• Nie Znaleziono Wyników

Charakterystyka ektosomów uwalnianych przez komórki ludzkiego czerniaka złośliwego

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Charakterystyka ektosomów uwalnianych przez komórki ludzkiego czerniaka złośliwego"

Copied!
115
0
0

Pełen tekst

(1)

Wydział Biologii

Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych

Charakterystyka ektosomów uwalnianych przez komórki ludzkiego czerniaka złośliwego

mgr Magdalena Surman

Rozprawa doktorska wykonana pod opieką dr hab. M ałgorzaty Przybyło, prof. UJ w Zakładzie Biochemii Glikokoniugatów Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych

Kraków 2020

(2)

P ra g n ę s e rd e c z n ie p o d z ię k o w a ć :

P a n i d r h a b . M a ł g o r z a c i e P r z y b y ł o , p r o f . U J , p ro m o to ro w i m oj ej p ra cy , z a s tw o rz e n ie w a ru n k ó w ro z w o ju n a u k o w e g o , p o ś w ię c o n y m i czas, ż y c z liw o ś ć ,

w s z e c h s tro n n ą p o m o c o ra z n ie o c e n io n e w s p a r c ie m e ry to ry c z n e p o d c z a s c a łe g o o k re s u re a liz a c ji n in ie jsz e j p ra c y d o k to rsk ie j.

P a n i d r h a b . D o r o c ie H o j a - Ł u k o w i c z , p r o f . U J o ra z d r M a r c e l i n i e J a n i k , z a w p ro w a d z e n ie m n ie w ta jn ik i p ra c y la b o ra to ry jn e j i h o d o w li k o m ó rk o w e j.

Z e s p o ło w i z Z a k ła d u F iz y k i M e d y c z n e j W y d z ia łu F A IS U J, w sz c z e g ó ln o śc i P a n i d r h a b . E w ie S tę p ie ń , p r o f . U J o ra z A n i D r o ż d ż , z a u m o ż liw ie n ie m i re a liz a c ji cz ę śc i b a d a ń d o n in ie jsz e j p ra c y d o k to rs k ie j, w s p a rc ie m e ry to ry c z n e o ra z c e n n e u w a g i.

Z e s p o ło w i z P ra c o w n i S p e k tro m e trii M a s M a ło p o ls k ie g o C e n tru m B io te c h n o lo g ii, P a n i d r h a b . S y lw ii K ę d r a c k i e j - K r o k , p r o f . U J o ra z d r U r s z u li J a n k o w s k i e j ,

z a p o m o c w re a liz a c ji b a d a ń p ro te o m ic z n y c h .

P r a c o w n i k o m i K o l e ż a n k o m z Z a k ł a d u B io c h e m ii G l i k o k o n i u g a t ó w , w sz c z e g ó ln o ś c i M a r c i e Z ą b c z y ń s k ie j , z a o k a z a n ą p o m o c , ż y c z liw o ś ć o ra z s tw o rz e n ie m iłej a tm o s fe ry p racy .

M a g d a

(3)

S

p i s t r e ś c i

Spis treści 3

W ykaz zastosow anych skrótów 4

Streszczenie 7

A bstract 8

1. W stęp 9

1.1. M ikropęchrzyki błonow e - inform acje ogólne 9

1.2. E ktosom y jak o je d n a z populacji m ikropęchrzyków błonow ych 11

1.2.1. B iogeneza ektosom ów 11

1.2.2. M olekularne cargo ektosom ów 12

1.2.3. F izjologiczna rola ektosom ów oraz ich znaczenie w procesach patologicznych 12

1.3. Znaczenie ektosom ów w progresj i now otw orów 13

1.4. F unkcjonalna rola ektosom ów w progresji czerniaka złośliw ego 15 1.5. Znaczenie glikozylacji białek w biologii m ikropęcherzyków błonow ych 16 1.6. G likozylacja m ikropęcherzyków błonow ych w chorobach now otw orow ych 18 1.7. Z m iany w profilu glikozylacji kom órek czerniaka złośliw ego i uw alnianych przez nie 1 9 m ikropęcherzyków błonow ych

2. Cel pracy, hipotezy i zadania badaw cze 23

3. Prace w chodzące w skład rozpraw y doktorskiej 24

4. O św iadczenia w spółautorów 79

5. D yskusja 89

5.1. O cena m etody wybranej do izolacja ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka 89 5.2. C hrom atografia cieczow a sprzężona ze spektrom etrią m as (LC -M S) jak o podstaw ow a 9 ^ technika służąca charakterystyce białkow ego cargo m ikropęcherzyków błonow ych

5.3. E ktosom y uw alniane przez kom órki czerniaka jak o nośniki białek zw iązanych z 9 3 rozw ojem i progresją now otw oru

5.4. B iałkow e cargo ektosom ów ja k źródło potencjalnych m arkerów czerniaka złośliw ego 95 5.4.1. Identyfikacja klinicznych m arkerów czerniaka w m ikropęcherzykach błonow ych 96 5.4.2. M ikropęcherzyki błonow e jak o nośniki potencjalnych białkow ych m arkerów 9 6 czerniaka

5.4.3. Potencjał diagnostyczny ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka w 9 7 kontekście badań n a poziom ie kom órkow ym i tkankow ym

5.5. E ktosom y uw alniane przez kom órki czerniaka jak o nośniki specyficznych struktur 9 8

cukrow ych

5.5.1. Profil glikozylacji i jeg o znaczenie podczas sortow ania białek do ektosom ów 98 5.5.2. P ow ierzchniow a g likozylacja ektosom ów i jej potencjalne znaczenie w ^ interakcjach z kom órką docelow ą

5.5.3. Ektosom y j ako nośniki struktur cukrow ych charakterystycznych d la czerniaka ^ złośliw ego

6 . Podsum ow anie i w nioski 103

B ibliografia u żyta w e Wstępie i D yskusji 104

(4)

W

y k a z z a s t o s o w a n y c h s k r ó t ó w 1 D -P A G E /

2D -P A G E A R F6 B C R P C A F s C D C P 1 C E A C O X 2/6C E C M E E F 2 E G F E G F R

E M M P R IN E M T E p C A M E R E R K

E S C R T E V s F u c G A B A G al G A N A B G A P D H

G D F 15 G lcN A c G n T - III / G n T -V G O H D G F H F D H IF -1 H M G -1

jedno/dw u-kierunkow a elektroforeza w żelu poliakrylam idow ym (ang. one/tw o dim ensional polyacrylam ide gel electrophoresis)

czynnik uczestniczący w A D P-rybozylacji białek typu 6 (ang. A D P-rybosylation factor 6)

białko oporności raka piersi (ang. breast cancer resistance protein)

fibroblasty tw orzące podścielisko g uza (ang. cancer-associated fibroblasts)

białko zaw ierające dom enę bearcub typ u 1 (ang. C U B -dom ain-containing protein 1) antygen karcinoem brionalny (ang. carcinoem bryonic antigen)

podjednostki 2 i 6C oksydazy cytochrom u c (ang. cytochrom e c oxidase subunits 2 and 6C)

m acierz zew nątrzkom órkow a (ang. extracellular m atrix)

eukariotyczny czynnik elongacyjny typu 2 (ang. eukaryotic elongation factor 2 ) epiderm alny czynnik w zrostu (ang. epiderm al grow th factor)

receptor dla epiderm alnego czynnika w zrostu (ang. epiderm al grow th factor receptor)

zew nątrzkom órkow y czynnik indukujący aktyw ność m etaloproteinaz m acierzy zęw nątrzkom órkow ej (ang. extracellular m atrix m etalloproteinase inducer)

przejście epitelialno-m ezenchym alne (ang. epithelial-m esenchym al transition) cząsteczka adhezyjna kom órek nabłonkow ych (ang. epithelial cell adhesion m olecule)

siateczka śródplazm atyczna (ang. endoplasm ic reticulum )

kinaza regulow ana sygnałem zew nątrzkom órkow ym (ang. extracellular signal­

regulated kinase)

endosom alny kom pleks sortujący w ym agany do transportu pęcherzyków (ang.

endosom al sorting com plex required fo r transport) m ikropęcherzyki błonow e (ang. extracellular vesicles) fukoza (ang. fucose)

kw as y-am inom asłow y (ang. y-am inobutyric acid) galaktoza (ang. galactose)

podjednostka a glukozydazy II (ang. glucosidase II a subunit)

dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynow ego (ang. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

prekursorow e białko dla czynnika różnicow ania w zrostu ty pu 15 (ang.

grow th/differentiation factor 15 precursor protein) A -acetyloglukoazam ina (ang. A -acetyloglucosam ine)

A -acetyloglukazoam inotransferaza III / V (ang. A -acetylglucosam inyltransferase III / V)

analiza ontologiczna genów (ang. gene onotology)

czynnik w zrostu pochodzący z w ątrobiaka (ang. hepatom a-derived grow th factor) dializa filtracyjna pod ciśnieniem hydrostatycznym (ang. hydrostatic filtration dialysis)

czynnik indukow any hipoksją typ u 1 (ang. hypoxia-inducible factor 1) białko o w ysokiej ruchliw ości ty pu 1 (ang. high m obility group protein 1)

(5)

H N R N P A 2B 1

H P L C H sp IM P D H 2 L 1 C A M L A M P L C -M S /M S L D H L G A L S 3 B P L IM K M A G E A 4 /B 2

M A R T -1 M C A M M D R M H C I

M IA M L C K M M P M R P 1 M V B N euN A c N T A P A I-I / P A I-II P I3 K P M E L

P P P 2 R 1 A PS

R O C K SAA S E C S er T A C A T E M

heterogenna jąd ro w a rybonukleoproteina A2/B1 (ang. nuclear ribonucleoprotein A 2/B 1)

w ysokospraw na chrom atografia cieczow a (ang. high perform ance liquid chrom atography)

białko szoku cieplnego (ang. heat shock protein)

dehydrogenaza 2 inozyno-5'-m onofosforanu (ang. inosine-5'-m onophosphate dehydrogenase 2 )

neuronalna cząsteczka adhezyjna L1 (ang. L1 cell adhesion m olecule)

białko zw iązane z b ło ną lizosom ów (ang. lysosom e-associated m em brane protein ) chrom atografia cieczow a sprzężona z tandem o w ą spektrom etrią m as (ang. liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry)

dehydrogenaza m leczanow a (ang. lactate dehydrogenase) białko w iążące galektynę 3 (ang. galectin-3-binding protein) kinaza LIM (ang. LIM kinase)

antygeny zw iązane z czerniakiem ty p u 4 i B2 (ang. m elanom a-associated antigens 4/B 2)

antygen czerniaka rozpoznaw any przez lim focyty T (ang. m elanom a antigen recognized by T-cells)

cząsteczka adhezyjna kom órek czerniaka (ang. m elanom a cell adhesion m olecule) oporność w ielolekow a (ang. m ultidrug resistance)

głów ny kom pleksu zgodności tkankow ej klasy I (ang. m ajo r histocom patibility com plex class I)

białko regulatorow e pochodzące z czerniaka (ang. m elanom a inhibitory activity protein or m elanom a-derived grow th regulatory protein)

kinaza łańcuchów lekkich m iozyny (ang. m yosin light chain kinase)

m etaloproteinaza m acierzy zew nątrzkom órkow ej (ang. m atrix m etalloproteinases) białko oporności w ielolekow ej (ang. m ultidrug resistance protein 1)

ciałko w ielopęcherzykow e (ang. m ultivesicular body)

kw as A -acetyloneuroam inow y (sialow y) (ang. A -acetylneuram inic acid or sialic acid)

analiza ruchu nanocząstek (ang. N anoparticle Tracking A nalysis)

inhibitory aktyw atorów plazm inogenu typu I i II (ang. plasm inogen activator inhibito r type 1 and 2 )

kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (ang. phosphoinositide 3-kinase) białko m elanocytów P M E L (ang. prem elanosom e protein)

izoform a a 65 k D a regulatorow ej podjednostki A seryno-treoninow ej fosfatazy białkow ej 2A (ang. serine/threonine-protein phosphatase 2A 65 k D a regulatory subunit A a isoform )

fosfatydyloseryna (ang. phosphatidylserine)

R ho-zależna kin aza (ang. R ho-associated coiled-coil containing protein kinase) surow iczy am yloid A (ang. serum am yloid A)

chrom atografia w ykluczania zależnego od w ielkości cząsteczek (ang. size exclusion chrom atography)

seryna (ang. serine)

antygen cukrow y zw iązany z now otw orem (ang. tum or-associated carbohydrate antigen)

transm isyjn a m ikroskopia elektronow a (ang. transm ission electron m icroscopy)

(6)

T F T G F -ß T h r T IM P 3 T N F -a tP A T R A IL u P A u P A R

V A M P -3 V E G F

V E G F R 1

czynnik tkankow y (ang. tissue factor)

transform ujący czynnik w zrostu ß (ang. transform ing grow th factor ß) treo nina (ang. threonine)

tkankow y inhibitor m etaloproteinaz typu 3 (ang. tissue inhibitor o f m etalloproteinase 3)

czynnik m artw icy now otw oru a (ang. tu m o r necrosis factor)

tkankow y aktyw ator plazm inogenu (ang. tissue plasm inogen activator)

ligand czynnika m artw icy now otw oru indukujący apoptozę (ang. tu m o r necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)

urokinazow y aktyw ator plazm inogenu (ang. urokinase type plasm inogen activator) receptor d la urokinazow ego aktyw atora plazm inogenu (ang. urokinase plasm inogen activator receptor)

białko zw iązane z błoną pęcherzyków typ u 3 (ang. vesicle-associated m em branę protein 3)

czynnik w zrostu śródbłonka naczyń krw ionośnych (ang. vascular endothelial grow th factor)

receptor dla czynnik w zrostu śródbłonka naczyń krw ionośnych typ u 1 (ang. vascular endothelial grow th factor receptor 1)

(7)

S

t r e s z c z e n i e

C zerniak złośliw y je s t agresyw nym now otw orem charakteryzującym się szybkim tem pem w zrostu i w czesnym pojaw ianiem się przerzutów . M iędzykom órkow y tran sfer bioaktyw nych cząsteczek zachodzący za pośrednictw em m ikropęcherzyków błonow ych (EVs) je s t jed n y m z czynników sprzyjających progresji now otw oru. Ektosom y, będące je d n ą z subpopulacji EVs, m o gą przenosić kw asy nukleinow e, lipidy oraz białka. Zatem badania dotyczące identyfikacji składników cargo ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka oraz w pływ u w yw ieranego przez nie na kom órki docelow e m ogą przyczynić się do lepszego poznania m olekularnych m echanizm ów progresji czerniaka.

C elem niniejszej pracy było w ykonanie pierw szej proteom icznej i glikom icznej analizy białkow ego cargo ektosom ów uw alnianych przez cztery linie kom órkow e czerniaka skóry (w yprow adzone ze zm ian pierw otnych: W M 115 i W M 793, oraz m etastatycznych: W M 266-4 i W M 1205L u) oraz linię kom órkow ą czerniaka gałki ocznej (M el202). E ktosom y w yizolow ano z kondycjonow anych pożyw ek m etodą w irow ania różnicow ego. N astępnie, stosując chrom atografię cieczow ą sprzężoną z tandem ow ą spektrom etrią m as (LC -M S/M S), zidentyfikow ano w poszczególnych próbkach od 936 do 1055 białek.

E ktosom y były nośnikam i w spólnego zbioru białek, głów nie błonow ych i cytoplazm atycznych, co w ynika z m echanizm u ich biogenezy, a także białek charakterystycznych (różnicujących) dla poszczególnych linii kom órkow ych czerniaka. W śród zidentyfikow anych białek obecne były te 0 udokum entow anej roli w inw azji i m igracji kom órek now otw orow ych, angiogenezie oraz tw orzeniu niszy prem etastatycznej, ja k rów nież b iałk a antyapoptotyczne, m odulujące odpow iedź im m unologiczną czy odpow iedzialne za oporność w ielolekow ą. W testach funkcjonalnych (test żyw otności A lam ar Blue 1 test gojenia ran) obecność ektosom ów stym ulow ała proliferację i prom ow ała m igrację docelow ych kom órek, a efekt ten zależny był od daw ki białek ektosom alnych.

S tosując lektynoblotting w ykazano w zbogacenie ektosom ów w A -glikany posiadające przedzielające cząsteczki G lcN A c, reszty fukozy oraz a2,6-w iązane kw asy sialow e, a preferencyjna inkorporacja tych struktur w skazuje n a ich rolę podczas sortow ania białek do ektosom ów . N a pow ierzchni ektosom ów stw ierdzono w yso ką ekspresję ß 1 ,6 -ro zg a^zio n y ch A -glikanów typu kom pleksow ego, przedzielającej G lcN A c, a także a2 ,6-w iązanych kw asów sialow ych. N iem niej jed n ak procent ektosom ów w ykazujących pow ierzchniow ą ekspresję w ybranych epitopów cukrow ych był niższy niż w przypadku uw alniających je kom órek czerniaka.

U zyskane w yniki dostarczyły w stępnych inform acji n a tem at roli w ybranych białek i struktur cukrow ych w biologii ektosom ów (biogenezie, sortow aniu białek oraz interakcjach z kom órkam i docelow ym i) oraz funkcjonalnego w pływ u ektosom ów n a kom órki now otw orow e. W ektosom alnym cargo zidentyfikow ano rów nież potencjalne m arkery czerniaka, a m ożliw ość ich w ykorzystania w praktyce klinicznej pow inna stać przedm iotem przyszłych badań.

(8)

A

b s t r a c t

M alignant m elanom a is an aggressive type o f cancer characterized by rapid grow th and early m etastasis. Intercellular transfer o f bioactive m olecules by extracellular vesicles (EV s) is one o f the factors affecting tu m o r progression. E ctosom es are subpopulation o f EV s and facilitate the transfer o f num erous proteins, lipids and nucleic acids. Therefore, studies on ectosom es released by m elanom a cells and on th eir effect exerted on recipient cells are im portant to b etter understand the m echanism s o f m elanom a progression.

The aim o f this study w as the first proteom ic and glycom ic analysis o f ectosom es released by four cutaneous m elanom a cell lines (derived from prim ary lesions: W M 115 and W M 793, and m etastatic sites: W M 266-4 and W M 1205L u) and uveal m elanom a cells (M el202). Ectosom es w ere isolated from conditioned m edia by differential centrifugation. Then, using liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry (LC-M S / M S), from 936 to 1055 proteins w ere identified in individual ectosom e sam ples. Ectosom es w ere carriers o f a com m on set o f proteins (m ainly m em brane and cytoplasm ic, w hat reflects the m echanism o f th eir biogenesis w ithin the cell m em brane) as w ell as differentiating proteins for given m elanom a cell lines. M ultiple cancer-related proteins w ere also identified in ectosom es, including those involved in the invasion and m igration o f cancer cells, angiogenesis, prem etastatic niche form ation, escape from apoptosis, m odulation o f the im m une response and m ultidrug resistance. In functional tests (A lam ar Blue cell viability assay and w ound healing assay) ectosom es stim ulated cell proliferation and m igration, and the observed effect w as dependent on the dose o f ectosom al proteins.

L ectinblotting revealed the enrichm ent o f ectosom es in N -glycans having the bisecting G lcN A c m olecules, fucose residues and a2 ,6-bound sialic acids, and the preferential incorporation o f these structures indicates th eir im portance in the process o f protein sorting into ectosom es. On the other hand, cytom etric analysis revealed high expression o f com plex type ß1,6-branched N -glycans, bisecting G lcN A c, as w ell as a2,6-bound sialic acid on the surface o f ectosom es. In addition, the percentages o f ectosom es positively stained for given glycoepitopes w ere low er in com parison to referential staining o f m elanom a cells.

The obtained results provided basic inform ation concerning the role o f particular proteins and glycan structures in ectosom e biology (biogenesis, protein sorting and interactions w ith target cells), and the functional effects exerted by m elanom a-derived ectosom es. Potential m elanom a m arkers have also been identified in the ectosom al cargo, and the possibility o f th eir use in clinical practice should be the subject o f future research.

(9)

1. W

s t ę p

1.1. M i k r o p ę c h r z y k i b ło n o w e - i n f o r m a c j e o g ó ln e

Rozwój i progresja czerniaka złośliw ego zachodzi w ieloetapow o, a tow arzyszą tem u m iedzy innym i zm iany w kom unikacji m iędzykom órkow ej i m ikrośrodow isku guza. Z m iany te są efektem działania szeregu czynników , w tym też cząsteczek transportow anych za pośrednictw em m ikropęcherzyków błonow ych (EVs, ang. extracellular vesicles) [1-3]. EV s to niew ielkie koliste struktury, otoczone fosfolipidow ą błoną i uw alniane do przestrzeni pozakom órkow ej przez w iększość typów kom órek zarów no w w arunkach fizjologicznych, ja k i w stanach patologicznych. Z a ich głów n ą funkcję uznaje się transport bioaktyw nych cząsteczek - białek, lipidów i kw asów nukleinow ych, m iędzy dow olnym i, niesąsiadującym i kom órkam i organizm u, a przez to m odulow anie zachodzących w kom órkach docelow ych procesów biologicznych, w tym ekspresji genów , biosyntezy białek, przebiegu szlaków m etabolicznych oraz sygnalizacji w ew nątrzkom órkow ej [4-5].

N a podstaw ie różnic w w ielkości, gęstości i m echanizm ie biogenezy, oraz obecności specyficznych cząsteczek m arkerow ych, najczęściej w yróżnia się trzy populacje EVs: ektosom y, egzosom y oraz ciałka apoptotyczne (R ycina 1). Ich biogeneza obejm uje tw orzenie uw ypukleń w błonie kom órkow ej (ektosom y) lub w błonach przedziałów endosom alnych (egzosom y), a w przypadku ciałek apoptotycznych - otoczenie b łoną kom órkow ą fragm entów cytoplazm y zaw ierających chrom atynę i funkcjonalne organella podczas apoptozy. P oza m echanizm em biogenezy, głów nym kryterium klasyfikacji EV s je s t ich w ielkość. Średnica egzosom ów w aha się w zakresie 30-100 nm. Bardziej heterogenną populację stanow ią ektosom y (0 ,1 - 1 pm ), natom iast średnica ciałek apoptotycznych m oże w ynosić od 1 do 5 pm [3,5].

O ddziaływ anie EV s n a kom órki docelow e zależy bezpośrednio od ich m olekularnego cargo, które to z kolei uw arunkow ane je s t typem uw alniającej EV s kom órki. T ransfer w ybranych cząsteczek do kom órki docelow ej m oże opierać się n a zasadzie interakcji ligand-receptor, fuzji m ikropęcherzyka z b łoną kom órki docelow ej lub jeg o endocytozie [4,5]. W w yniku w spom nianych interakcji, EVs poprzez przenoszone cargo m o gą w pływ ać n a przebieg procesów życiow ych kom órki w stanach fizjologicznych oraz patologicznych [1-3].

U form ow ane EV s są uw alniane do przestrzeni pozakom órkow ej, co um ożliw ia ich izolację z w iększości płynów ustrojow ych (m.in. m oczu, krwi, płynu m ózgow o rdzeniow ego czy śliny) lub kondycjonow anej pożyw ki w przypadku hodow li kom órkow ych in vitro [6-8]. N ajczęściej stosow aną m eto dą izolacji je s t w irow anie różnicow e, gdzie zastosow ana w zględna siła odśrodkow a determ inuje rozm iar izolow anych (sedym entujących) EV s [9,10]. M odyfikację tej m etody stanow i w irow anie w gradiencie gęstości (najczęściej sacharozy), które bazuje nie tylko n a różnicach w w ielkości izolow anych EVs, ale także n a ich zm iennej gęstości [11,12]. K olejną m etodą izolacji EV s je s t chrom otografia w ykluczeniow a (SEC, ang. size exclusion chrom atography), bazująca n a zależnym od rozm iaru EV s czasie retencji w kolum nie chrom atograficznej [13]. Do izolacji w ykorzystuje się rów nież

(10)

pow inow actw o w ybranych cząsteczek obecnych n a pow ierzchni EV s do odpow iednich ligandów , najczęściej przeciw ciał (tzw. im m unocapture) [14]. O statnia z m etod izolacji EV s w ykorzystuje filtry o określonej w ielkości porów , które zatrzym ują EVs, podczas gdy nadm iar płynów ustrojow ych lub pożyw ki zostaje usunięty m anualnie (np. przy użyciu filtrów strzykaw kow ych) lub pod ciśnieniem hydrostatycznym (HFD, ang. hydrostatic filtration dialysis) [15,16].

Rycina 1. P orów nanie trze ch g łów nych p o pulacji m ikropęcherzyków błonow ych: egzosom ów , ektosom ów i ciałek apoptotycznych, p o d w zględem w ielkości, m echanizm u biogenezy, składu i cząsteczek m arkerow ych.

W p o w iększeniu - przy k ład m olekularnego cargo typow ego ektosom u. A R F 6 - czynnik uczestniczący w A D P- rybozylacji białek, E G F R - recep to r dla epiderm alnego czynnika w zrostu, E R - retikulum endoplazm atyczne, L A M P-1 - białk o zw iązane z b ło n ą lizosom ów ty p u 1, M M P s - m etaloproteinazy m acierzy zew nątrzkom órkow ej, PS - fosfatydyloseryna, u P A - urokinazow y akty w ato r plazm inogenu, V A M P-3 - białko zw iązane z b ło n ą p ęcherzyków ty p u 3, V E G F - czynnik w zro stu śródbłonka n aczy ń krw ionośnych.

B iodostępność, łatw ość izolacji oraz szeroki zakres aktyw ności biologicznej spow odow ały, że EVs stały się w ostatnich latach obiektem licznych badań spraw dzających m ożliw ość ich w ykorzystania do celów diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych. Zm iany w liczbie uw alnianych EV s oraz szereg z w ystępujących n a ich pow ierzchni cząsteczek m ają charakter sw oistych m arkerów [17].

(11)

N atom iast ich w łaściw ości biologiczne (niska im m unogenność), fizyczne (niew ielkie rozm iary) i chem iczne (m ożliw ość dostarczania cząsteczek o charakterze terapeutycznym ) pozw alają n a ich w ykorzystanie jak o system ów dostarczania leków [18,19].

1.2. E k t o s o m y j a k o j e d n a z p o p u l a c j i m i k r o p ę c h r z y k ó w b ło n o w y c h 1.2.1. B io g en eza ektosom ów

Form ow anie ektosom ów w ym aga zm ian w asym etrii dw uw arstw y lipidow ej i reorganizacji cytoszkieletu. W efekcie aktyw acji kom órki przez różnych agonistów (np. A TP, czynniki w zrostu, cytokiny), dochodzi do uw alniania jo n ó w C a2+ z siateczki śródplazm atycznej i w zrostu ich stężenia w cytozolu, co pow oduje zm iany w aktyw ności translokaz odpow iedzialnych za przenoszenie lipidów w obrębie dw uw arstw y. N a skutek aktyw acji flopazy i skram blazy, fosfatydyloseryna i fosfatydyloetanolam ina przenoszone są z w ew nętrznej do zewnętrznej w arstw y błony kom órkow ej, a rów noczesna inhibicja flipazy uniem ożliw ia ponow ną ich relokację [3,20,21].

W zrost stężenia jo n ó w C a2+ w cytozolu pow oduje rów nież w zrost aktyw ności dw óch proteaz - kalpainy i gelsoliny, zdolnych do degradacji elem entów cytoszkieletu. W reorganizacji cytoszkieletu podczas uw alniania ektosom ów bierze rów nież udział białko R hoA, należące do rodziny GTP-az.

Poprzez aktyw ację dw óch kinaz - R ho-zależnej kinazy (R O C K , ang. R ho-associated coiled-coil containing protein kinase) i kinazy LIM (LIM K, ang. LIM kinase), R hoA pow oduje fosforylację kofiliny i zm iany w strukturze filam entów aktynow ych i m iozynow ych. Podobne działanie w ykazuje rów nież czynnik uczestniczący w A D P-rybozylacji białek (A R F6, ang. A D P -ribosylation factor 6).

A R F6 aktyw uje b iałka z rodziny kinaz regulow anych sygnałem zew nątrzkom órkow ym (ERK, ang.

extracellular signal-regulated kinases), w tym kinazę łańcuchów lekkich m iozyny (M LCK, ang. m yosin light chain kinase), pow odując polim eryzację aktyny i fosforylację łańcuchów lekkich m iozyny [3,20,21].

N a skutek zm ian w strukturze dw uw arstw y lipidow ej i organizacji cytoszkieletu, dochodzi do u w ypuklenia (pączkow ania, ang. blebbing) w ybranych fragm entów błony kom órkow ej. Dzięki aktyw ności skurczowej cytoszkieletu, uform ow any ektosom zostaje uw olniony z pow ierzchni kom órki (ang. shedding) do przestrzeni pozakom órkow ej. U w alnianie ektosom ów prow adzi do utraty m ateriału błonow ego. U bytki te są uzupełniane przez rekrutow ane do pow ierzchni kom órki w ew nątrzkom órkow ych pęcherzyków nieprzeznaczonych do sekrecji, które to uzupełniają ubytki lipidów , a ponadto transp ortują now o syntetyzow ane białka do błony, przez co przyczyniają się do dynam icznych zm ian w m olekularnym składzie aktualnie uw alnianych ektosom ów [3,20,21].

D la porów nania, biogeneza egzosom ów zw iązana je s t z w yznakow aniem ubikw ityną w ybranych fragm entów błony przez białka endosom alnego kom pleksu sortującego w ym aganego do transportu pęcherzyków (ESC R T, ang. endosom al sorting com plex required for transport) i ich internalizacją do w czesnych endosom ów . W czesne endosom y zaw ierające now opow stałe egzosom y są nazyw ane ciałkam i w ielopęcherzykow ym i (M VB, ang. m ultivesicular bodies), a po ich fuzji z b łoną kom órkow ą

(12)

następuje uw olnienie egzosom ów do przestrzeni pozakom órkow ej [22]. C iałka apoptotyczne pow stają w yłącznie podczas procesu apoptozy, kiedy to dochodzi do dezintegracji całej zaw artości kom órki, a jej fragm enty po otoczeniu błoną są uw alniane w postaci pęcherzyków . G łów ną cechą odróżniającą ciałka apoptotyczne od pozostałych populacji EV s je s t obecność w nich organelli kom órkow ych [23].

1.2.2. M o le k u la rn e cargo ektosom ów

E ktosom y pow stają w obszarach błony kom órkow ej zaw ierających duże ilości cholesterolu, tj.

tratw ach lipidow ych, i posiadają b iałka z nim i zw iązane m .in. flotylinę 1, czynnik tkankow y (TF, ang.

tissue factor) oraz specyficzne m arkery pow ierzchniow e uw alniającej je kom órki. Struktura lipidow a błon ektosom ów je s t ponadto w zbogacona w sfingom ielinę, ceram idy, a także fosfatydyloserynę, przenoszoną z w ew nętrznej do zew nętrznej w arstw y błony kom órkow ej podczas form ow ania ektosom ów . B iałkam i pow szechnie w ystępującym i w ektosom ach są integryny oraz m etaloproteinazy.

E ktosom y m ogą przenosić też ligand dla P-selektyny, białka szoku cieplnego, cytokiny, chem okiny oraz czynniki w zrostu (epiderm alny, śródbłonka naczyń, fibroblastów ). E ktosom y charakteryzują się rów nież bogatą zaw artością kw asów nukleinow ych, głów nie m icroR N A , ale rów nież m R N A i niekodujących R N A [3].

1.2.3. F izjologiczna rola ektosom ów oraz ich zn a cze n ie w p ro cesa ch p a tolo giczn ych

EV s zostały po raz pierw szy opisane przez W o lfa w 1967 roku [24]. U żyw ając term inu „pył p ły tko w y” (ang. „platelet dust”) opisał on ektosom y uw alniane przez płytki krw i. Jednak przez dekady podobne struktury traktow ane były jak o zbędny m ateriał kom órkow y (ang. cellular debris). Dopiero w ostatnich latach b adania potw ierdziły ich funkcjonalną rolę w kom unikacji m iędzykom órkow ej oraz w regulacji szeregu zarów no fizjologicznych, ja k i patologicznych procesów zachodzących w kom órkach.

Jak dotąd najw ięcej badań przeprow adzono n a ektosom ach obecnych w e krw i, uw alnianych przez m .in. erytrocyty, płytki krw i, neutrofile czy m akrofagi. Z a ich głów n ą funkcję uznaje się stym ulację procesu krzepnięcia krw i zw iązaną z transportem TF [25] i czynnika X II krzepnięcia [26], oraz ekspozycji anionow ych fosfolipidów (głów nie fosfatydyloseryny) w zewnętrznej w arstw ie błony ektosom ów pochodzenia płytkow ego, do których agregują dodatnio naładow ane dom eny białek tw orzących skrzep [25]. Obecne w układzie krążenia ektosom y m o gą rów nież regulow ać odpow iedź im m unologiczną organizm u, a w yw ierany przez nie efekt m oże być zarów no p ro - [27], ja k i przeciw zapalny [28,29]. Zależy to od rodzaju transportow anych przez nie cytokin i receptorów dla chem okin. Co w ięcej, ektosom y m og ą stym ulow ać syntezę różnego rodzaju cytokin w kom órkach docelow ych. E fekt niezależny od cytokin zaobserw ow ano natom iast w przypadku ektosom ów transportujących ligand FasL, który indukuje apoptozę kom órek układu odpornościow ego [30].

W ykazano rów nież, że ektosom y uw alniane przez neutrofile są zdolne do opsonizacji bakterii, co um ożliw ia ich późniejsze rozpoznanie przez kom órki fagocytujące [31].

W e w szystkich populacjach EV s zidentyfikow ano rów nież b iałka charakterystyczne dla chorób

(13)

neurodegeneracyjnych: choroby A lzheim era (ß-am yloid i białko tau), choroby P arkinsona (a-synukleina), pląsaw icy H untingtona (huntingtyna) oraz stw ardnienia zanikow ego bocznego (białko TD P-43) [32]. K rytyczna dla transportu w ym ienionych białek je s t populacja ektosom ów . Ektosom y uw alniane przez kom órki m ikrogleju przenoszą znacznie w iększe ilości b iałk a tau niż egzosom y [33], a nierozpuszczalna form a ß-am yloidu je s t w ektosom ach konw ertow ana do jeg o neurotoksycznej rozpuszczalnej form y [34]. Ponadto, w ektosom ach uw alnianych przez kom órki m ikrogleju potw ierdzono obecność anandam idu, psychoaktyw nego zw iązku z grupy kannabinoidów [35]. Zw iązek ten inhibuje uw alnianie kw asu y-am inom asłow ego (G A BA , ang. y-am inobutyric acid) w obrębie synapsy, czego następstw em je s t utrzym yw anie się stanu pobudzenia kom órek nerw ow ych i zw iększona pobudliw ość u pacjentów neurologicznych.

E ktosom y pełnią rów nież istotną rolę podczas regeneracji tkanek [36,37]. Po ich uw olnieniu przez kom órki uszkodzonej tkanki, ektosom y stym ulują m igrację i różnicow anie kom órek m acierzystych w m iejscu uszkodzenia [38]. Z drugiej strony, kom órki m acierzyste uw alniają ektosom y ham ujące apoptozę kom órek uszkodzonej tkanki [39] oraz regulujące syntezę cytokin przez kom órki dendrytyczne, efektorow e lim focyty T i kom órki N K (ang. natural killer cells), odpow iadające za odczyn zapalny w m iejscu uszkodzenia [36]. Ponadto, endotelialne kom órki m acierzyste uw alniają ektosom y w zbogacone w czynniki proangiogenne (głów nie jak o m R N A i m iR N A ), stym ulujące rew askularyzację uszkodzonych tkanek [40]. W łaściw ość ta czyni ektosom y potencjalnym celem w terapiach schorzeń zw iązanych z uszkodzeniem naczyń krw ionośnych [41,42].

1.3. Z n a c z e n ie e k to s o m ó w w p r o g r e s j i n o w o tw o r ó w

W szystkie populacje EV s m ogą być uw alnianie zarów no przez kom órki praw idłow e, ja k i kom órki przechodzące transform ację now otw orow ą. W porów naniu do ogrom nej liczby danych dotyczących znaczenia egzosom ów w procesie karcynogenezy, w iedza n a tem at ektosom ów pochodzenia now otw orow ego je s t w ciąż ograniczona. N iem niej jednak, stale rosnąca liczba badań nad tą populacją EV s potw ierdza ich funkcjonalną rolę n a różnych etapach progresji now otw oru oraz ich potencjał diagnostyczno-terapeutyczny.

U w alnianie ektosom ów przez kom órki now otw orow e zostało opisane po raz pierw szy w 1978 roku w badaniach z w ykorzystaniem hodow li tkankow ej guzów ze śledziony i w ęzłów chłonnych od pacjentów z chłoniakiem H odgkina [43]. W późniejszych latach u pacjentów z glejakiem w ielopostaciow ym [44], niedrobnokom órkow ym rakiem płuc [45] i szpiczakiem m nogim [46]

zaobserw ow ano w zrost liczby ektosom ów w e krw i obw odow ej. Z drugiej strony spadek liczby uw alnianych ektosom ów zaobserw ow ano u pacjentów z rakiem okrężnicy [47]. Tak w ięc zm iany w liczbie uw alnianych ektosom ów w ydają się być bezpośrednio zw iązane z typem now otw oru.

U w alnianie EVs, w tym ektosom ów , uznaw ane je s t rów nież za jed en z niegenetycznych m echanizm ów sprzyjających fenotypow ej transform acji kom órek now otw orow ych. B adania z w ykorzystaniem kom órek glejaka w ykazały, że uw alniane przez nie ektosom y tran spo rtu ją onkogenną w ersję receptora

(14)

dla epiderm alnego czynnika w zrostu (EG FR vIII, ang. epiderm al grow th factor receptor vIII) do nieinw azyjnych kom órek, czego efektem je s t ich w zm ożona proliferacja i nabyw anie fenotypu m ezenchym alnego [48].

B ioaktyw ne cargo ektosom ów m oże rów nież regulow ać proliferację, m igrację i inw azję kom órek now otw orow ych, a także proces angiogenezy i tw orzenie niszy prem etastatycznej. EV s są przede w szystkim nośnikam i białek biorących udział w degradacji m acierzy zew nątrzkom órkow ej (ECM , ang.

extracellular m atrix), głów nie m etaloproteinaz (M M Ps ang. m atrix m etalloproteinases) [49-54]

i adam alizyn [55], a także endogennych regulatorów ich aktyw ności: C D147 [56], urokinazow ego aktyw atora plazm inogenu (uPA, ang. urokinase plasm inogen activator) [53] czy serpiny B2 [57].

D otychczas obecność i aktyw ność proteolityczną M M P-2 i M M P-9 zaobserw ow ano w ektosom ach uw alnianych m .in. przez kom órki w łókniakom ięsaka [49], raka ja jn ik a [50], piersi [51], prostaty [52,53]

i płuc [54], a także przez kom órki podścieliska g u za (fibroblasty) [52].

A ktyw ność M M Ps w obrębie E C M je s t kluczow a zarów no d la m igracji i inw azji kom órek now otw orow ych, ja k rów nież dla procesu angiogenezy. Do innych czynników proangiogennych zidentyfikow anych w ektosom ach i m ających udokum entow any w pływ n a kom órki śródbłonka naczyń w w arunkach in vitro, zalicza się też czynnik w zrostu śródbłonka naczyniow ego (VEGF, ang. vascular endothelial grow th factor) [58,59], interleukinę 6 (IL -6) [59], transform ujący czynnik w zrostu ß (TG F-ß, ang. transform ing grow th factor ß) [60], sfingom ielinę [61] oraz cząsteczki m iR -1246 [60].

W w arunkach in vivo ektosom y uw alniane przez kom órki now otw orow e zw iększają m obilizację kom órek endotelialnych i gęstość sieci naczyniow ej g uza u m yszy, a efekt ten znosi uprzednia inkubacja ektosom ów z przeciw ciałam i anty-V EG F [62].

E ktosom y prom ują rów nież stan prokoagulacyjny, typow y dla progresji now otw oru. W ykazano, że ektosom y uw alniane w obecności trom biny przez kom órki neuroblastom y indukow ały agregację płytek krw i [63]. Co w ięcej, ektosom y pochodzenia now otw orow ego przenoszą cząsteczki CD41 i P -selektynę - specyficzne ligandy aktyw ow anych płytek krw i, prom ujące adhezję kom órek now otw orow ych do śródbłonka naczyń krw ionośnych i tw orzenie skrzepu [64,65]. W ektosom ach obserw uje się rów nież zw iększoną ekspresję TF, a jeg o poziom został skorelow any ze stopniem agresyw ności różnych linii kom órkow ych raka piersi [6 6].

EV s uczestniczą rów nież w ucieczce kom órek now otw orow ych spod nadzoru im m unologicznego.

Zaobserw ow ano m iędzy innym i ich działanie chem otaktyczne w zględem granulocytów , lim focytów i m akrofagów , co m oże stanow ić m echanizm , dzięki którem u kom órki odpornościow e w ykazujące aktyw ność przeciw now otw orow ą nie grom adzą się w obrębie gu za [67]. Ektosom y pochodzenia now otw orow ego m ogą rów nież ham ow ać różnicow anie m onocytów w kom órki dendrytyczne prezentujące antygen [6 8] lub prozapalne m akrofagi ty pu M1 [69]. Co w ięcej, ektosom y stym ulują syntezę przeciw zapalnych cytokin np. TG F-ß, ham ując w efekcie aktyw ność lim focytów T cytotoksycznych [6 8]. Im m unosupresyjny efekt nie je s t jed n ak obserw ow any w przypadku w szystkich

(15)

z hodow li różnych liniach kom órkow ych raka trzustki, okrężnicy i płuca indukow ały syntezę prozapalnych cytokin (IL-12 oraz czynnika m artw icy now otw oru a (TN F-a, ang. tu m o r necrosis factor)) oraz reaktyw nych form tlenu przez m akrofagi ty pu M1 [70].

E ktosom y pochodzenia now otw orow ego są rów nież nośnikiem białek zw iązanych z opornością w ielolekow ą - P-glikoproteiny oraz b iałk a oporności w ielolekow ej (M RP1, ang. m ultidrug resistance protein 1). Ektosom alny transfer obu białek z opornych na chem ioterapię kom órek białaczki m ieloidalnej, zm niejszał skuteczność terapii w przypadku inkubow ania kom órek linii w rażliw ych na leki z ektosom am i [71]. E ktosom y m og ą rów nież bezpośrednio uczestniczyć w usuw aniu chem ioterapeutyków z kom órek now otw orow ych. W ykazano, że kom órki raka piersi traktow ane doksorubicyną akum ulow ały, a następnie usuw ały lek za pośrednictw em ektosom ów [72]. W zw iązku z pow yższym , inhibicja procesu uw alniania ektosom ów oraz innych populacji EV s, m oże w niektórych przypadkach zw iększać skuteczność stosow anych terapii antynow otw orow ych. W przypadku kom órek raka prostaty traktow anych kalpeptyną (inhibitorem kalpainy, k tó ra to bierze udział w biogenezie ektosom ów ) zaobserw ow ano w zrost ich w rażliw ości n a docetaksel [73].

1.4. F u n k c j o n a l n a r o l a e k to s o m ó w w p r o g r e s j i c z e r n i a k a z ło ś liw e g o

C zerniak złośliw y to jed en z najbardziej agresyw nych now otw orów , charakteryzujący się szybkim w zrostem i w czesnym tw orzeniem przerzutów . Liczba diagnozow anych rokrocznie przypadków stale rośnie, a śm iertelność, pom im o rozw oju now oczesnych terapii, je s t nadal bardzo w ysoka [74].

N ow o tw ór ten diagnozow any je s t najczęściej ju ż po w ystąpieniu przerzutów , kiedy to rokow ania i szanse n a w yleczenie znacząco m aleją. W zw iązku z pow yższym , b adania dotyczące EVs, w tym ektosom ów , uw alnianych przez kom órki czerniaka oraz ich w pływ u n a kom órki docelow e są cenne w kontekście lepszego poznania m echanizm ów tow arzyszących progresji czerniaka.

Już w latach 80. X X w ieku zaobserw ow ano, że ektosom y uw alniane przez linie kom órkow e czerniaka po internalizacji przez kom órki o mniej inw azyjnym fenotypie zw iększały ich potencjał m etastatyczny [75]. B adania nad tą populacją EV s w znow iono niedaw no, w ykazując dw ukrotnie w yższą liczbę ektosom ów uw alnianych in vitro przez kom órki czerniaka w porów naniu do m elanocytów [76]. W porów naniu do m elanocytów , ektosom y przenoszą rów nież więcej TF inicjującego stan prokoagulacyjny [76]. Ponadto, m og ą one prom ow ać inw azję i tw orzenie przerzutów przez kom órki czerniaka poprzez transfer m etaloproteinaz i/lub ich endogennych aktyw atorów [77,78], podobnie ja k stym ulow ać proces specjalizacji fibroblastów w kierunku fibroblastów tw orzących podścielisko g uza (tzw. CAFs, ang. cancer-associated fibroblasts) [79]. W przypadku czerniaka, opisano rów nież supresję odpow iedzi im m unologicznej w w yniku ektosom alnego transferu ligandu Fas, inicjującego sygnalizację proapoptotyczną m .in. w lim focytach T [80].

Ze w zględu n a niew ielką liczbę badań nad ektosom am i uw alnianym i przez kom órki czerniaka, w arto w spom nieć o funkcjonalnym w pływ ie egzosom ów . Obie populacje są uw alniane przez kom órki czerniaka jednocześnie, a ze w zględu n a częściow e podobieństw o m olekularnego cargo, ich działanie

(16)

je s t często synergistyczne. B adania n a m odelu m ysim w ykazały zw iększoną proliferację i inw azyjność kom órek g uza po ich stym ulacji egzosom am i w yizolow anym i z kondycjonow anych pożyw ek z hodow li inw azyjnych kom órek czerniaka [81]. Co w ięcej, egzosom y te sprzyjały tw orzeniu guzów w tórnych w kościach. Z a organotropizm odpow iedzialna b y ła praw dopodobnie zróżnicow ana obecność integryn w egzosom ach. U m yszy inokulow anych egzosam am i przenoszącym i integryny a6ß4 i a6ß1 przew ażały przerzuty do płuc, podczas gdy obecność integryny avß5 p rom ow ała przerzuty do w ątroby [82].

Egzosom y w pływ ają rów nież n a inicjację przejścia epitelialno-m ezenchym alnego (EM T, ang.

epithelial-m esenchym al transition) w kom órkach czerniaka poprzez zm iany w ekspresji m arkerów m ezenchym alnych, to je s t ham ow anie ekspresji E -kadheryny i w zrost ekspresji w im entyny oraz czynników transkrypcyjnych Z E B 2 i SN A IL2 [83].

E gzosom y uw alnianie przez kom órki czerniaka są rów nież nośnikam i M M Ps, V E G F i innych klasycznych czynników proangiogennych [84]. U dokum entow ano ich zdolność do stym ulacji angiogenezy zarów no w obrębie g uza pierw otnego, ja k i w miej scach tw orzenia niszy prem etastatycznej m .in. w w ęzłach chłonnych, poprzez indukcję ekspresji V EG F, uPA , T N F -a oraz czynnika indukow anego hipoksją 1 (HIF-1, ang. hypoxia-inducible factor 1) [85].

W kontekście odpow iedzi im m unologicznej, egzosom y uw alniane przez kom órki czerniaka ham ują różnicow anie prezentujących antygen kom órek dendrytycznych, a także funkcjonow anie lim focytów T regulatorow ych, pośrednio ograniczając w ten sposób aktyw ację lim focytów T cytotoksycznych [86,87]. E gzosom y m ogą rów nież ograniczać aktyw ację lim focytów T cytotoksycznych, w pływ ając n a proces oddychania m itochondrialnego [8 8].

U w alnianie EV s m oże być rów nież jed n y m z czynników decydujących o nieskuteczności leków stosow anych w terapii czerniaka. W odpow iedzi n a leki z rodziny inhibitorów genu B R A F (w tym typow ej dla czerniaka m utacji B R A F V600E), kom órki czerniaka u w alniają egzosom y zaw ierające R N A sprzyjające oporności n a w spom nianą grupę leków [89]. Inne m echanizm y oporności w ielolekow ej opierają się n a egzosom alnym transporcie białek zaangażow anych w napraw ę D NA , co zw iększa przeżyw alność kom órek czerniaka i w zrost g uza niezależnie od stosowanej chem ioterapii [90].

Z decydow anie najm niej w iadom o o roli ciałek apoptotycznych produkow anych przez ulegające apoptozie kom órki czerniaka. Pojedyncze badania pokazały, że ciałka apoptotyczne uw alnianie przez kom órki m ysiej linii B16-F1 p osiadają w yższą aktyw ność prokoagulacyjną w stosunku do innych populacji EV s zw iązaną z ilością TF i fosfatydyloseryny. Co w ięcej, u m yszy, którym podano w yizolow ane ciałka apoptotyczne przed inokulacją kom órkam i czerniaka, pierw otne guzy rozw ijały się później niż w przypadku podania ektosom ów i egzosom ów [91]. W yniki te potw ierdziły w pływ ciałek apoptotycznych zarów no n a proces koagulacji, ja k i odpow iedź układu im m unologicznego w zględem kom órek now otw orow ych.

1.5 . Z n a c z e n ie g lik o z y la c ji b i a ł e k w b io lo g ii m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h

G likozylacja je s t je d n ą z najczęstszych m odyfikacji białek oraz lipidów . W przeciw ieństw ie do

(17)

biosyntezy DNA, R N A i białek, synteza glikanów nie zachodzi n a bazie żadnej m olekularnej m atrycy.

Przebieg procesu glikozylacji je s t regulow any pośrednio przez ekspresję genów kodujących syntezę enzym ów biorących udział w syntezie glikanów , ekspresję i aktyw ność glikozylotransferaz i glikozydaz oraz dostępności określonych reszt cukrow ych, dlatego w zględna ilość i struktura glikanów je s t kom órkow o-, tkankow o- i gatunkow o-specyficzna [92].

G likozylacja białek odgryw a kluczow ą rolę w szerokim spektrum procesów biologicznych, w tym sygnalizacji w ew nątrz- i m iędzykom órkow ej, rozpoznaw aniu kom órkow ym , adhezji i m igracji kom órek, transporcie w ew nątrzkom órkow ym białek i kontroli ich fałdow ania [93]. Z kolei proteoglikany stanow iące istotny składnik m acierzy zew nątrzkom órkow ej, w spółuczestniczą w tw orzeniu struktury tkanek [94]. Od niedaw na obserw ow any je s t w zrost liczby badań skupiających się n a analizie profilu glikozylacji EVs. W ykazano, że EV s przenoszą liczne glikoproteiny posiadające specyficzne struktury cukrow e, ale nadal niew iele w iadom o o roli ja k ą p ełnią te glikany w biologii EVs.

C oraz w iększa liczba badań potw ierdza, że różnorodne struktury cukrow e biorą udział w sortow aniu białek do EV s i istotnie w pływ ają n a w ydajność procesu sortow ania. W przypadku egzosom ów inhibicja enzym ów działających n a określonych etapach syntezy N -glikanów lub punktow e m utacje potencjalnych m iejsc N -glikozylacji obniżały lub zw iększały w ydajność sortow ania w ybranych białek do EV s [95,96], co zostanie szerzej om ów ione w D yskusji. W m echanizm ie sortow ania zależnym od glikozylacji biorą udział też proteoglikany. O becność siarczanu heparanu przyłączonego do syndekanu, transbłonow ego białka, w arunkow ała jeg o inkorporację do egzosom ów uw alnianych przez kom órki kilku typów now otw orów , co w ykazano stosując heparanazę, enzym katalizującego degradacje tego glikozoam inoglikanu [97]. K olejny potencjalny m echanizm sortow ania białek do EV s zależy od w ew nątrzkom órkow ego oddziaływ ania glikoprotein z białkam i należącym i do rodziny galektyn, będących lektynam i zdolnym i do w iązania ß-galaktozydów , w tym jedn ostek N -acetylolaktozoam inylow ych. B adania n a m odelu m ysim pokazały, że ilość jednostek N -acetylolaktozoam inylow ych w egzosom ach uw alnianych przez retikulocyty zależy od w ew nątrzkom órkow ej ekspresji (ilości) galektyny 5 [98].

G likoproteiny i proteoglikany obecne n a pow ierzchni EV s w ydają się odgryw ać kluczow ą rolę rów nież podczas interakcji EV s z kom órkam i docelow ym i. W dotychczasow ych badaniach indukow ane zm iany w profilu pow ierzchniow ej glikozylacji EV s, takie ja k ich deglikozylacja czy desialilacja, pow odow ały w zrost lub spadek stopnia inkorporacji EVs przez kom órki docelow e [99] lub w pływ ały n a stopień ich akum ulacji w określonych tkankach bądź narządach [100]. W innych badaniach po w prow adzeniu z w ykorzystaniem technik inżynierii genetycznej now ych potencjalnych m iejsc N -glikozylacji do struktury białka błonow ego zw iązanego z lizosom am i Lam p2b (ang. lysosom e- associated m em brane protein 2b) obserw ow ano zw iększoną internalizację Lam p2b-pozytyw nych egzosom ów przez kom órki neuroblastom y [101]. W przypadku egzosom ów uw alnianych przez retikulocyty szczura zaobserw ow ano, że do ich internalizacji przez m akrofagi konieczna je s t obecność w ich cargo glikozylow anej galektyny 5 [98]. Ponadto, w ykazano, że obecność siarczanu heparanu

(18)

w proteoglikanach zm niejsza internalizację EV s przez kom órki glejaka w ielopostaciow ego [102] i raka pęcherza m oczow ego [103] oraz praw idłow e kom órki gw iaździste w ątroby [104].

1.6. G l i k o z y la c ja m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h w c h o r o b a c h n o w o tw o r o w y c h

M olekularny skład EV s m oże różnić się w zależności od typ u uw alniających je kom órek, a także podlegać dynam icznym zm ianom w stanach patologicznych. Z m iany w profilu glikozylacji białek obserw ow ane są w różnych stanach chorobow ych nie tylko na poziom ie kom órkow ym , ale rów nież w w yizolow anych populacjach EVs. N a przykład, egzosom y w yizolow ane z m oczu pacjentów z galaktozem ią, genetycznie uw arunkow anym upośledzeniem przekształcania pochodzącej z laktozy galaktozy w glukozę, charakteryzow ały się m niejszą ilością N -glikanów typ u w ielom annozow ego w porów naniu do grupy kontrolnej [105].

Z m iany w profilu glikozylacji białek są rów nież charakterystyczne d la EV s uw alnianych przez kom órki różnych typów now otw orów . W ykorzystując m acierze lektynow e w ykazano, że egzosom y uw alniane przez kom órki czerniaka skóry, białaczki i raka okrężnicy p o siadają charakterystyczne w zory glikozylacji [106]. W e w szystkich przypadkach egzosom alne glikoproteiny były w zbogacone w N -glikany typu w ielom annozow ego oraz a2,6-sialilow ane N -glikany typ y kom pleksow ego. W innych badaniach w ysokospraw na chrom atografia cieczow a (H PLC , ang. high perform ance liquid chrom atography) pozw oliła zaobserw ow ać w iększą ilość N -glikanów typu w ielom annozow ego i trzyantenow ych N -glikanów typu kom pleksow ego z przedzielającą N -acetyloglukozoam ininą (G lcN A c) w egzosom ach uw alnianych przez kom órki raka ja jn ik a w porów naniu do egzosom ów uw alnianych przez kom órki praw idłow e. Z w iększoną ekspresję tych sam ych struktur zaobserw ow ano rów nież w tkance guza, co w skazuje n a m ożliw ość w ykorzystania egzosom ów w raku jajn ik a do celów diagnostycznych [107].

Profil glikozylacji w ybranych białek transportow anych przez EV s m oże prom ow ać progresję now otw oru. O becność w ielokrotnie N -glikozylow anych cząsteczek zew nątrzkom órkow ego czynnika indukującego aktyw ność m etaloproteinaz m acierzy zew nątrzkom órkow ej (E M M PR IN , ang.

extracellular m atrix m etalloproteinase inducer) w egzosom ach uw alnianych przez inw azyjne kom órki raka piersi zw iększała m igrację kom órek now otw orow ych, co udow odniono w eksperym entach z enzym atycznie deglikozylow anym i egzosom am i [108]. Innym i glikoproteinam i, których obecność została rów nież stw ierdzona w EV s są m .in. integryny, rodzina białek adhezyjnych odgryw ająca kluczow ą rolę podczas adhezji i m igracji kom órek, a także dw a czynniki w zrostu - TG F-ß i epiderm alny (EGF, ang. epiderm al grow th factor), których m utacje zalicza się do czynników prom ujących progresję now otw oru [109]. Jednakże, w pływ transferu w spom nianych glikoprotein za pośrednictw em EV s na behaw ior kom órek now otw orow ych nie został jeszcze zbadany.

W różnych populacjach EV s potw ierdzono obecność szeregu glikoprotein w ykorzystyw anych aktualnie w diagnostyce klinicznej now otw orów , w tym m ucyny-1 (M U C 1) będącej m arkerem raków pochodzenia nabłonkow ego (w tym raka piersi), antygenu C A 19-9 - m arkera raka trzustki, antygenu

(19)

karcinoem brionalnego (CEA, ang. carcinoem bryonic antigen) - m arkera rak a okrężnicy, oraz m arkerów now otw oru jajnika: CA 125, C D 24 i cząsteczki adhezyjnej kom órek nabłonkow ych (EpC A M , ang.

epithelial cell adhesion m olecule) [109]. U stalenie czy w ym ienione bądź też inne glikoproteiny charakterystyczne dla różnych typów now otw orów ulegają w zbogaceniu w EVs, które są obecne w płynach ustrojow ych pacjentów onkologicznych pow inno stać się przedm iotem szeroko zakrojonych badań, prow adzących do opracow ania now ych strategii diagnostycznych.

1.7. Z m i a n y w p r o f il u g lik o z y la c ji k o m ó r e k c z e r n i a k a z ło ś liw e g o i u w a ln i a n y c h p r z e z n ie m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h

W iedza n a tem at glikozylacji EV s uw alnianych przez kom órki czerniaka je s t znikom a w porów naniu do szeroko opisanych zm ian glikozylacji n a poziom ie kom órkow ym . Poniew aż w EV s nie dochodzi do syntezy de novo ani m odyfikacji glikanów , rodzaj struktur cukrow ych sortow anych i identyfikow anych w EV s zależy w yłącznie od w cześniejszego przebiegu procesu glikozylacji w kom órce. Określone zm iany w profilu glikozylacji kom órek czerniaka p ojaw iają się ju ż n a początku transform acji now otw orow ej m elanocytów i są obserw ow ane n a w szystkich etapach choroby, inne są charakterystyczne dla poszczególnych (lub kilku) faz w zrostu (radialnej, w ertykalnej) lub po jaw iają się w yłączenie w guzach w tórnych w kom órkach m etastatycznych [110,111]. Do najczęściej obserw ow anych zm ian zalicza się m .in. spadek lub nadekspresję w ybranych glikanów w stosunku do kom órek praw idłow ych, ekspresję glikanów obserw ow anych w yłącznie w tkankach em brionalnych, ekspresję niekom pletnych („skróconych”) łańcuchów oligosacharydow ych, a także ekspresję całkow icie now ych struktur cukrow ych tzw . neoglikanów [1 1 2 ].

W przypadku N -glikozylacji kom órek czerniaka, najbardziej charakterystyczną zm ianą tow arzyszącą transform acji now otw orow ej je s t w zrost ekspresji i/lub aktyw ności N -acetyloglukazoam inotransferazy V (GnT-V, ang. N -acetylglucosam inyltransferase V ), co pow oduje zw iększenie ilości ß 1 ,6 -rozga^zionych N -glikanów typu kom pleksow ego. Z drugiej strony, G nT-V konkuruje o ten sam substrat z N -acetyloglukazoam inotransferazą III (G nT-III, ang.

N -acetylglucosam inyltransferase III), katalizującą syntezę N -glikanów z przedzielającą N -acetyloglukazam iną (G lcN A c, ang. N -acetyloglucosam ine) W ysoka ekspresja i aktyw ność G nT-III un iem ożliw ia tw orzenie ß1,6-rozgałęzień łańcucha oligosacharydow ego przez G nT-V , co osłabia potencjał inw azyjny i m etastatyczny kom órek now otw orow ych [113]. N iem niej jed n ak w przypadku w ybranych innych typów now otw orów w zrost ekspresji G nT-III m oże rów nież prom ow ać progresję now otw oru [114].

Do glikoprotein m odyfikow anych przez G nT-V w kom órkach czerniaka należą m .in. integryny, receptor adhezyjny w iążący białko M ac-2 (ang. M ac-2 binding protein) oraz cząsteczka adhezyjna kom órek czerniaka (M CA M , ang. m elanom a cell adhesion m olecule) [115]. W w arunkach in vitro w yższa ekspresja ß1,6-ro zg a^z io n y c h struktur w kom órkach czerniaka gałki ocznej korelow ała ze zw iększoną m igracją kom órek po fibronektynie (składniku ECM ) [116,117]. Co w ięcej, w barw ieniu

(20)

histologicznym guzy w tórne w ykazyw ały bardziej hom ogenną ekspresję ß1,6-ro zg a^zio n y ch N -glikanów typu kom pleksow ego w porów naniu do guzów pierw otnych [118]. A ntagonistyczny efekt G nT-III zaobserw ow ano natom iast w m ysim m odelu czerniaka, gdzie inokulacja kom órkam i B16 z nadekspresją G nT-III daw ała m niejszą liczbę p rzerzutów do płuc w porów naniu do inokulacji kom órkam i kontrolnym i [119]. R edukcję potencjału m etastatycznego kom órek czerniaka w w arunkach in vitro i in vivo zaobserw ow ano rów nież w w yniku działania sw ainsoniny będącej inhibitorem a-m annozydazy II aparatu G olgiego i ham ującej syntezę N -glikanów ty pu kom pleksow ego [120,121].

M etastatyczne linie kom órkow e czerniaka w ykazują w iększą ekspresję a1,6-fukozylotransferazy (F U T -8, ang. a1,6-fucosyltransferase) w porów naniu do linii kom órkow ych w yprow adzonych z guzów pierw otnych [122]. R ów nież u pacjentów z przerzutam i czerniaka zaobserw ow ano w yższy poziom F U T- 8 w surow icy w porów naniu do chorych bez przerzutów , a w yniki te potw ierdzono w ykonując knockout F U T- 8 w liniach kom órkow ych oraz m ysim m odelu in vivo [123]. W tych sam ych badaniach w ykazano rów nież, że tw orzenie przerzutów m oże być zależne od rdzennej fukozylacji neuronalnej cząsteczki adhezyjnej (L1C A M , ang. L1 cell adhesion m olecule) w kom órkach czerniaka [123].

W kom órkach now otw orow ych obserw ow ane są rów nież zm iany stopnia sialilacji glikanów , co w y nik a ze zm ian w ekspresji i/lub aktyw ności a2,3/6/8-sialotransferaz. W zrost ilości kw asów sialow ych nadaje pow ierzchni kom órki bardziej ujem ny ładunek, a to osłabia adhezję kom órek g u za do kom órek podścieliska lub składników ECM , co w konsekw encji sprzyja ich rozsiew aniu. Co w ięcej, duża ilość term inalnych kw asów sialow ych tw orzy gęstą, am orficzną w arstw ę w obrębie glikokaliksu utrudniającą kom órkom układu odpornościow ego rozpoznaw anie epitopów znajdujących się w początkow ych fragm entach łańcucha glikanu n a pow ierzchni kom órek now otw orow ych [124,125].

W badaniach n a kilku liniach kom órkow ych czerniaka zaobserw ow ano, że ilość a2,3-w iązanych kw asów sialow ych w zrasta w raz potencjałem m etastatycznym kom órek, podczas gdy kom órki linii w yprow adzonych ze zm ian pierw otnych w ykazują przew agę kw asów sialow ych w iązanych a2,6-glikozydow o [126,127]. Ponadto, obecność cząsteczek a2,3-w iązanych kw asów sialow ych na pow ierzchni kom órek czerniaka prom ow ała ich m igrację po fibronektynie [128]. W przypadku cząsteczek z w iązaniem a2 ,6, enzym atyczna desialilacja lub w yciszenie genu dla ß-galakto zyd o-a2 ,6 - sialoltransferazy zm niejszała adhezję i inw azję kom órek czerniaka [129]. Znaczenie a2 ,3 - i a2,6- w iązanych kw asów sialow ych potw ierdziły rów nież badania na trzech liniach kom órkow ych czerniaka transfekow anych genem dla a1,3-galaktozylotransferazy, konkurującej o ten sam akceptor, tj. reszty N -acetyloaktozoam iny, z a2,3- i a2,6-sialoltransferazam i. Transfekow ane kom órki charakteryzow ały się obniżoną sialilacją białek błony kom órkow ej i niższym potencjałem m etastatycznym [130].

W zbogacenie w a2,3-w iązane kw asy sialow e dotyczy rów nież sialilow anych form antygenów Lew is X (N euN A c-a2,3-G al-ß1,4-(Fuc-a1,3)-G lcN A c-ß-) i Lew is A (N euN A c-a2,3-G al-ß1,3-(Fuc-a1,4)- G lcN A c-ß-) obecnych zarów no w O-, ja k i N -glikanach. A ntygeny te sprzyjają agregacji kom órek now otw orow ych z płytkam i krw i i leukocytam i, a także u czestniczą w ich ekstraw azacji dzięki

(21)

[131]. Praw idłow e ludzkie m elanocyty w ykazują brak ekspresji sialilow anej form y antygenu Lew is X i słabą ekspresję sialilow anego antygenu Lew is A; nadekspresją tych struktur je s t natom iast obserw ow ana w przypadku linii kom órkow ych czerniaka i rów nież tkanek g uza [132]. B adania w ykazały, że transfekcja genam i kodującym i enzym y zaangażow ane w syntezę sialilow anych form antygenów Lew is X i Lew is A, odpow iednio a1,3- i a1,4-fukozylotransferazy, zw iększała potencjał m etastatyczny kom órek czerniaka zarów no w w arunkach in vitro [133,134], ja k i w m ysim m odelu in vivo [135]. Co więcej, u m yszy z nadekspresją E-selektyny (wiążącej sialilow ane antygeny Lew is) w hepatocytach zaobserw ow ano zw iększoną liczbę przerzutów w w ątrobie [135].

W kom órkach czerniaka obserw uje się rów nież charakterystyczne zm iany w O -glikozylacji m .in.

w ekspresji antygenów T (G al-ß1,3-G alN A c-a1-O -S er/T hr) oraz Tn (G alN A c-a1-O -Ser/T hr), w tym jeg o sialilow anej form y (sTn, N euN A c-a2,6-G alN A c-a1-O -S er/T hr). E pitopy te są nieobecne n a kom órkach epitelialnych, co czyni je bardzo charakterystycznym m arkerem zm ienionych now otw orow o tkanek. A ntygen T zw iązany je s t ze zw iększoną proliferacją kom órek now otw orow ych, ale rów nież ich niskim potencjałem m etastatycznym , podczas gdy antygeny T n i sTn są typow e dla kom órek o bardziej agresyw nym fenotypie [136-138]. W barw ieniu histologicznym m etastatycznych guzów czerniaka z w ykorzystaniem lektyn zaobserw ow ano spadek ekspresji antygenu T, czem u tow arzyszył jednoczesny w zrost ekspresji jeg o prekursorow ej form y Tn w porów naniu do guzów pierw otnych [139].

W kom órkach czerniaka jed n y m z białek posiadających antygen Tn je s t nukleolina, zdolna do w iązania cząsteczek głów nego kom pleksu zgodności tkankow ej klasy I (M H C I, ang. m ajor histocom patibility com plex class I) [140]. A ntygen Tn obecny n a pow ierzchni kom órek czerniaka je s t zatem obiecującym celem w im m unodiagnostyce oraz im m unoterapii czerniaka.

D otychczasow a w iedza n a tem at glikozylacji EV s uw alnianych przez kom órki czerniaka pochodzi z zaledw ie trzech prac eksperym entalnych, z których dw ie zostały ju ż w spom niane w R ozdziałach 1.5 i 1.6. W badaniach tych w ykazano w zbogacenie egzosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka w N -glikany typu w ielom annozow ego, a2,6-sialilow ane N -glikany typy kom pleksow ego oraz jed no stki polilaktozoam inow e [106], a także zadem onstrow ano zależny od ilości N-glikanów typu kom pleksow ego m echanizm inkorporacji glikoproteiny EW I-2 do egzosom ów [95]. W najnow szych badaniach przy użyciu H P L C porów nano natom iast glikozylację trzech linii kom órkow ych m ysiego czerniaka (B 16-F1, B 16-F10 i B 16-B L6) i uw alnianych przez nie egzosom ów . Piki odpow iadające ośm iu strukturom N -glikanów o najw yższej ekspresji (głów nie czteroantenow ym ß 1 ,6-ro zga^zio ny m N -glikanom z rdzenną fukozą) w kom órkach B 16-F10 zidentyfikow ano rów nież w uw alnianych przez nie egzosom ach, a ich w zględna ekspresja b y ła 1 0 -krotnie w yższa w porów naniu do uw alniających je kom órek. K om órki pozostałych dw óch linii i odpow iadające im egzosom y rów nież w ykazyw ały w ysokie podobieństw o pod w zględem dom inujących typów N -glikanów . W przypadku egzosom ów uw alnianych przez kom órki linii B16-F1 nie zaobserw ow ano jed n ak typow ej dla kom órek wysokiej ekspresji w ybranych struktur trzyantenow ych [141].

W spom niane podobieństw a i różnice w profilu glikozylacji kom órek czerniaka i uw alnianych przez

(22)

nie EVs, czynią zasadnym i dalsze badania w ykorzystujące inne linie kom órkow e - reprezentujące różne stadia choroby czy też różne typy kliniczne czerniaka. Ponadto, dotychczasow e badania dotyczyły w yłącznie populacji egzosom ów . N a potrzebę przeprow adzania podobnych analiz w przypadku ektosom ów w skazuje przede w szystkim m echanizm ich biogenezy tj. form ow anie w obrębie błony kom órkow ej. W przeciw ieństw ie do egzosom ów (pow stających w ew nątrz kom órki), ektosom y przenoszą głów nie b iałka błonow e, przede w szystkim receptory i białk a adhezyjne, których profil glikozylacji m a kluczow e znaczenie d la sygnalizacji m iędzy- i w ew nątrzkom órkow ej oraz m igracji kom órek now otw orow ych. Co w ięcej, w zw iązku ze zw ykle zbyt późn ą diagnozą czerniaka, zw ykle w m om encie w ystąpienia przerzutów , i w yso ką śm iertelnością, m ożliw ość w ytypow ania potencjalnych m arkerów czerniaka w śród białek (w tym glikoprotein) obecnych w ektosom ach p łynów ustrojow ych, m ogłaby przyczynić się w przyszłości do opracow ania now ych m etod diagnostycznych i leczenia tego now otw oru z w ykorzystaniem EV s jak o system ów dostarczania leków.

(23)

2. C

e l p r a c y

,

h i p o t e z y i z a d a n i a b a d a w c z e

W e W stępie do poniższej pracy doktorskiej w ykazano, że m ikropęcherzyki błonow e są nośnikam i szeregu białek zaangażow anych w proces karcynogenezy, a w tym glikoprotein. O ile liczba badań nad składem białkow ym i cukrow ym egzosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka stale rośnie, nie przeprow adzono ja k dotąd analogicznej analizy dotyczącej cargo ektosom ów .

W poniższej pracy podjęto zatem próbę w eryfikacji hipotezy zakładającej, że ektosom y uw alniane przez kom órki czerniaka złośliw ego:

1. są nośnikam i szeregu białek zw iązanych z rozw ojem i progresją now otw oru,

2 . są nośnikam i struktur cukrow ych odgryw ających rolę podczas sortow ania białek do ektosom ów , 3. posiadają cukrow e antygeny zw iązane z now otw orem (TA CA s, ang. tum or-associated carbohydrate

antigens) analogiczne do tych obecnych w kom órkach czerniaka,

4. m o g ą w yw ierać funkcjonalny w pływ n a kom órki o mniej inw azyjnym potencjale.

C elem poniższej pracy doktorskiej b y ła p ro te o m ic z n a i g lik o m icz n a a n a liz a c a rg o b iałk o w eg o ek to so m ó w u w a ln ia n y c h w w a ru n k a c h in vitro p rz e z p ięć lin ii k o m ó rk o w y c h lu d zk ieg o c z e rn ia k a sk ó ry i gałk i ocznej re p re z e n tu ją c y c h ró ż n e s ta d ia ch o ro b y . Podjęte zadania badaw cze obejm ow ały:

1. izolację ektosom ów z kondycjonow anych pożyw ek z hodow li in vitro czterech linii kom órkow ych czerniaka skóry (w yprow adzonych ze zm ian pierw otnych: W M 115 i W M 793, oraz m etastatycznych:

W M 266-4 i W M 1205L u) oraz jednej linii czerniaka gałki ocznej (M el202) m eto dą w irow ania różnicow ego,

2 . ocenę czystości uzyskanych populacji ektosom ów z w ykorzystaniem transm isyjnej m ikroskopii elektronow ej (TEM , ang. Transm ission Electron M icroscopy), analizatora ruchu nanocząstek (NTA, ang. N anoparticle Tracking A nalysis) oraz W estern Blot,

3. identyfikację cargo białkow ego ektosom ów m etodą chrom atografii cieczowej sprzężonej z tandem ow ą spektrom etrią m as (LC -M S/M S, ang. liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry) oraz bioinform atyczną analizę w yników ,

4. porów naw czą analizę profilu glikozylacji ekstraktów kom órkow ych, białek błonow ych i ektosom ów techniką lektynoblottingu,

5. porów naw czą analizę pow ierzchniow ej glikozylacji kom órek czerniaka i uw alnianych przez nie ektosom ów z w ykorzystaniem cytom etrii przepływ ow ej,

6 . ocenę funkcjonalnego w pływ u ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka n a proliferację i m igrację m niej inw azyjnych kom órek w w arunkach in vitro.

Cytaty

Powiązane dokumenty

CAR is a group of ophthalmic symptoms occurring in patients suffering from epithelial cancers (small cell lung carcinoma, ovarium cancer, uterus cancer, breast cancer,

Strona główna serwisu Akademia Czerniaka (sekcji naukowej Polskiego Towarzystwa Chirurgii Onkologicznej).. Poradnik dla chorych na nowotwory złośliwe dostępny w serwisie sekcji

Radioterapia powinna być zarezerwowana wyłącznie do sytuacji klinicznych, w których niemożliwe jest zastosowanie immunoterapii (np. aktywna poważna choroba autoimmunologiczna)

Przedstawiono przypadki 2 pacjentów: 42-letniego chorego na czerniaka, u którego po nie- powodzeniu pierwszej linii leczenia zastosowano w drugiej linii pembrolizumab, uzyskując

Pojawia się jednak coraz więcej dowodów wskazujących, że u chorych z przerzutami czerniaka do mózgu leczenie ipilimumabem może zapewnić trwałą stabilizację nowotworu, a

Dermoskopia może zwiększać lub zmniejszać pew- ność co do łagodnego lub złośliwego charakteru zna- mienia barwnikowego, 68,69 dzięki czemu zwiększa się częstość

Rokowanie w przypadku przerzutów czerniaka złośliwego do serca jest szczególnie niekorzystne, a średnia długość życia pacjentów od momentu roz- poznania wynosi 6,4 miesiąca

Je¿eli jednak osi¹gniemy ten cel, musimy siê liczyæ z kolejnym problemem, jakim jest rów- noleg³y z rozwojem odpowiedzi prze- ciwnowotworowej rozwój autoagresji i niszczenie