• Nie Znaleziono Wyników

Detection of HPV by polymerase chain reaction (PCR) in paraffin embedded cervical cancer tissue

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Detection of HPV by polymerase chain reaction (PCR) in paraffin embedded cervical cancer tissue"

Copied!
4
0
0

Pełen tekst

(1)

P

PRRZZEEGGL¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 44//22000033 36

W

Wyyk krryyw wa an niiee H HP PV V tteecch hn niik k¹ ¹ rreea ak kccjjii

³³a añ ñccu ucch ho ow weejj p po olliim meerra azzyy ((P PC CR R)) w

w u uttrrw wa allo on nyycch h w w p pa arra affiin niiee ttk ka an nk ka acch h rra ak ka a sszzyyjjk kii m ma acciiccyy

D

Deetteeccttiioonn ooff H HP PV V bbyy ppoollyym meerraassee cchhaaiinn rreeaaccttiioonn ((P PC CR R)) iinn ppaarraaffffiinn eem mbbeeddddeedd cceerrvviiccaall ccaanncceerr ttiissssuuee

A

Aggnniieesszzkkaa OOllsszzaakk,, BBeeaattaa SSmmoollaarrzz,, EEll¿¿bbiieettaa KKoozz³³oowwsskkaa,, AAnnddrrzzeejj KKuulliigg

Cel. Badania epidemiologiczne wskazuj¹, ¿e infekcja ró¿nymi typami wirusa HPV (Hu- man Papillomavirus) jest czynnikiem ryzyka dla rozwoju raka szyjki macicy.

Materia³y i metody. W obecnej pracy analizowano obecnoœæ wirusa HPV wysokiego i ni- skiego ryzyka u chorych na raka szyjki macicy. Materia³ do badañ stanowi³y utrwalone w pa- rafinie tkanki uzyskane od 22 kobiet z rakiem szyjki macicy. Obecnoœæ wirusa HPV okreœla- no przy u¿yciu metody PCR z zastosowaniem odpowiednio dobranych starterów.

Wyniki. Wirus HPV wysokiego ryzyka zosta³ wykryty w 82% (18/22) przypadków raka szyjki macicy, natomiast wirus niskiego ryzyka w grupie 18% chorych na ten nowotwór (4/22). Liczba przypadków wirusa wysokiego ryzyka by³a statystycznie znacz¹co wy¿sza ni¿

niskiego ryzyka (P<0,05).

Wniosek. Metoda PCR jest szybk¹ i czu³¹ technik¹ wykrywania HPV w próbkach uzyska- nych od chorych na raka szyjki macicy.

S³owa kluczowe: HPV, rak szyjki macicy, PCR

(Przegl¹d Menopauzalny 2003; 4:36–39)

W Wssttêêp p

Rak szyjki macicy zaliczany jest na œwiecie do jednej z piêciu najczêstszych przyczyn zgonów kobiet z choro- b¹ nowotworow¹. Jednym z wa¿nych czynników w jego rozwoju, a tak¿e w rozwoju dysplazji, jest zaka¿enie wi- rusem papilloma typu ludzkiego (Human Papillomavi- rus – HPV) [1, 2]. Ludzki wirus brodawczaka nale¿y do rodziny Papovaviridae. Rodzina ta obejmuje 2 rodzaje Papillomavirus i Polyomavirus [3, 4]. Cech¹ tej rodziny

jest obecnoœæ podwójnej kolistej nici DNA. Zaka¿enie wirusem z rodziny Papovaviridae prowadzi do zniszcze- nia komórki, ale mo¿e tak¿e dojœæ do ci¹g³ego zaka¿enia prowadz¹cego do transformacji komórek oraz rozwoju procesu nowotworowego. W ³agodnych formach nowo- tworów szyjki macicy DNA wirusa HPV wystêpuje naj- czêœciej w postaci wolnej, niezintegrowanej z genomem komórki, kolistej formy okreœlanej jako episom. Jednak w du¿ym odsetku raków szyjki DNA wirusa jest zinte- growany z genomem gospodarza.

P

Prraaccoowwnniiaa BBiioollooggiiii MMoolleekkuullaarrnneejj,, ZZaakk³³aadd PPaattoommoorrffoollooggiiii KKlliinniicczznneejj,, IInnssttyyttuutt CCeennttrruumm ZZddrroowwiiaa MMaattkkii P

Poollkkii,, kkiieerroowwnniikk:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. AAnnddrrzzeejj KKuulliigg

(2)

P

PRRZZEEGGL¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 44//22000033 37 Komórkami docelowymi dla wirusów HPV s¹ ko-

mórki warstw rozrodczych skóry i b³on œluzowych. Kli- nicznym efektem zaka¿enia s¹ brodawki skóry, b³on œluzowych: jamy ustnej, dróg oddechowych, narz¹dów p³ciowych i uk³adu moczowego [5, 6]. Wœród wirusów infekuj¹cych b³ony œluzowe uk³adu moczowo-p³ciowe- go wyodrêbniono ok. 40 typów, wykazuj¹cych zwi¹zek z ró¿nego rodzaju zmianami w obrêbie narz¹dów p³cio- wych kobiet [7]. W zale¿noœci od stopnia zagro¿enia rozwojem choroby nowotworowej wyró¿niono 3 grupy ryzyka z najczêœciej wystêpuj¹cymi typami HPV.

Pierwsza z nich to grupa niskiego ryzyka onkologiczne- go. Nale¿¹ do niej HPV: 6, 11, 42, 43, 44. DNA tych ty- pów wykrywany jest najczêœciej w ³agodnych zmianach rozrostowych, jak condylomata acuminata. Druga gru- pa to grupa œredniego ryzyka onkologicznego z typami HPV: 31, 33, 35, 39, 51, 52 i 58. Ich obecnoœæ zwi¹za- na jest z dysplazjami ma³ego i œredniego stopnia. Ostat- ni¹ grup¹ jest grupa wysokiego ryzyka onkologicznego.

Zalicza siê do niej typy HPV: 16, 18, 45 i 56, okreœlane mianem typów onkogennych. Ich DNA jest najczêœciej wykrywany w zaawansowanych zmianach nowotworo- wych w obrêbie szyjki macicy [8, 9].

Wykrywanie HPV sta³o siê mo¿liwe dopiero po wprowadzeniu metod stosowanych w biologii moleku- larnej a zw³aszcza techniki reakcji ³añcuchowej poli- merazy (PCR). Metoda PCR (ang. polymerase chain reaction) nale¿y w chwili obecnej do technik najczê- œciej stosowanych w biologii molekularnej. Technika PCR umo¿liwi³a gwa³towny rozwój diagnostyki mole- kularnej ostatnich 10 lat. Dokona³a ona prze³omu w diagnostyce klinicznej dlatego, ¿e nie wymaga sto- sowania radioaktywnych izotopów, a iloœæ uzyskiwa- nego DNA jest wystarczaj¹ca do bezpoœredniej obser- wacji i oceny podczas rozdzia³ów elektroforetycznych.

Wa¿nym atutem metody PCR jest jej czu³oœæ, wydaj- noœæ i specyficznoœæ. Najprostszym zastosowaniem re- akcji PCR w diagnostyce medycznej jest wykazanie obecnoœci lub nieobecnoœci specyficznego fragmentu DNA. Wykazanie obecnoœci lub braku produktu PCR znalaz³o zastosowanie w wykrywaniu delecji powodu- j¹cych wystêpowanie chorób dziedzicznych, np. dys- trofii miêœniowej Duchenne’a lub Beckera, w licznych testach na obecnoœæ wirusa HIV, HPV czy Hepatitis B.

W obecnej pracy technika PCR zosta³a wykorzysta- na w celu szybkiego i precyzyjnego okreœlenia obecno- œci lub braku wirusa HPV, zarówno z grupy wysokie- go, jak i niskiego ryzyka w utrwalonych w parafinie tkankach raka szyjki macicy.

M

Ma atteerriia a³³yy ii m meetto od dyy

II P Paaccjjeennttkkii zz rraakkiieem m sszzyyjjkkii m maacciiccyy

Materia³ do badañ w postaci utrwalonych w parafi- nie wycinków z guza szyjki macicy zosta³ uzyskany od

22 kobiet z rakiem szyjki macicy. Pacjentki mieœci³y siê w przedziale wiekowym od 59 do 82 lat (œrednia wieku ± SD 66,43±6,68 lat).

IIII IIzzoolloow waanniiee D DN NA A

Pierwszy etap procedury obejmowa³ izolowanie ge- nomowego kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), który nastêpnie poddawano amplifikacji w reakcji ³añ- cuchowej polimerazy (PCR).

DNA izolowano ze skrawków parafinowych o gru- boœci 10 µm utrwalonych na szkie³ku.

Materia³ parafinowy:

w usuwano ze szkie³ka i umieszczano w probówce Eppendorfa,

w wytrz¹sano 3-krotnie ksylenem, odwirowuj¹c za ka¿dym razem 3 min na maksymalnych obrotach (8 000 g),

w uzyskany osad przemywano raz 96% alkoholem ety- lowym, równie¿ odwirowuj¹c 3 min,

Z tak uzyskanego materia³u izolowano DNA z za- stosowaniem komercyjnie dostêpnego zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Niemcy). Uzyskany DNA wykorzystywano w reakcji ³añcuchowej poli- merazy.

IIIIII R Reeaakkccjjaa P PC CR R

Reakcja PCR by³a przeprowadzona z wykorzysta- niem komercyjnie dostêpnego zestawu PCR Human Papillomavirus Typing Set (Biokom). W badaniach zo- sta³y zastosowane dwie pary 20 nukleotydowych star- terów, których sekwencje odpowiadaj¹ fragmentom se- kwencji genów wirusowych E6 i E7 HPV. Para pU- 1M/pU-2R pozwala na amplifikacjê DNA HPV z gru- py wysokiego ryzyka onkologicznego (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 51b, 58), natomiast para pU- 31B/pU-2R na amplifikacjê DNA HPV grupy niskiego ryzyka onkologicznego (HPV 6 i 11). Mieszanina reak- cyjna (25 µl) obejmowa³a: 60 ng DNA, 0.2 µM starte- rów, 50 µM dNTP (deoksynukleotydotrifosforany), bu- for 10 x Taq, 1 U polimerazy Taq (Qiagen, Niemcy).

Reakcjê prowadzono w termocyklerze (GeneAmp PCR system 2400; Perkin Elmer, Norwalk, USA).

Etapy reakcji PCR by³y nastêpuj¹ce: wstêpna dena- turacja 94oC – 2 min, w³aœciwe 30 cykli, na które sk³a- da³a siê: denaturacja w 94oC – 1 min, hybrydyzacja ze starterami 55oC – 2 min, wyd³u¿anie 72oC – 2 min, koñcowe wyd³u¿anie 7 min w 72oC.

Analizê produktu prowadzono w 7% ¿elu poliakry- loamidowym (PAGE) i po ok. 2 godz. elektroforezy (napiêcie stosowane 8 V/cm) analizowano po barwie- niu bromkiem etydyny.

Wirus HPV wysokiego ryzyka charakteryzowa³ siê obecnoœci¹ w ¿elu pasma o d³ugoœci 268 pz; wirus HPV niskiego ryzyka pasmem o d³ugoœci 228 pz (ryc. 1.).

(3)

P

PRRZZEEGGL¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 44//22000033 38

IIV V A Annaalliizzaa ssttaattyyssttyycczznnaa

¯aden z parametrów odnosz¹cych siê do materia³u nowotworowego nie podlega³ rozk³adowi normalnemu (test Smirnowa-Kolmogorova) i dlatego dla analizy wyników zastosowano testy nieparametryczne. P< by-

³o traktowane jako wynik statystycznie znacz¹cy.

W Wyyn niik kii

Czêstoœæ wirusa HPV wysokiego i niskiego ryzyka u chorych na raka szyjki macicy zosta³a przedstawiona w tab. I. 18 z 22 próbek rakowych (82%) charakteryzo- wa³o siê obecnoœci¹ DNA wirusa HPV wysokiego ry- zyka, natomiast tylko 4 z 22 przypadków (18%) wyka- zywa³o obecnoœæ DNA wirusa niskiego ryzyka. Obec- noœæ DNA wirusa HPV wysokiego ryzyka w komór- kach rakowych by³a statystycznie znacz¹co wy¿sza ni¿

DNA wirusa HPV niskiego ryzyka (P <0,05).

D

Dyyssk ku ussjja a

W profilaktyce raka szyjki macicy du¿e znaczenie ma nie tylko wczesne wykrywanie zmian, ale tak¿e okreœlenie czynników, maj¹cych najbardziej prawdo-

podobny zwi¹zek etiopatogenetyczny z procesem kan- cerogenezy w obrêbie tego narz¹du. Wykrywaj¹c oso- by zainfekowane wirusem HPV mo¿na okreœliæ grupê wysokiego ryzyka onkologicznego, któr¹ mo¿na na- stêpnie poddaæ œciœlejszej kontroli. Próby oszacowania czêstoœci wystêpowania zaka¿eñ wirusem HPV wœród kobiet z chorob¹ przebiegaj¹c¹ subklinicznie lub w sposób utajony, przynosi ró¿ne wyniki, zale¿nie od badanej populacji i metody stosowanej w celu wykry- cia wirusa. Ludzkie wirusy papilloma nie namna¿aj¹ siê w hodowlach komórkowych, nie opracowano rów- nie¿ do tej pory modelu zaka¿enia zwierz¹t i namno¿e- nia wirusów. W zwi¹zku z trudnoœci¹ uzyskania anty- genu wirusowego w hodowlach in vitro nie mog¹ byæ stosowane standardowe metody serologiczne. Wykry- wanie infekcji HPV sta³o siê wiêc mo¿liwe dopiero po wprowadzeniu metod stosowanych w biologii moleku- larnej. Najwiêkszy odsetek zaka¿eñ rozpoznaje siê sto- suj¹c reakcjê PCR, która charakteryzuje siê najwiêksz¹ czu³oœci¹ z obecnie znanych technik biologii moleku- larnej. Pozwala ona na wykazanie jednej kopii HPV na 105–106komórek.

Technika PCR staje siê obecnie powszechn¹ techni- k¹ diagnostyczn¹, stosowan¹ w wielu laboratoriach.

W celu standaryzacji stosowanej procedury, opracowy- wane s¹ odpowiednie sekwencje starterów. Uzyskiwane na tej podstawie wyniki s¹ porównywalne i pozwalaj¹ w pewnym stopniu unikn¹æ fa³szywej ich interpretacji.

Oprócz tradycyjnej metody PCR niektóre oœrodki badawcze stosuj¹ technikê PCR in situ z udzia³em od- powiednio znakowanych nukleotydów. Metoda PCR in situ charakteryzuje siê bardzo du¿¹ czu³oœci¹ i pozwa- la na precyzyjne wykrycie bardzo ma³ej liczby kopii wirusowego DNA (nawet pojedynczej kopii genu wi- rusowego). Jest to jednak metoda dosyæ kosztowna i wymagaj¹ca specjalistycznej aparatury [10].

Analizê danego typu wirusa HPV prowadzi siê przy zastosowaniu metody PCR-RFLP (PCR-RFLP – restriction fragment length polymorphism – polimor- fizm d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych). Technika PCR-RFLP polega na amplifikacji okreœlonego frag- mentu genu, obejmuj¹cego sekwencjê polimorficzn¹, bêd¹c¹ miejscem ciêcia restrykcyjnego [11]. Po tra- wieniu restryktaz¹ otrzymuje siê ró¿n¹ liczbê frag- mentów restrykcyjnych, o ró¿nej d³ugoœci, zale¿nie od wersji allelu. Do okreœlenia typu wirusa stosuje siê

Tab. I. Czêstoœæ wystêpowania wirusa HPV wysokiego i niskiego ryzyka u chorych na raka szyjki macicy Pacjentki z rakiem szyjki macicy (n = 22)

HPV wysokiego ryzyka HPV niskiego ryzyka

obecnoϾ brak obecnoϾ brak

18 (0,82)a 4 (0,18) 4 (0,18) 18 (0,82)

aP <0,05 w porównaniu z grup¹ niskiego ryzyka

Ryc. 1. Typowy obraz elektroforezy przeprowadzonej w 7% ¿elu poliakryloamidowym. Œcie¿ki 1–3 przedsta- wiaj¹ obraz charakterystyczny dla wirusa HPV niskiego ryzyka, œcie¿ki 4–7 obraz charakterystyczny dla wirusa HPV wysokiego ryzyka, Kn– kontrola pozytywna HPV niskiego ryzyka, Kw– kontrola pozytywna HPV wysokie- go ryzyka, M – marker d³ugoœci par zasad (Sigma, St.

Louis, USA)

M Kn 1 2 3 4 5 6 7 Kw

300 pz 150 pz

50 pz

(4)

P

PRRZZEEGGL¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 44//22000033 39 analizê restrykcyjn¹ z wykorzystaniem czterech endo-

nukleaz restrykcyjnych AvaII, AccI, BglII, RsaI. Ana- liza produktów amplifikacji odbywa siê przy zastoso- waniu techniki elektroforezy w ¿elu poliakryloamido- wym. Iloœciowe oznaczanie kopii genów wirusa HPV prowadzi siê z u¿yciem analizy densytometrycznej, po uprzednim przetworzeniu ¿eli poliakryloamidowych na obraz cyfrowy.

W obecnej pracy podjêto próbê wykrywania wiru- sa HPV w utrwalonych w parafinie tkankach przy za- stosowaniu techniki PCR. Reultaty wskazuj¹, ¿e jest to metoda skuteczna, prosta oraz szybka i z powodze- niem mo¿e byæ stosowana w przypadku materia³u ar- chiwalnego.

Praca powsta³a w ramach grantu uzyskanego z Ko- mitetu Badañ Naukowych nr 3P05C06823.

P

Piiœœmmiieennnniiccttwwoo

1. Bosch FX, Manos MM, Munoz N. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Stu- dy Group. J Natl Cancer Inst, 1995; 87: 796-802.

2. zur Hausen H. Papillomavirus infections – a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta, 1996; 1288: 55-78.

3. Francki RIB, Fauquet CM, Knudson DL., Brown F. Classification and Nomenclature of Viruses.

Arch Virol, 1991; 2: 147.

4. Boubenider S, Hiesse C, Marchand S, et al. Post-transplantation polyomavirus infections. J Nephrol 1999; 12: 24-9.

5. Szkoda T M, Litwiñska B, Kañtoch M. Ludzkie wirusy papilloma: budowa, patogeneza, diagnostyka.

Post Mikrobiol 1995; 1: 187-96.

6. Kañtoch M. Wirusologia lekarska. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1999.

7. Iwasawa A, Nieminen P, Lehtinen M, Paavonen J. Human papillomavirus DNA in uterine cervix squ- amous cell carcinoma and adenocarcinoma detected by polymerase chain reaction. Cancer 1996; 77:

2275-9.

8. Iwasawa A, Nieminen P, Lehtinen M, Paavonen J. Human papillomavirus in squamous cell carcino- ma of the ulva by polymerase chain reaction. Obstet Gynecol 1997; 89: 81-4.

9. Qiu X, Zhao M, Tan Y, et al. The synchronous detection of HPV, H-ras and p53 in cervical carcinoma tissues and distribution of HPV infection between the high incidence area and the common area. Exp On- col 2002; 24: 194-7.

10. Nuovo GJ, MacConnell P, Forde A. Detection of human papilloma virus DNA in formallin-fixed paraf- fin embedded tissues in situ hybridyzation after amplification by polymerase chain reaction. Am J Pathol 1991; 139: 847-54.

11. Massimo L. Polymerase chain reaction – based methods for the detection of mutations in oncogenes and tumor supressor genes. Hum Pathol 1994; 25: 564-71.

Summary

Purpose. Epidemiological studies showed that infections with several types of Human Papillomavirus (HPV) are the main risk factor for the development of cervical carcinoma.

Materials and methods. In the present work the infection of high risk as well as low risk HPV in subjects with cervical cancer were investigated. Paraffin embedded tumour tissues were obtained from 22 women with cervical carcinoma. The HPV appearance was determi- ned by PCR amplification using the appropriate primers.

Results. The high risk HPV was detected in 82% (18/22) of cervical cancer patients and low risk HPV in 18% of cervical cancer patients (4/22). The number of samples with high risk HPV was significantly higher than low risk samples (P <0.05).

Conclusion. The PCR is a rapid and sensitive method for the detection of HPV in paraf- fin embedded cervical cancer samples.

Key words: HPV, cervical cancer, PCR

A

Addrreess ddoo kkoorreessppoonnddeennccjjii

Beata Smolarz

Pracownia Biologii Molekularnej Zak³ad Patomorfologii Klinicznej Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki ul. Rzgowska 281/289

93-338 £ódŸ

Cytaty

Powiązane dokumenty

Cel pracy: Celem pracy było zastosowanie metody PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) do oceny częstości występowania zintegrowanej i episomalnej postaci HPV-16 oraz określenia

Wyniki powyższe doprowadziły do wniosku, że po- danie kobietom czterowalentnej szczepionki przeciw- ko HPV zawierającej wirusopodobne cząsteczki typów 6, 11, 16, i 18 zmniejszyło

pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym gło- wy i szyi (HNSCC, head and neck squamous- -cell carcinoma) wykazuje się obecność zaka- żenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV,

In the present study, in 85 archival cervical cancer biopsies we compared detection of HPV16 and 18 infection and viral genome state assessment between RT-PCR (based on TaqMan

It is vital to notice that test detect- ing HR HPV E6/E7 mRNA test may significantly increase the molecular tests specificity in identifying HSIL lesions, while retaining

As infection with HPV is the strongest risk factor for cervical neoplasia, detection of HPV genotypes in cervical and vaginal specimens of women with normal and abnormal cytology

Cel pracy: Celem pracy było zastosowanie metody PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) do oceny częstości występowania zintegrowanej i episomalnej postaci HPV-16 oraz określenia

przeciwko antygenom kapsydu HPV wykaza∏y ich obecnoÊç u wi´kszoÊci kobiet aktywnych seksualnie (w populacji USA do 70%), co oznacza, ˝e 70% populacji kobiet mia∏o kontakt z