Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę.
Prowadzący: dr inŜ. Ilona WANDZIK mgr inŜ. Marta GREC
mgr inŜ. Jadwiga PASZKOWSKA
Miejsce ćwiczenia: sala 105
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie stałej Michaelisa (Km) oraz szybkości maksymalnej (Vmax) dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę oraz określenie wpływu stęŜenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
WSTĘP TEORETYCZNY
Kinetyka reakcji enzymatycznych
(na podstawie „Ćwiczenia z biochemii”, praca zbiorowa pod redakcją Leokadii Kłyszejko- Stefanowicz, PWN, Warszawa-Poznań 1982)
Kinetyka reakcji chemicznych zajmuje się badaniem szybkości przebiegu reakcji w zaleŜności od róŜnych czynników (stęŜenia reagentów, temperatury, obecności katalizatorów). Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zaleŜności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stęŜeniu substratu.
Podstawą katalitycznej reakcji enzymatycznej jest odwracalne wzajemne oddziaływanie substratu (S) z enzymem (E), przy którym powstaje nietrwały kompleks (ES), który następnie rozpada się na enzym i produkt reakcji (P).
Schemat reakcji enzymatycznej moŜna przedstawić równaniem:
Gdzie: E wolny enzym
S substrat
ES kompleks enzym-substrat
P produkt
k1, k2, k3 stałe szybkości reakcji
W równaniu tym zakłada się nieodwracalny mechanizm reakcji.
Przy małym stęŜeniu enzymu, lecz przy zmieniającym się w szerokich granicach początkowym stęŜeniu substratu, zmiany początkowej szybkości reakcji, wyraŜone jako ilość substratu przetworzonego w jednostce czasu, moŜna przedstawić w postaci krzywej:
E + S
k1k2
ES
k3E + P
szybkość V=-d[S]/dt
stęŜenie substratu [S]
-d[S]/dt=k[E]
-d[S]/dt=k[E][S]
Krzywa w pewnym punkcie zgina się i osiąga wartość maksymalną. Przy małym stęŜeniu substratu reakcja jest I rzędu i szybkość reakcji jest uzaleŜniona od stęŜenia substratu [S].
Przy zwiększeniu stęŜenia substratu osiąga się maksymalną szybkość reakcji, która jest niezaleŜna od stęŜenia substratu. Tłumaczy się to faktem, Ŝe przy zbyt małym stęŜeniu substratu niektóre cząsteczki enzymu nie są połączone z substratem w danym momencie i niecałkowite wysycenie enzymu jest przyczyną tego, Ŝe nie wykazuje on maksymalnej aktywności katalitycznej.
W miarę zwiększania stęŜenia substratu dochodzi do momentu, gdy wszystkie cząsteczki enzymu są z nim połączone i wówczas enzym pracuje z maksymalną szybkością. Dalsze zwiększanie stęŜenia substratu nie wpływa juŜ na zwiększenie szybkości reakcji- reakcja przebiega ze stałą szybkością.
Dla reakcji (1) szybkość poszczególnych przemian jest następująca:
v1=k1[E][S]=k1[Ec-ES][S] (2)
v2=k2[ES] (3)
v3=k3[ES] (4)
gdzie: [E] – stęŜenie enzymu wolnego [S] – stęŜenie substratu
[ES] – stęŜenie kompleksu enzym-substrat
[Ec] – stęŜenie całkowite enzymu biorącego udział w reakcji Kompleks ES tworzy się z szybkością v1, a rozkłada z szybkością v2+v3
k1[Ec-ES][S]=k2[ES]+k3[ES] (5) Po przekształceniu otrzymujemy:
Uwzględniając, Ŝe [Ec-ES]=[E], otrzymujemy:
Wielkość Km zwana stałą Michaelisa jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu.
Enzymy o niskiej wartości Km działają znacznie sprawniej niŜ enzymy o wysokiej Km. Szybkość tworzenia produktu v3 zaleŜy od [ES], a więc im wartość [ES] jest większa, a tym samym stała Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie produktu.
Szybkość reakcji enzymatycznej moŜna zapisać równaniem v3 = v1-v2 (8)
Reakcja v2 przebiega bardzo wolno, więc moŜna przyjąć, Ŝe szybkość procesu enzymatycznego v przebiega z szybkością v3:
v = v3 = k3[ES] (9)
Gdy substrat występuje w duŜym nadmiarze, cały enzym jest nasycony substratem, [ES]=[Ec], szybkość reakcji osiąga swą wartość maksymalną:
Vmax = k3[Ec] (10)
Korzystając z odpowiednich przekształceń równań otrzymujemy zaleŜność:
[Ec-ES][S]
[ES] = k2+k3
k1 = Km (6)
[E][S]
[ES] = Km (7)
Vmax[S]
Km+[S] = V (11)
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten JeŜeli do równania (11) wstawimy v=vmax/2, to otrzymamy po przekształceniu:
Km = [S] (12)
Czyli stała Michaelisa odpowiada takiemu stęŜeniu substratu, przy którym szybkość reakcji wynosi połowę szybkości maksymalnej.
Praktyczną metodą określania stałej Michaelisa i szybkości reakcji jest metoda graficzna.
Doprowadzając równanie (11) do postaci:
Otrzymujemy rónanie o postaci ogólnej y = ax + b, gdzie: b = 1/Vmax
Równanie (13) nosi nazwę równania Lineweavera-Burka. Przekształcenie to ma na celu uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej. W układzie współrzędnych wartości 1/v odkłada się na osi rzędnych, a wartości 1/[S] na osi odciętych. Równanie daje wówczas linię prostą, której nachylenie określa stosunek Km/Vmax. Przecina ona oś rzędnych w punkcie 1/Vmax, a oś odciętych w punkcie 1/Km. W ten sposób moŜna określić maksymalną szybkość Vmax oraz stałą Michaelisa Km.
Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten według Lineweavera-Burka [S]
szybkość reakcji V
Vmax 1/2 V
Km
1 Km 1
Vmax [S] + 1
= Vmax
V (13)
Aktywność optyczna
Związki optycznie czynne posiadają zdolność skręcania płaszczyzny polaryzacji światła.
Gdy światło spolaryzowane, wykazujące drgania w określonej płaszczyźnie przejdzie przez substancję optycznie czynną, wówczas jego drgania pojawiają się w innej płaszczyźnie. Kierunek i stopień skręcenia moŜna mierzyć za pomocą polarymetru.
Skręcenie w lewo oznaczamy znakiem (-), a skręcenie w prawo znakiem (+). Na przykład (+)-sacharoza jest prawoskrętna. Wielkość kąta skręcenia zaleŜy od liczby cząsteczek znajdujących się na drodze wiązki światła podczas jej przechodzenia przez rurkę polarymetryczną, a zatem zaleŜy od stęŜenia próbki i od długości rurki pomiarowej.
Skręcalność właściwą [αααα]D danego związku definiujemy jako zaobserwowaną wartość skręcenia, gdy długość rurki pomiarowej wynosi 1 decymetr, stęŜenie próbki wynosi 1g/ml, a długość fali światła wynosi 589 nm.
[α]D = c l α α - obserwowane skręcenie (w stopniach), l – długość rurki polarymetrycznej (w dm), c – stęŜenie roztworu (g/ml).
Skręcalność właściwa [α]D jest wielkością fizyczną charakterystyczną dla danego związku optycznie czynnego, podobnie jak temperatura topnienia, temperatura wrzenia, gęstość lub współczynnik załamania światła.
Hydroliza sacharozy
Sacharoza jest dwucukrem zbudowanym z cząsteczki D-glukopiranozy i D- fruktofuranozy. Wiązanie łączące glukozę z fruktozą ulega hydrolizie i to zarówno pod wpływem kwasów mineralnych, jak i enzymu zwanego inwertazą. Z tą reakcją związane jest zjawisko zwane inwersją sacharozy, polegające na zmianie znaku skręcalności roztworu sacharozy (+), gdyŜ w powstałej równomolowej mieszaninie cukrów fruktoza silniej skręca płaszczyznę polaryzacji w kierunku (-) niŜ glukoza (+) i cały roztwór przyjmuje skręcalność ujemną, czyli po reakcji znak skręcalności roztworu zmienia się na przeciwny (inwersja). Otrzymywany produkt, który jest mieszaniną D-glukozy i D- fruktozy nazywany jest cukrem inwertowanym.
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6
sacharoza D-glukoza D-fruktoza
[α]D= +66.4o [α]D= +52.1o [α]D= -93.1o
cukier inwertowany [α]D= -20.5o
WYKONANIE ĆWICZENIA
Sprzęt:
polarymetr,
rurka polarymetryczna,
kolba miarowa o poj. 100 ml, 6 szt,
pipeta miarowa o poj. 25 ml,
kolby stoŜkowe o poj. 50 ml, 6 szt.,
mikropipeta, ,
waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
sacharoza,
bufor octanowy o pH 4,7
roztwór inwertazy
Zadanie 1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stęŜeniu 4 g/100 ml w buforze octanowym.
Do 25 ml roztworu dodać 0.100 ml (100µl) roztworu inwertazy, wymieszać, szybko napełnić rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcania. Pomiary wykonać w 2, 4, 6, 8 i 10 minucie od wprowadzenia inwertazy do roztworu.
Analogicznie przeprowadzić hydrolizę sacharozy wobec takiej samej ilości enzymu dla roztworów o stęŜeniu 0,5 g/100 ml, 1 g/100 ml, 1,5 g/100 ml, 2 g/100 ml i 3 g/100 ml.
Opracowanie wyników:
1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli (dla kaŜdego stęŜenia substratu):
Czas, min
Skręcalność, stopnie
StęŜenie substratu, cs
g/100 ml
StęŜenie produktu, co-cs,
g/100 ml
Szybkość początkowa, vo,
g/min
1/cO 1/vO
2 4 6 8 10
O
S c
c 1,16l * 0,23* +
= α
l- długość rurki polarymetrycznej, dm α- kąt skręcania, stopnie
2. Dla kaŜdego stęŜenia sacharozy wykreślić zaleŜność ilości wytworzonego produktu (cO – cS) od czasu.
3. Na kaŜdym wykresie przeprowadzić styczną do krzywej w punkcie t = 0 i wyznaczyć szybkość początkową reakcji równą tgα.
4. Sporządzić wykres Michaelisa-Menten na podstawie wyznaczonych szybkości początkowych vO oraz wyznaczyć na tej podstawie stałą Michaelisa Km.
5. Sporządzić wykres zaleŜności 1/vO od 1/cO dla równania Lineweavera-Burka i wyznaczyć stałą Michaelisa Km oraz maksymalną szybkość reakcji Vmax.
Zadanie 2. Wpływ stęŜenia enzymu na szybkość hydrolizy sacharozy.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotować 100 ml roztworu sacharozy o stęŜeniu 10 g/100 ml w buforze octanowym i do 25 ml tego roztworu wprowadzić 0.25 ml roztworu inwertazy.
Wymieszać, szybko napełnić roztworem rurkę polarymetryczną i zmierzyć kąt skręcenia. Pomiary powtórzyć w 5, 10, 15 i 20 minucie doświadczenia.
Analogicznie przeprowadzić badania stosując: 0.125 ml, 0.050 ml, 0.025 ml roztworu inwertazy.
Opracowanie wyników:
1. Uzyskane wyniki zebrać w tabeli – dla kaŜdego stęŜenia inwertazy:
Czas, min
Skręcalność, stopnie
StęŜenie substratu, cs
g/100 ml
StęŜenie produktu, co-cs,
g/100 ml
Szybkość początkowa, vo,
g/min 0
5 10 15 20
2. Dla kaŜdego stęŜenia enzymu sporządzić wykresy zaleŜności ilości produktu od czasu.
3. Wyznaczyć szybkości początkowe reakcji.
4. Przedstawić graficznie zaleŜność szybkości vO od stęŜenia enzymu.
5. Zinterpretować uzyskane wyniki.
Warunki zaliczenia ćwiczenia:
• Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia
• Wykonanie sprawozdania,
Uwaga: na zajęcia naleŜy przynieść papier milimetrowy
