Poszukiwanie genetycznych podstaw choroby

(1)

Poszukiwanie genetycznych podstaw choroby

Analiza sprzężeń i analiza asocjacji

(2)

Jakie cechy badamy

•

Choroby - zmienność patologiczna

•

genetyczne - zależne od zmian w genach

•

dziedziczne - nie wszystkie choroby genetyczne są dziedziczne!

•

wrodzone - nie wszystkie choroby wrodzone są dziedziczne lub genetyczne!

•

inne - choroby, w których jest składowa genetyczna i składowa środowiskowa

•

Zmienność prawidłowa

•

każdy z nas jest inny

(3)

Jak dziedziczą się cechy człowieka?

•

Mendlowskie - jeden gen = jedna cecha

•

zmienność konkretnego genu decyduje o fenotypie konkretnej cechy

•

w przypadku chorób - tzw. mutacje sprawcze

•

Wielogenowe - zależne od działania kilku - kilkunastu genów

•

np. kolor oczu, włosów

•

Wieloczynnikowe - zależą od współdziałania wielu (setek, tysięcy) genów i

środowiska

(4)

Jak dziedziczą się cechy człowieka?

•

Mendlowskie - jeden gen = jedna cecha

•

dobrze potrafimy identyfikować geny, analizować dziedziczenie, wykrywać mutacje i przewidywać fenotyp

•

Wielogenowe - zależne od działania kilku - kilkunastu genów

•

potrafimy analizować i przewidywać fenotyp, ale nie ze 100% dokładnością

•

Wieloczynnikowe - zależą od współdziałania wielu (setek, tysięcy) genów i środowiska

•

nie potrafimy dobrze przewidywać, dopiero zaczynamy poznawać złożoność i

odkrywać korelacje statystyczne

(5)

Jak dziedziczą się cechy człowieka?

•

Mendlowskie - jeden gen = jedna cecha

•

znamy wiele chorób, które tak się dziedziczą, ale są to choroby rzadkie

•

tylko pojedyncze przykłady cech zmienności prawidłowej

•

Wieloczynnikowe - zależą od współdziałania wielu (setek, tysięcy) genów i środowiska

•

praktycznie wszystkie aspekty zmienności prawidłowej

•

większość często występujących choróļ

(6)

Badanie relacji genotyp-fenotyp u człowieka

•

Analiza sprzężeń - poszukiwanie rejonów chromosomu położonych blisko genu determinującego daną cechę

•

Allele o dużej penetracji (allele sprawcze) - cechy mendlowskie

•

Analiza asocjacji - poszukiwanie korelacji polimorfizmów genetycznych z występowaniem fenotypu

•

Także allele o niskiej penetracji (przy dużych zbiorach danych)

•

Cechy wieloczynnikowe

(7)

Asocjacje a sprzężenie

•

Sprzężenie - wspólna segregacja alleli genów leżących blisko siebie na chromosomie

•

dotyczy loci, nie konkretnych alleli

•

proste podłoże biologiczne (chromosomy, rekombinacja)

•

badana w rodowodach i/lub parach krewnych

•

Dotyczy cech mendlowskich - wysoka odziedziczalność, mutacje sprawcze

pojedynczych genów

(8)

Asocjacja a sprzężenie

•

Osoby z allelem a jakiegoś genu mają większe prawdopodobieństwo fenotypu X

•

Czy zawsze asocjacja oznacza zależność przyczynową?

•

Czy każda asocjacja ma wartość diagnostyczną?

•

Czy asocjacja odkrywa “gen na ....”?

•

Odpowiedzi na te i inne pytania - wykład

(9)

Asocjacje a sprzężenie

•

Asocjacja - korelacja występowania konkretnych alleli genów w populacji

•

dotyczy konkretnych alleli

•

często złożone i/lub niejasne podłoże biologiczne - zjawisko statystyczne, niekiedy bez związku przyczynowego

•

dotyczy populacji lub grupy, ale bez wymogu pokrewieństwa

•

może niekiedy być związana ze sprzężeniem (nierównowaga sprzężeń)

•

dotyczy cech wieloczynnikowych

(10)

Asocjacja a sprzężenie

Asocjacja Sprzężenie

Dotyczy alleli Dotyczy genów (loci) Na poziomie populacji W rodzinie

Dziedziczenie wieloczynnikowe Dziedziczenie mendlowskie -

mutacje sprawcze

(11)

Geny i chromosomy

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

Dla 2 genów:

4 równoliczne klasy gamet

Allele genów zlokalizowanych na różnych chromosomach segregują niezależnie (II prawo

Mendla)

(12)

Sprzężenie

Dla 2 genów i pełnego sprzężenia

2 równoliczne klasy gamet rodzicielskich

Allele genów leżących na tym samym chromosomie dziedziczą się razem - sprzężenie

(13)

Sprzężenie

Dla 2 genów:

2 równoliczne klasy gamet rodzicielskich

2 równoliczne klasy gamet rekombinowanych

Klasy rekombinowane mniej liczne od rodzicielskich

Crossing-over (rekombinacja chromatyd niesiostrzanych w mejozie)

(14)

Mapowanie genetyczne

powstają gamety rekombinowane powstają gamety rodzicielskie

Aby powstały rekombinowane gamety, crossing-over musi zajść pomiędzy genami (loci)

Liczba rekombinantów jest miarą odległości genetycznej

(15)

Mapowanie genów

•

Prawdopodobieństwo crossing-over pomiędzy genami jest proporcjonalne do odległości między nimi na chromosomie

•

Liczebność klas zrekombinowanych w potomstwie jest miarą odległości genetycznej

•

U Drosophila najlepiej mapować za pomocą krzyżówki heterozygotycznej samicy i samca recesywnego

•

A u człowieka?

(16)

Metody

•

Sprzężenie: analiza sprzężeń (mapowanie)

•

metody parametryczne - dla dużych rodowodów, nawet niewielu

•

metody nieparametyczne - dla dużej liczby małych rodowodów

•

Asocjacje - badanie korelacji (testy statystyczne)

(17)

Analiza sprzężeń u człowieka

•

Geny człowieka są rozdzielone długimi obszarami międzygenowymi

•

Sprzężenie pomiędzy genami, których allele dają obserwowalne fenotypy jest bardzo rzadkie

•

Wykorzystuje się markery molekularne (RFLP, VNTR, etc.)

•

mapy genetyczne człowieka (np. CEPH, HapMap)

•

poszukiwanie markera sprzężonego z locus choroby

(18)

Metody mapowania

•

Parametryczne (oparte na modelach dziedziczenia)

•

dwupunktowa

•

wielopunktowa

•

Nieparametryczna analiza sprzężeń

•

czy jest statystycznie istotne odchylenie od założenia o niezależnym przekazywaniu alleli (II prawo Mendla) dla danych loci w populacji

•

współwystępowanie (korelacje) alleli u spokrewnionych osób

(19)

Analiza nieparametrczna

A1A1 A1A2

A1A2 A1A2

IBD

Dwa allele są identyczne przez pochodzenie (IBD) jeżeli są kopiami tego samego allelu

rodzicielskiego

(20)

Metody nieparametryczne

•

Korelacja względnego podobieństwa u par mapowanej cechy z podobieństwem markera

•

Badania bliźniąt

•

Badania chorego rodzeństwa (affected siblings method):

•

czy w parach chorych krewnych allele markera (nieważne które) są wspólne częściej, niż w reszcie populacji?

•

Badania niewielkich rodowodów (z pojedynczymi chorymi)

(21)

Metody parametryczne

•

Zakładamy, że jest znany model dziedziczenia

•

2 lub więcej genów i/lub markerów - loci

•

genotypy rodziców i genotypy potomstwa

•

dane (liczba rekombinantów) pozwalają na wyznaczenie parametrów modelu

- odległości między loci

(22)

Miarą odległości jest częstość rekombinacji

•

Częstość rekombinacji θ = prawdopodobieństwo przekazania rekombinowanej gamety

•

Loci na różnych chromosomach segregują niezależnie

=> θ = 0,5

•

Loci blisko sprzężone segregują razem

=> θ = 0

•

Zatem

•

θ<0,5 sprzężenie

•

θ=0,5 brak sprzężenia

(23)

Mapowanie

•

Jednostka: cM (centymorgan) = 1% rekombinacji

•

Zależność nie jest liniowa

•

Podwójny crossing-over – gamety typu rodzicielskiego

•

Interferencja – crossing-over w danym miejscu zmienia prawdopodobieństwo zajścia

kolejnego w pobliżu

(24)

Podwójny c-o – złożony obraz

Średnio 50% rekombinantów. Podobnie dla potrójnego c-o, itp.

(25)

Funkcja mapowa

• Zależność odległości genetycznej od częstości rekombinacji

• Funkcja mapowa Haldane’a

• wielokrotne c-o, bez interferencji

• Funkcja Kosambi’ego

• uwzględnia też interferencję, szeroko stosowana

• Dla małych θ: d≈θ

d = ln(1 − 2 θ ⁾

2 d = ln( 1 + 2 θ

1 − 2 θ ⁾

4

(26)

Funkcja mapowa

• Wraz ze wzrostem odległości częstość c-o dąży do 0,5

• Dla genów niesprzężonych

“rekombinantów” jest 50%, podobnie jak dla genów leżących w dużej odległości

(27)

Płeć a częstość rekombinacji

• Całkowita mapa mężczyzny = 2851cM (autosomy)

• Całkowita mapa kobiety = 4296 cM (autosomy)

• Dla ~3000Mb genomu autosomów

• 1 cM u mężczyzn ≈ 1,05 Mb

• 1 cM u kobiet ≈ 0,7 Mb

• średnia 1 cM ≈ 0,88 Mb

• stosunek różny w różnych obszarach genomu

(28)

Analiza parametryczna

•

U Drosophila najprościej skrzyżować samicę podwójną heterozygotę z samcem podwójnie recesywnym i policzyć klasy w potomstwie.

•

A u człowieka?

•

nie zakłada się krzyżówek doświadczalnych

•

mało liczne potomstwo, długi czas generacji (25 lat/pokolenie)

(29)

Wiarygodność (likelihood)

•

Wiarygodność: prawdopodobieństwo uzyskania zaobserwowanych danych

przy założeniach modelu i jego określonych parametrach

(30)

Wiarygodność (likelihood)

•

W rodowodzie w pełni informatywnym

•

dane: R=liczba rekombinantów; NR=liczba genotypów rodzicielskich

•

parametr: częstość (prawdopodobieństwo) rekombinacji θ

•

Hipoteza zerowa – brak sprzężenia (θ=0,5)

•

Stosunek wiarygodności dla danej wartości θ: L(θ)/L(θ=0,5)

•

lod score (Z) = logarithm of odds – logarytm dziesiętny stosunku

wiarygodności

(31)

Proste przykłady obliczeń lod

Dla danego rodowodu (i), lod dla danego θ wynosi:

Dla danej wartości θ, sumuje się lod-score z różnych rodowodów (F):

Z

_i

( θ ⁾ = log

₁₀

L(rodowód / θ ⁾

L(rodowód / θ = 0,5)

Z( θ ⁾ ⁼ ^Z _i ⁽ θ ⁾

i =1

∑ F

(32)

Analiza dwupunktowa

wykluczone

znaczące

Z>3, (Z>2 dla sprzężonych z płcią)

Tabela

θ = 0.01, 0.10, 0.20, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50 lod= -5.0, -2.0, 1.0, 3.3, 4.0, 3.0, 1.0, 0.0

(33)

Markery w analizie sprzężeń u człowieka

•

Sprzężenie dwóch genów o obserwowalnym fenotypie – praktycznie niespotykane

•

wyjątek – zespół paznokciowo-rzepkowy (NPS – Nail Patella Syndrome) i grupy krwi AB0

•

Loci w obrębie kompleksów MHC

•

Markery molekularne

•

PCR, RFLP

(34)

Markery

(35)

Współczesne techniki

• Elektroforeza kapilarna i detekcja fluorescencji dla markerów PCR

• Sekwencjonowanie NGS dla markerów SNP

(36)

Problem fazy

•

Większość technik genotypowania molekularnego daje wynik w postaci genotypów poszczególnych zmiennych loci, ale nie podaje haplotypu

•

układ alleli na poszczególnych chromosomach

(37)

Sprzężenia i równowaga sprzężeń

•

Równowaga sprzężeń – genotyp w jednym locus jest niezależny od genotypu w drugim

•

Haplotyp – genotyp (zbiór alleli) dla wielu loci danego chromosomu (lub

gamety)

(38)

Równowaga sprzężeń

(39)

Równowaga sprzężeń

• W populacji będącej w stanie równowagi częstość haplotypu to iloczyn częstości alleli

A a B b p q s t

Haplotypy

AB Ab aB ab ps pt qs qt

(40)

Nierównowaga sprzężęń

(41)

Skąd bierze się nierównowaga sprzężeń

•

Migracje

•

Dobór naturalny działający na genotyp wielu loci

•

Kombinacja doboru w jednym z loci i dryfu

(42)

Nierównowaga sprzężeń a sprzężenie

Jeżeli odległość A do d jest niewielka, wówczas większość chromosomów w populacji niosących D niesie też A1

Ale nie odwrotnie!

Nierównowaga sprzężeń (linkage disequilibrium) – nieprzypadkowe skojarzenie alleli w sprzężonych loci – efekt założyciela. Maleje z

czasem.

Allel genu d w pobliżu markera A zmutował dając związany z chorobą allel D wiele pokoleń temu - efekt założyciela

mutacja

A1 d A1 D

(43)

Lokalizowanie genu z mutacją sprawczą

•

I etap – zgrubne (markery co 8-20 cM) – ustalenie chromosomu, stwierdzenie czy we wszystkich rodzinach ten sam locus itp.

•

II etap – dokładne (markery co 1-4 cM)

(44)

Sprzężenia w epoce genomu

•

Techniki sekwencjonowania całogenomowego są obecnie coraz bardziej dostępne

•

Czy badanie sprzężeń ma jeszcze sens?

(45)

(46)

Projekt 1000 genomów

(47)

(48)

Sprzężenia w epoce genomu

•

Między dwiema osobami możemy spodziewać się nawet 4 milionów różnic na poziomie sekwencji

•

U bliskich krewnych mniej, ale nadal sporo

•

Stwierdzenie, które z tych różnic odpowiadają za fenotyp nie zawsze jest ewidentne

•

Łatwiej w obszarach kodujących

•

Sekwencjonowanie stosowane w rzadkich chorobach, gdzie nie ma

dostatecznie dużo rodowodów

(49)

Podłoże genetyczne Wiele genów

niskie penetracje

Pojedyncze geny wysoka penetracja

Analiza asocjacji

Wielogenowe współczynniki ryzyka

Dane

Dużo małych rodowodów Duże rodowody

Nieparametryczna

analiza sprzężeń Parametryczna

analiza sprzężeń

(50)

Ćwiczenie

(51)

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2

(52)

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2

*

1 rekombinant (R); 4 rodzicielskie (NR)

Przy braku sprzężenia (θ=0,5) prawdopodobieństwo uzyskania R i NR jest jednakowe i wynosi ½

L(θ=0,5)= (½)

⁵

(53)

L(θ)= θ·(1- θ)

⁴

1R 4NR

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2

*

1 rekombinant (R); 4 rodzicielskie (NR)

Dla danej wartości θ prawdopodobieństwo uzyskania R wynosi θ (z definicji), prawdopodobieństwo

uzyskania NR wynosi zatem 1- θ

(54)

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2

*

1 rekombinant (R); 4 rodzicielskie (NR)

L(θ)= θ·(1 - θ)

⁴

L(θ=0,5)= (½)

⁵

Dla θ=0,1 L(θ=0,1) = 0,1·(0,9)⁴

€

Z(θ = 0,1) = log

₁₀

0,1⋅ 0,9

⁴

0,5

⁵

"

# $ %

&

' ≈ 0,32

(55)

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2

0 0,02 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

-∞ -0,23 0,32 0,42 0,36 0,22 0

(56)

0 0,02 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

-∞ -0,23 0,32 0,42 0,36 0,22 0

(57)

Kodowanie rodowodu

!"#$%&%'()*+#,+,-

!"#$%&$'(')*"#'+,-./"01234567849:0123"';;-;-"<'='>/)*"!"#$"+%=?@-"A,B">?(-$/)C>,-D"1A.>,-@E

>'A.B#?@E)-"./#/"!"#$

! !"#%& ')*%$%</" F())*#+$", ' &+(+%&GH" AI?J/ " =%" +%=%K'>,'" )*%$/)*" , " C=$%K/)* " )CI%>+LK" $%=C,>/D

MK'&'N"K"#$C/#'=+?")-)*"$-)-A/K>/)*"C=$%K/"(%J-".-J"</O">%A,),-;-(D"P"%C>')C'"C=$%K-&%H"Q

%C>')C' " )*%$-&%H " R " %C>')C' " <$'+ " ='>/)*D " S%J;,K- " @-A. " C'+%=%K'>,- " >,-#-I>-@ " #->-.$')@,H A#$CBJ->,'"C"#I),EH"$LJ>/)*"+;'A"$/C/+'",.=D"F#'.$C"%#,A"#$%&$'(?"./+.0*)1GD

! !"#$" >?(-$%K'>/)*"';;-;,"F('$+-$%K-G"F,%-.*/*0'(!!*!*&GH"AI?J/"=%"+%=%K'>,'"+%=%(,>?@E)/)*

('$+-$LKH">#D"T80U"F>'='@-"A,B".-J"=%"+%=%K'>,'">,-+.L$/)*"?+I'=LK"&$?#"+$K,GD"3%;-@>-"';;-;-

%C>')C'>- " AE " ;,)C<'(, " %=" P " =% ",H " R " C'KAC-" %C>')C'" <$'+" ='>/)*D " V;'" +'J=-&% " %A%<>,+'" K

$%=%K%=C,- " %#='@- " A,B " C'KAC- " =K,- " ;,)C</ " %=#%K,'='@E)- " %<? " ';;-;%(H " K " #$C/#'=+? " )-)*

A#$C-J%>/)*"C"#I),E"?"(BJ)C/C>"=$?&E"K'$.%W),E"(%J-"</O"R"F;?<"#%K.L$C%>/".->"A'(">?(-$

';;-;?G

! )-)*/",;%W),%K-"F1%(,+$+(+$2*'+/($+&GH"=%"+%=%K'>,'")-)*"),E&I/)*"%#,A/K'>/)*";,)C<E"$C-)C/K,A.EH

>#D"#%C,%(?"->C/(?H"KC$%A.?",.#D"

! )C/>>,+,"<,>'$>-"F.$,(/3')(#+"/&GH""+'J=-(?"';;-;%K,"K"&->%./#,-"#$C/#,A?@-"A,B"P"FK/A.B#?@-G";?<

R " >,- " K/A.B#?@-H " #%.$C-<' " C'.-( " ./;- " #%C/)@,H " ,;- " ';;-;, " K/A.B#?@- " K "!"#%&D " 9.%A%K'>/ " @'+%

';.-$>'./K>/"C'#,A "!"#$" ('$+-$%K/)*";?<"=%"%#,A/K'>,'"CI%J%>/)*"A/A.-(LK".'+,)*H"@'+"?+I'=

&$?#"+$K,"4XRH"%<-)>,-"$C'=C,-@"A.%A%K'>/D

Y>'@%(%WO"./#LK"'>';,C%K'>/)*"!"#$"#%.$C-<>'"@-A."=%"#$'K,=I%K-&%"C'+%=%K'>,'"$%=%K%=?D

2"#$%&%'()*+#/%&%'%&3

T%=%K%=/"+%=?@-"A,B"K"#;,+')*".-+A.%K/)*H"K"C'#,A,-"?#$%AC)C%>/("FZ%$('."D#$-GH"+.L$/">'A.B#>,- (%J>'"#$C-+AC.'I),O">'"Z%$('."%A.'.-)C>/"#$%&$'(-("4(1+.+&D"!"@-=>/("#;,+?".-+A.%K/("(%J>' C'#,A'O"=%K%;>E",;%WO"$%=%K%=LK"=;'"./)*"A'(/)*"!"#$"F0[V"A)%$-"AE"'==/./K>-\GD""!"+%;-@>/)*

K,-$AC')* " #;,+? " +%=?@- " A,B " +%;-@>- " %A%</D " V;' " ?#$%AC)C->,' " K'$.% " >' " $%=%K%=C,- " +%;-@>%

#%>?(-$%K'O"%A%</D

8%$('."#;,+?"D#$-"%<@'W>,'"#$%A./"#$C/+I'="#%>,J-@N

Rodzina osoba ojciec matka płeć choroba marker1a1 marker1a2 001 1 0 0 1 1 2 5

001 2 0 0 2 2 1 6 001 3 1 2 2 2 1 2 001 4 0 0 1 1 3 4 001 5 4 3 1 2 1 3

Płeć: 1 mężczyzna, 2 kobieta, 0 nieznana

Choroba: 1 zdrowa(y), 2 chora(y), 0 nieznana 0 zawsze oznacza nieznane/brak danych!!!

Liczba spacji nieistotna (minimum 1)

(58)

!"#$%&'()%"+%,)-.%(../.0%/1-"2+%3+4,5'0627.

**8%%%%%%%%%%9%%:%%%;%%%%<%%%=%%%>%%?%%30@)(1%$."0@3%%!"#$%&'()+,-$%$."/+**

!!"##"#!#!#"#"#$#%

!!"##$#!#!#$#$#"#&

!!"##'#"#$#$#$#"#$

!!"##(#!#!#"#"#'#(

!!"##%#(#'#"#$#"#'

!!"##&#(#'#$#"#$#'

!!"##)#(#'#"#$#"#(

!!"##*#(#'#"#$#"#(

!!"##+#(#'#$#"#$#(

!!"#"!#(#'#$#$#$#' A.")63)%$."0@31%.B3+7B+62

8%C%#)3,1D#$+,.(%(.B#31E%/%,1@%'"#$0%6)4,%,1"$.%6)3+%(.B#3+E%+")%#)3,1D#$+,.(%@04#%/14,)'./+F 9%C%#)3,1D#$+,.(%$.")63)6%.4.G1

:%C%#)3,1D#$+,.(%.67+E%H%.B3+7B+E%I)%3#)%/14,5'06)%/%,1@%(../.*B#)

;%C%#)3,1D#$+,.(%@+,$#E%H%.B3+7B+E%I)%3#)%/14,5'06)%/%,1@%(../.*B#)

<%C%'J)FK%8%C%@5I7B1B3+E%9%C%$.G#),+

L+"4B)%$."0@31%$.062%+"")")%$.")6317M!"#$%E%/%,1@%(../.B#)%@+@1%K* 6))3%"#$&'!7M.(.G1%N$."0@3+%=E%%8%C%B(./1E%9%C%7M.(1O

6))3%".704%@+($)(./1%N$."0@31%>%#%?%"+%.G0%+"")"#%0%$+I*)-.%.4.G3#$+O

P%'"#$0%(../.0%@.I3+%B+'#4+F%./."32%#".QF%"#$%E%3+%),+'#)%'(B1-.,./+3#+%+3+"#B1%@.I3+%/1G(+F*

./."3)%/+%"+%+3+"#B1%/0'03$./)6&%P1-.*3#)%6)4,%B+'#41/+F%"#$&'%7M.(.G1%6+$.%'#)(/4B1&

!"#$ % &'() % 3+")I1 % ,)(+B % '(B)$4B,+J7#F % 3+ % D.(@+, % 7B1,+31 % '(B)B % '.B.4,+J) % '(.-(+@1& % P % ,1@ % 7)"0 **/1$.(B14,06)@1%'(.-(+@%01/##2%/1+627%3+4,5'06272%$.@)3*5**

!"#$%$&'!"#$%&'$(!"#$%&$)((

-B#)%(%")+,)%,.%'(B1-.,./+31%'(B)B%3+%'"#$%,)$4,./1%+%(%")+)-%,.%3+B/+%'"#$0%/13#$./)-.&%R'76+

**!% .B3+7B+E % I) % / % (../.B#) % 3#) % /14,5'062 % '5,") % N'5,") % '.6+/#+62 % 4#5 % 3'& % '(B1 % $.6+(B)3#0**

$()/3#+7B1@OE%6)I)"#%@+@1%'5,")%,.%/'#406)@1%,0%&&%

S4,3#)6)%,)I%'(.-(+@%'.B/+"+6271%3+%-(+D#7B32%)1765%#%@.1D#$+765%(../.T/%B+'#4+317M%/%'"#$+7M

&')%C%'+,(B%L.+,)$%SS&

**34$567&89(9%1!"#$9"'+$.9:"$;$698610$6#."!/**

A.")631%'"#$%,)$4,./1%N&+,O%.'#406) %"#$%% #%4'.4TG%+3+"#B1&%U)-.%D.(@+,%6)4,%.41F%B+-@+,/+31E%+")

**#4,3#)6)%'(.-(+@%6#."!/%'.B/+"+6271%3+%6)-.%'(B1-.,./+3#)&%P%'(.-(+@#)%6#."!/%'.4B7B)-T"3)** .'76)%B@#)3#+%4#5%/1G#)(+627%'.B176)%B%@)30%,)$4,./)-.&%

V$(+3%4,+(,./1%'()'"#3$%/1-"2*+%3+4,5'06+7.K

!"#$%&%'()*+#,+,-

!"#$%&$'(')*"#'+,-./"01234567849:0123"';;-;-"<'='>/)*"!"#$"+%=?@-"A,B">?(-$/)C>,-D"1A.>,-@E

>'A.B#?@E)-"./#/"!"#$

! !"#$" >?(-$%K'>/)*"';;-;,"F('$+-$%K-G"F,%-.*/*0'(!!*!*&GH"AI?J/"=%"+%=%K'>,'"+%=%(,>?@E)/)*

';;-;?G

>#D"#%C,%(?"->C/(?H"KC$%A.?",.#D"

&$?#"+$K,"4XRH"%<-)>,-"$C'=C,-@"A.%A%K'>/D

2"#$%&%'()*+#/%&%'%&3

K,-$AC')* " #;,+? " +%=?@- " A,B " +%;-@>- " %A%</D " V;' " ?#$%AC)C->,' " K'$.% " >' " $%=%K%=C,- " +%;-@>%

#%>?(-$%K'O"%A%</D

8%$('."#;,+?"D#$-"%<@'W>,'"#$%A./"#$C/+I'="#%>,J-@N

(59)

Rodz1 dziadek 0 0 1 1 2 5 Rodz1 babka 0 0 2 2 1 6 Rodz1 matka dziadek babka 2 2 1 2 Rodz1 ojciec 0 0 1 1 3 4 Rodz1 dz1 ojciec matka 1 2 1 3 Rodz1 dz2 ojciec matka 2 1 2 3 Rodz1 dz3 ojciec matka 1 2 1 4 Rodz1 dz4 ojciec matka 1 2 1 4 Rodz1 dz5 ojciec matka 2 1 2 4 Rodz1 dz6 ojciec matka 2 2 2 3

!"#$%&%'()*+#,+,-

!"#$%&$'(')*"#'+,-./"01234567849:0123"';;-;-"<'='>/)*"!"#$"+%=?@-"A,B">?(-$/)C>,-D"1A.>,-@E

>'A.B#?@E)-"./#/"!"#$

! !"#$" >?(-$%K'>/)*"';;-;,"F('$+-$%K-G"F,%-.*/*0'(!!*!*&GH"AI?J/"=%"+%=%K'>,'"+%=%(,>?@E)/)*

';;-;?G

>#D"#%C,%(?"->C/(?H"KC$%A.?",.#D"

&$?#"+$K,"4XRH"%<-)>,-"$C'=C,-@"A.%A%K'>/D

2"#$%&%'()*+#/%&%'%&3

K,-$AC')* " #;,+? " +%=?@- " A,B " +%;-@>- " %A%</D " V;' " ?#$%AC)C->,' " K'$.% " >' " $%=%K%=C,- " +%;-@>%

#%>?(-$%K'O"%A%</D

8%$('."#;,+?"D#$-"%<@'W>,'"#$%A./"#$C/+I'="#%>,J-@N

(60)

1,2 1,1

1,2 2,2

1,2 2,2 2,2 1,2 1,2