Spektroskopia w ultrafiolecie i w
świetle widzialnym (UV-VIS)
UV-VIS
• Spektroskopia UV-VIS polega na pomiarze absorpcji promieniowania ultrafioletowego z zakresu 200-400
nm i widzialnego w zakresie 400-750 nm.
UV-VIS - podstawy
Z równania Plancka wynika że:
• E = hv = h*c/λ
• h = 6,626 069 57(29)·10–34 J·s
• v - częstotliwość drgań źródła, które wysyła falę elektromagnetyczną
• c - prędkość światła (3 * 10^8 m/s)
• λ – długość fali
UV-VIS -podstawy
Graniczne energie fotonów wyliczone na podstawie równania Plancka dla zakresu UV-VIS:
100 – 10000 kJ/mol
mogą powodować przejście elektronów w cząsteczce ze stanu podstawowego do stanu
wzbudzonego.
UV-VIS
Zabsorbowana energia powoduje zmiany:
• stanów elektronowych
• energii oscylacyjnej
• energii rotacyjnej
przy czym:
e. rotacyjna : e. oscylacyjna : e. elektronowa 1 10 1000
UV-VIS
Absorpcja promieniowania z zakresu UV lub VIS powoduje przejście elektronu z wiążącego
orbitalu cząsteczkowego na orbital antywiążący (o wyższej energii):
Orbitale cząsteczkowe - podsumowanie
• Orbital wiążący ma energię niższą niż energia stanu podstawowego atomów tworzących
cząsteczkę.
• W orbitalu wiążącym gęstość elektronowa pomiędzy jądrami jest duża, w orbitalu
antywiążącym jest natomiast mała – co powoduje odpychanie między atomami doprowadzając do osłabienia lub nawet zerwania wiązania.
UV-VIS
Warunkiem koniecznym absorpcji fotonu,
powodującego przejście elektronu z orbitalu wiążącego na antywiążący jest dopasowanie wielkości fotonu do różnicy poziomów
energetycznych orbitalu wiążącego i antywiążącego. Różnica ta jest równa:
hv
UV-VIS
Elektrony walencyjne w cząsteczce związku organicznego podzielić można na 3 rodzaje:
• elektrony
• elektrony
• elektrony n
UV-VIS
Rodzaje możliwych przejść elektronowych w cząsteczkach związków organicznych:
UV-VIS
Analizując np. strukturę metanolu można stwierdzić że pasmo absorpcyjne związane z przejściem
--> * nie będzie w widmie widoczne ponieważ wzbudzenie elektronów w wiązaniu
kowalencyjnym C-H wymaga zbyt dużej energii (λ
< 160 nm). Widoczne są natomiast pasma
absorpcyjne związane z przejściami: –>n –>
n –> *
Oznacza to że chromoforami są grupy posiadające elektrony lub n.
UV-VIS
Chromofory – przykłady
Substancje bezbarwne ale mające w swoich
cząsteczkach chromofory dają widmo elektronowe w zakresie UV (180-380 nm)
UV-VIS
Pasma absorpcji niektórych chromoforów:
UV-VIS
Widmo elektronowe zazwyczaj charakteryzuje się określając długość fali, przy której pojawia się maksimum absorpcji. Poniżej
przedstawiono widmo elektronowe kwasu salicylowego w którym widoczne są 2
maksima absorpcji:
UV-VIS
Czynnikiem decydującym o wielkości absorpcji jest charakter grup chromoforowych w cząsteczkach.
Większa ich ilość powoduje silniejszą absorpcję ale również przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku fal dłuższych. Takie przesunięcie nazywa się
przesunięciem batochromowym i może być wywołane obecnością kilku sprzężonych ze sobą wiązań
podwójnych lub wprowadzeniu do cząsteczki grup auksochromowych (np. –OH lub -NH2). Grupy te nie wywołują barwy ale oddziałują na chromofory. Ich wpływ na przesunięcie maksimum absorpcji rośnie w szeregu:
-CH3 < -OH < -O-CH3 < -NH2 < -NH-CH3 < N(CH3)2
UV-VIS
Prawa absorpcji:
•Prawo Lamberta – Beera:
gdzie:
– molowy współczynnik absorpcji c – stężenie substancji absorbującej
l – grubość warstwy substancji absorbującej
UV-VIS
Molowy współczynnik absorpcji jest ważnym parametrem charakteryzującym widmo elektronowe, świadczącym o
intensywności absorpcji promieniowania. Ma on również duże znaczenie przy oznaczeniach ilościowych: jego duża wartość (powyżej 10000) pozwala na oznaczanie bardzo małej ilości substancji (zwiększa się czułość oznaczenia).
Metody dla których jest mniejszy od 1000 uznaje się za mało czułe.
UV-VIS
Prawa absorpcji:
•Prawo addytywności absorbancji:
jeżeli w roztworze znajdują się dwie lub więcej substancji absorbujących promieniowanie UV- VIS, to całkowita absorbancja roztworu (A) jest równa sumie absorbancji poszczególnych
składników:
UV-VIS
Przyczyny odchyleń od praw absorpcji:
Odstępstwa od praw absorpcji mogą być wywołane czynnikami:
•podstawowe ograniczenia praw (np. za duże stężenia, niepożądana luminescencja)
•chemicznymi (np. zmiana pH lub stężenia roztworu wpływa na dysocjację, solwatację, kompleksowanie…)
•aparaturowymi (brak monochromatyczności promieniowania)
Aparatura stosowana w
spektrofotometrii UV-VIS
Aparatura stosowana w spektrofotometrii UV-VIS
Spektrofotometr Lambda
UV-VIS
Analiza ilościowa:
•wybór analitycznej długości fali
•metoda krzywej kalibracyjnej
UV-VIS
Analiza ilościowa - układy 2 (i więcej) składnikowe.
Możliwe jest ilościowe spektrofotometryczne oznaczenie kilku składników mieszanie nawet jeśli
widma tych składników nakładają się na siebie.
Konieczna jest jednak w tym przypadku znajomość molowych współczynników absorbcji wszystkich składników przy ich analitycznych długościach fal a
poszukiwane stężenia składników uzyskuje się rozwiązując odpowiednie układy równań.
UV-VIS
Zastosowanie spektrofotometrii UV-VIS do identyfikacji substancji organicznych.
Widma UV-VIS dają mniej informacji o strukturze cząsteczkowej niż widma w podczerwieni lub NMR. Wynika to z faktu iż wiele związków nie absorbuje promieniowania powyżej 200 nm, np.
węglowodory nasycone albo położenie pasm absorpcji zależy tylko w niewielkim stopniu od budowy cząsteczki. Energie
potrzebne do przeniesienia elektronów na wyższe poziomy energetyczne można uszeregować następująco:
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Luminescencja: emisja promieniowania
elektromagnetycznego w czasie nie krótszym niż 10-10 s od momentu zaabsorbowania energii przez atomy lub
cząsteczki danej substancji.
Rodzaje luminescencji:
•fotoluminescencja
•chemiluminescencja
•bioluminescencja
•elektroluminescencja
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
W analizie chemicznej wykorzystuje się głównie zjawisko fotoluminescencji:
•w przypadku fluorescencji samorzutna emisja promieniowania ustaje natychmiast po
wyłączeniu źródła promieniowania wzbudzającego.
•Fosforescencja jest procesem o długim czasie zaniku promieniowania (trwa kilka sekund a czasami minut).
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Proces fotoluminescencji można przedstawić ogólnym schematem:
Czas oddawania energii hv przez wzbudzoną cząsteczkę X* jest rzędu 10-9 – 10-7s.
Ponieważ emisji promieniowania towarzyszy wydzielenie ciepła dlatego długość fali
promieniowania emitowanego (mniejsza energia) jest większa niż promieniowania wzbudzanego.
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Fotoluminescencja charakteryzuje się zarówno widmem promieniowania absorbowanego przez cząsteczki jak i widmem promieniowania
emitowanego (widmo fluorescencji). Obydwa widma są swoimi odbiciami zwierciadlanymi:
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Diagram Jabłońskiego ilustruje kolejne etapy prowadzące do fluorescencji i fosforescencji:
S0, S1 – podstawowe stany
energetyczne cząsteczki
T1 - energetyczny poziom elektronowy o
charakterze metastabilnym
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii w analizie ilościowej.
Dla roztworów rozcieńczonych (stężenia na poziomie 1-100 ng substancji rozpuszczonej w 1 ml roztworu)
prawdziwa jest zależność:
IF=KI0kcl
gdzie:
IF – natężenie pr. Fluorescencyjnego K - stała proporcjonalności
I0 – natężenie pr. wzbudzającego
k – współczynnik absorpcji promieniowania c – stężenie substancji oznaczanej
l - grubość warstwy
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Zastosowanie fluorymetrii i spektrofluorymetrii w analizie ilościowej.
Oznaczenia ilościowe przeprowadza się metodą
porównawczą (podobnie jak oznaczenia w zakresie UV-VIS) stosując krzywą wzorcową. Należy jednak pamiętać że
liniowa zależność pomiędzy natężeniem promieniowania fluorescencyjnego a stężeniem można otrzymać tylko dla małych stężeń:
Spektroskopia fluorescencyjna cząsteczkowa
Fluorymetria i spektrofluorymetria znajduje szerokie zastosowanie w analizie:
•środków biologicznie czynnych (np. witaminy)
•Środków farmaceutycznych (antybiotyki, barbiturany)
•Substancji zagrażających środowisku (np.
wielkopierścieniowe węglowodory aromatyczne)
•Jonów metali (np. Al, Be, Ge) które z odczynnikami organicznymi (np. moryna) tworzą kompleksy
chelatowe
Metody emisyjne
Atomowa spektrometria emisyjna – jedna z
najstarszych metod instrumentalnych stosowanych w analizie elementarnej. Jej początki sięgają pierwszych lat XIX wieku (Brewster, Herschel – wpływ różnych soli na zabarwienie płomienia palnika spirytusowego). Pod koniec XIX wieku Bunsen i Kirchhoff w oparciu o
wcześniejsze wyniki badań m.in. Brewstera i Herschel’a stworzyli podstawy współczesnej atomowej
spektroskopii emisyjnej.
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
Silnie rozgrzane ciała stałe (np. metale) emitują
promieniowanie elektromagnetyczne o charakterze ciągłym. Cząsteczki związków chemicznych są źródłem promieniowania o charakterze pasmowym. Atomy
poddane wzbudzeniu emitują widmo liniowe. Oznacza to że emitowane są tylko pewne wybrane długości fal promieniowania elektromagnetycznego. Wynika to z faktu że elektrony w atomie nie mogą mieć dowolnej energii lecz tylko energię o ściśle określonych
wartościach, wynikających z liczb kwantowych
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
Emisja promieniowania następuje przy przejściu z wyższego stanu energetycznego na niższy. W atomie istnieje wiele poziomów energetycznych (tzw. termów) na które może
zostać przeniesiony elektron w procesie wzbudzenia. Powrót elektronu na stan podstawowy nie musi odbywać się
jednoetapowo. W efekcie emitowanych jest kilka kwantów promieniowania o energiach równych różnicom
poszczególnych termów.
hv = EM – EK
EM – energia termu o wyższej energii EK – energia termu o wyższej energii
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
Pomimo ograniczeń powodujących że nie wszystkie
przejścia energetyczne pomiędzy termami są realizowane daje to duże ilości linii spektralnych w widmie (np. Al ma ich 118 a Al1+ posiada dodatkowo 318 linii spektralnych w zakresie 160-1000 nm) – szczególnie przy wzbudzaniu
wysokoenergetycznym (np. iskra elektryczna). Źródła
wzbudzania typu płomień powodują powstawanie widm znacznie uboższych w linie. Intensywność linii spektralnej zależy przede wszystkim od stężenia atomów emitujących promieniowanie.
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
Do celów analizy ilościowej najbardziej przydatne są linie związane z przejściem do stanu podstawowego (linie rezonansowe). Są one najbardziej intensywne.
Zdolność pierwiastków do wzbudzania (kolejność malejąca):
• Litowce (1.4 – 3.0 eV)
• metale przejściowe (3.0-10 eV)
• metale ciężkie (powyżej 10 eV)
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
- jest najprostszą metodą z atomowych metod emisyjnych.
Do atomizacji próbki używa się płomienia który ma dostarczyć wytworzonym atomom energii potrzebnej do
ich wzbudzenia.
Aparatura
stosowana w fotometrii płomieniowej
Techniki emisyjne – fotometria płomieniowa
Zastosowanie fotometrii płomieniowej:
• - seryjne oznaczenia jonów sodu, potasu, wapnia w wodach mineralnych
• - analiza zawartości tych jonów w płynach ustrojowych, ekstraktach roślinnych
Ponieważ kationy sodu i potasu są odpowiedzialne za tzw. równowagę jonową w organizmie ludzkim
dlatego fotometria płomieniowa stosowana jest w prawie każdym laboratorium szpitalnym.