3-99,2 %]

98,5 % 95 % KI [95,7-99,7 %]

216 dawców krwi (216 próbek) 1 1 214

99,1 % 95 % KI [96,7-99,9 %]

99,5 % 95 % KI [97,5-100 %]

16 – KONTROLA JAKOŚCI WYTWÓRCY

Wszystkie produkowane odczynniki wytwarzane są zgodnie z naszym Systemem Jakości, począwszy od etapu odbioru surowców, aż do etapu wprowadzenia gotowego produktu na rynek. Każda partia jest poddawana kontroli jakości i zwalniana do wprowadzenia na rynek po spełnieniu określonych z góry kryteriów dopuszczenia. Firma Bio-Rad przechowuje dokumentację produkcyjną i kontrolną każdej wyprodukowanej partii.

17- MATERIAŁY ŹRÓDŁOWE

1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)- beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species specific snPCR in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p. 1-9.

2- Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag, D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7–14.

3- Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p.

65-84.

4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615.

5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M., Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55–62.

6- Nucci, M., Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p.

77–82.

7- Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia™ Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397.

8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F., Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503–535.

9- Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455–460.

10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95–101.

11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781–788.

12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443–

451.

13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433–442.

14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D. 2003.

Contribution of the Platelia™ Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalisinfection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p. 4551–4558.

15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p.

317–322.

(12)

16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia:

incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15 p.

289–292.

17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386.

(13)

(14)

Bio-Rad

3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette – Francja

Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11

Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 881122

www.bio-rad.com