Ćwiczenie 1
Oznaczanie aktywności enzymów
Prowadzący: dr inż. Gabriela PASTUCH-GAWOŁEK
Miejsce ćwiczenia: sala 7
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie oraz badanie wpływu na aktywność amylazy różnych czynników, takich jak: temperatura, obecność jonów chlorkowych, silnych kwasów i zasad.
WSTĘP
Hydrolazy glikozydowe to grupa enzymów powodujących hydrolizę wiązań glikozydowych. Do najpowszechniej występujących enzymów w tej podgrupie należą amylazy. Przeprowadzają one hydrolizę skrobi, wielocukru złożonego z jednostek D-glukozy, połączonych wiązaniem glikozydowym. -amylazy rozrywają wiązania położone wewnątrz cząsteczki.
Przebieg procesu degradacji skrobi można śledzić obserwując zmianę barwy roztworu skrobi traktowanego jodem od niebieskiej (kompleks ze skrobią), poprzez fiołkową, czerwoną (kompleks z erytrodekstrynami) do bezbarwnej (utworzenie cukrów o niskim ciężarze cząsteczkowym). W czasie procesu rośnie zawartość cukrów redukujących, produktów hydrolizy skrobi i określając ich zawartość można śledzić przebieg reakcji.
Obecność cukrów redukujących można również stwierdzić wobec odczynnika Benedicta. Próba Benedicta należy do najbardziej swoistych i czułych prób redukcyjnych na cukry. Już 0,1%
stężenie cukru redukującego powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. W zależności od ilości glukozy powstaje albo tylko zielone zabarwienie, albo osad żółty, pomarańczowy czy czerwony.
U człowieka enzym -amylaza występuje w ślinie, trzustce, surowicy krwi i moczu. Amylaza śliny i trzustki wykazuje aktywność w roztworach lekko zasadowych, obojętnych i słabo kwasowych.
Optymalne pH działania: 6,6. Bardzo duży wpływ na działanie amylazy śliny wywierają elektrolity (Cl-, Br-).
PODSTAWY TEORETYCZNE
Skrobia jest polisacharydem zbudowanym z cząsteczek D-glukozy, które są połączone wiązaniami -glikozydowymi. Jest ona obecna w roślinach, gdzie pełni rolę nośnika energii niezbędnego w większości procesów metabolicznych.
Skrobia jest zbudowana z dwóch składników strukturalnych amylozy i amylopektyny.
Amylo za tworzy proste, długie łańcuchy o masie cząsteczkowej od 4000 do 15000 Da.
Reszty glukozylowe są przyłączane w niej wyłącznie wiązaniami 14--glikozydowymi.
O OH
OH
OH O O
OH OH
OH O
OH OH OH
OH O HO
n
Natomiast a mylo p ekt yna jest tworem rozgałęzionym zbudowanym z krótkich, prostych łańcuchów, złożonych z około 30 jednostek glukozy połączonych wiązaniami 14-
-glikozydowymi, a między sobą powiązanych wiązaniami 16--glikozydowymi. Dzięki obecności tych wiązań jednym z produktów hydrolizy amylopektyny jest izomaltoza. Masa
cząsteczkowa amylopektyny jest znacznie większa niż amylozy i przekracza 500 kDa, a sięga nawet do 100000 kDa.
O O O O O O O O
O O O O O O
O
O
O
O
gdzie O O =
O OH
OH
OH O O
O OH OH
OH O
...
Skrobia jest typowym polisacharydem zapasowym, roślinnym i występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i nasionach wielu innych roślin. Tworzy różnego rodzaju granulki różniące się w zależności od źródła pochodzenia oraz sposobu wydzielania.
Większość granulek składa się z kolejnych warstw, które ulegają asocjacji mając postać ziarenek widocznych pod mikroskopem. Stosunek amylozy i amylopektyny jest zasadniczą cechą poszczególnych gatunków skrobi. W tablicy podano niektóre własności skrobi.
Źródło Kształt Wielkość [m] Amyloza [%]
Algi kulisty 15 1
Owies kulisty 25 27
Kukurydza kulisty 25 52
Jęczmień kulisty 20 22
Pszenica kulisty 30 28
Ziemniaki owalny 40 23
Groch owalny 40 66
Z przytoczonego zestawienia widać, że jedynie dla pewnych odmian kukurydzy i grochu wartość amylozy przekracza 50%. Ma to istotny wpływ na zdolność hydrolizy skrobi przez enzymy i w konsekwencji na zdolność przyswajania skrobi przez organizmy.
W procesie metabolizmu skrobi pierwszym stadium jest rozkład enzymatyczny na mniejsze fragmenty. Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu do maltozy lub glukozy. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału zapasowego; znalazło to zastosowanie przy otrzymywaniu słodu.
Znane są trzy rodzaje amylaz: -amylaza zaliczana do endoamylaz oraz -amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz.
Wszystkie rodzaje amylaz katalizują hydrolizę wiązań 1-4--glikozydowych, a zgodnie z nazwą endoamylazy, -amylaza atakuje wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha,
natomiast -amylaza i glukoamylaza, jako egzoamylazy, rozrywają odpowiednio co drugie lub kolejne wiązania glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha.
o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o o o o o o o o o o o
o o o o o o
o o o o o o o o o o o o o
o
degradacja amylozy i amylopektyny przez -amylazę
degradacja amylopektyny przez -amylazę
O O O O O O O O
O O O O O O
O
O
O
O
gdzie O O =
O OH
OH
OH O O
O OH OH
OH O
...
Skrobia zawiera obok frakcji amylozy, również frakcję amylopektyny, złożoną z łańcuchów rozgałęzionych. Ponieważ wiązania 1-6--glikozydowe, występujące przy rozgałęzieniach w amylopektynie, stanowią barierę dla działania -amylazy, rozkład tej frakcji skrobi jest inny: boczne łańcuchy są rozkładane przez -amylazę do maltozy, podobnie jak prosty łańcuch amylozy, po czym reakcja zatrzymuje się na rozgałęzionych wiązaniach 16. Powstaje więc nierozłożona, wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna, która stanowi około 40-45% masy amylopektyny i wykazuje znaczną lepkość w roztworze i fioletową barwę z jodem. Rozkładowi ulega ona dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż - amylaza przeskakuje przez wiązania 16--, tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być rozkładane przez -amylazę.
Tak więc, w wyniku działania - i -amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy, czyli -D-glukozylo-16-glukozy, oraz niewielkiej ilości wolnej glukozy.
Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również 14--glukozydazę i 16-- glukozydazę (izomaltazę), enzymy te rozkładają wytworzone disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem rozkładu enzymatycznego skrobi. Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt.
Rozkłada ona zarówno wiązania 14--, jak i 16--glikozydowe i dlatego przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy.
Liczne grzyby nitkowate, bytujące w środowiskach bogatych w polisacharydy, są zdolne do syntezy i wydzielania znacznych ilości amylaz; jest to wykorzystywane przy technicznym ich otrzymywaniu.
WYKONANIE ĆWICZENIA
Sprzęt:
statyw z probówkami,
pipety,
łaźnie wodne o temperaturze 0oC, 18oC, 37oC, 45oC, 80oC.
Materiał i odczynniki:
0,5% roztwór skrobi,
bufor fosforanowy pH 6,6,
1% roztwór NaCl,
odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI)
1M HCl,
1M NaOH.
Wykonanie ćwiczenia:
Zadanie 1. Oznaczanie aktywności -amylazy w ślinie.
Przygotować statyw z probówkami zawierającymi po 0,5 ml odczynnika Lugola i 0,5 ml 1M HCl.
W kalibrowanej probówce (1) zebrać około 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, wymieszać i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC.
Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na 5 minut.
Po 5 minutach do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać, zanotować czas i ponownie wstawić do łaźni wodnej. W krótkich odstępach czasu (od 30s do 3 min) do probówek w statywie, zawierających płyn Lugola, wprowadzać pipetą próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy jodu- punkt achromowy.
Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach / ml. W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37oC, w pH 6,6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem – punkt achromowy.
Przykład obliczenia:
Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml stokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 8 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/8 x 100 = 125 jednostek / ml.
Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność -amylazy.
Jon chlorkowy jest aktywatorem -amylazy. Oznaczyć punkt achromowy jak w zadaniu 1 zastępując w probówce (2) chlorek sodu wodą destylowaną.
Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność -amylazy.
Do czterech probówek odmierzyć po 5 ml skrobi, 2 ml buforu i 2 ml NaCl. Każdą probówkę umieścić w innej łaźni i po 5 minutach dodać do każdej po 1 ml roztworu śliny, zamieszać i oznaczyć punkty achromowe analogicznie jak w zadaniu 1.
Podać optymalna temperaturę dla -amylazy.
Zadanie 4. Wpływ silnych kwasów i zasad na aktywność -amylazy.
Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu śliny. Do pierwszej dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Po 15 minutach zawartość probówek zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić objętość buforem do 5 ml. Do trzech następnych probówek odmierzyć po 2 ml skrobi, 1 ml NaCl, 1 ml buforu pH 6,6. Do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny rozcieńczonej wodą, do drugiej 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej 1 ml śliny traktowanej zasadą. Probówki ponownie umieścić w łaźni wodnej i oznaczyć aktywność -amylazy.
