Wydział Biologii
Instytut Zoologii i Badań Biomedycznych
Charakterystyka ektosomów uwalnianych przez komórki ludzkiego czerniaka złośliwego
mgr Magdalena Surman
Rozprawa doktorska wykonana pod opieką dr hab. M ałgorzaty Przybyło, prof. UJ w Zakładzie Biochemii Glikokoniugatów Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych
Kraków 2020
P ra g n ę s e rd e c z n ie p o d z ię k o w a ć :
P a n i d r h a b . M a ł g o r z a c i e P r z y b y ł o , p r o f . U J , p ro m o to ro w i m oj ej p ra cy , z a s tw o rz e n ie w a ru n k ó w ro z w o ju n a u k o w e g o , p o ś w ię c o n y m i czas, ż y c z liw o ś ć ,
w s z e c h s tro n n ą p o m o c o ra z n ie o c e n io n e w s p a r c ie m e ry to ry c z n e p o d c z a s c a łe g o o k re s u re a liz a c ji n in ie jsz e j p ra c y d o k to rsk ie j.
P a n i d r h a b . D o r o c ie H o j a - Ł u k o w i c z , p r o f . U J o ra z d r M a r c e l i n i e J a n i k , z a w p ro w a d z e n ie m n ie w ta jn ik i p ra c y la b o ra to ry jn e j i h o d o w li k o m ó rk o w e j.
Z e s p o ło w i z Z a k ła d u F iz y k i M e d y c z n e j W y d z ia łu F A IS U J, w sz c z e g ó ln o śc i P a n i d r h a b . E w ie S tę p ie ń , p r o f . U J o ra z A n i D r o ż d ż , z a u m o ż liw ie n ie m i re a liz a c ji cz ę śc i b a d a ń d o n in ie jsz e j p ra c y d o k to rs k ie j, w s p a rc ie m e ry to ry c z n e o ra z c e n n e u w a g i.
Z e s p o ło w i z P ra c o w n i S p e k tro m e trii M a s M a ło p o ls k ie g o C e n tru m B io te c h n o lo g ii, P a n i d r h a b . S y lw ii K ę d r a c k i e j - K r o k , p r o f . U J o ra z d r U r s z u li J a n k o w s k i e j ,
z a p o m o c w re a liz a c ji b a d a ń p ro te o m ic z n y c h .
P r a c o w n i k o m i K o l e ż a n k o m z Z a k ł a d u B io c h e m ii G l i k o k o n i u g a t ó w , w sz c z e g ó ln o ś c i M a r c i e Z ą b c z y ń s k ie j , z a o k a z a n ą p o m o c , ż y c z liw o ś ć o ra z s tw o rz e n ie m iłej a tm o s fe ry p racy .
M a g d a
S
p i s t r e ś c iSpis treści 3
W ykaz zastosow anych skrótów 4
Streszczenie 7
A bstract 8
1. W stęp 9
1.1. M ikropęchrzyki błonow e - inform acje ogólne 9
1.2. E ktosom y jak o je d n a z populacji m ikropęchrzyków błonow ych 11
1.2.1. B iogeneza ektosom ów 11
1.2.2. M olekularne cargo ektosom ów 12
1.2.3. F izjologiczna rola ektosom ów oraz ich znaczenie w procesach patologicznych 12
1.3. Znaczenie ektosom ów w progresj i now otw orów 13
1.4. F unkcjonalna rola ektosom ów w progresji czerniaka złośliw ego 15 1.5. Znaczenie glikozylacji białek w biologii m ikropęcherzyków błonow ych 16 1.6. G likozylacja m ikropęcherzyków błonow ych w chorobach now otw orow ych 18 1.7. Z m iany w profilu glikozylacji kom órek czerniaka złośliw ego i uw alnianych przez nie 1 9 m ikropęcherzyków błonow ych
2. Cel pracy, hipotezy i zadania badaw cze 23
3. Prace w chodzące w skład rozpraw y doktorskiej 24
4. O św iadczenia w spółautorów 79
5. D yskusja 89
5.1. O cena m etody wybranej do izolacja ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka 89 5.2. C hrom atografia cieczow a sprzężona ze spektrom etrią m as (LC -M S) jak o podstaw ow a 9 ^ technika służąca charakterystyce białkow ego cargo m ikropęcherzyków błonow ych
5.3. E ktosom y uw alniane przez kom órki czerniaka jak o nośniki białek zw iązanych z 9 3 rozw ojem i progresją now otw oru
5.4. B iałkow e cargo ektosom ów ja k źródło potencjalnych m arkerów czerniaka złośliw ego 95 5.4.1. Identyfikacja klinicznych m arkerów czerniaka w m ikropęcherzykach błonow ych 96 5.4.2. M ikropęcherzyki błonow e jak o nośniki potencjalnych białkow ych m arkerów 9 6 czerniaka
5.4.3. Potencjał diagnostyczny ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka w 9 7 kontekście badań n a poziom ie kom órkow ym i tkankow ym
5.5. E ktosom y uw alniane przez kom órki czerniaka jak o nośniki specyficznych struktur 9 8
cukrow ych
5.5.1. Profil glikozylacji i jeg o znaczenie podczas sortow ania białek do ektosom ów 98 5.5.2. P ow ierzchniow a g likozylacja ektosom ów i jej potencjalne znaczenie w ^ interakcjach z kom órką docelow ą
5.5.3. Ektosom y j ako nośniki struktur cukrow ych charakterystycznych d la czerniaka ^ złośliw ego
6 . Podsum ow anie i w nioski 103
B ibliografia u żyta w e Wstępie i D yskusji 104
W
y k a z z a s t o s o w a n y c h s k r ó t ó w 1 D -P A G E /2D -P A G E A R F6 B C R P C A F s C D C P 1 C E A C O X 2/6C E C M E E F 2 E G F E G F R
E M M P R IN E M T E p C A M E R E R K
E S C R T E V s F u c G A B A G al G A N A B G A P D H
G D F 15 G lcN A c G n T - III / G n T -V G O H D G F H F D H IF -1 H M G -1
jedno/dw u-kierunkow a elektroforeza w żelu poliakrylam idow ym (ang. one/tw o dim ensional polyacrylam ide gel electrophoresis)
czynnik uczestniczący w A D P-rybozylacji białek typu 6 (ang. A D P-rybosylation factor 6)
białko oporności raka piersi (ang. breast cancer resistance protein)
fibroblasty tw orzące podścielisko g uza (ang. cancer-associated fibroblasts)
białko zaw ierające dom enę bearcub typ u 1 (ang. C U B -dom ain-containing protein 1) antygen karcinoem brionalny (ang. carcinoem bryonic antigen)
podjednostki 2 i 6C oksydazy cytochrom u c (ang. cytochrom e c oxidase subunits 2 and 6C)
m acierz zew nątrzkom órkow a (ang. extracellular m atrix)
eukariotyczny czynnik elongacyjny typu 2 (ang. eukaryotic elongation factor 2 ) epiderm alny czynnik w zrostu (ang. epiderm al grow th factor)
receptor dla epiderm alnego czynnika w zrostu (ang. epiderm al grow th factor receptor)
zew nątrzkom órkow y czynnik indukujący aktyw ność m etaloproteinaz m acierzy zęw nątrzkom órkow ej (ang. extracellular m atrix m etalloproteinase inducer)
przejście epitelialno-m ezenchym alne (ang. epithelial-m esenchym al transition) cząsteczka adhezyjna kom órek nabłonkow ych (ang. epithelial cell adhesion m olecule)
siateczka śródplazm atyczna (ang. endoplasm ic reticulum )
kinaza regulow ana sygnałem zew nątrzkom órkow ym (ang. extracellular signal
regulated kinase)
endosom alny kom pleks sortujący w ym agany do transportu pęcherzyków (ang.
endosom al sorting com plex required fo r transport) m ikropęcherzyki błonow e (ang. extracellular vesicles) fukoza (ang. fucose)
kw as y-am inom asłow y (ang. y-am inobutyric acid) galaktoza (ang. galactose)
podjednostka a glukozydazy II (ang. glucosidase II a subunit)
dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynow ego (ang. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
prekursorow e białko dla czynnika różnicow ania w zrostu ty pu 15 (ang.
grow th/differentiation factor 15 precursor protein) A -acetyloglukoazam ina (ang. A -acetyloglucosam ine)
A -acetyloglukazoam inotransferaza III / V (ang. A -acetylglucosam inyltransferase III / V)
analiza ontologiczna genów (ang. gene onotology)
czynnik w zrostu pochodzący z w ątrobiaka (ang. hepatom a-derived grow th factor) dializa filtracyjna pod ciśnieniem hydrostatycznym (ang. hydrostatic filtration dialysis)
czynnik indukow any hipoksją typ u 1 (ang. hypoxia-inducible factor 1) białko o w ysokiej ruchliw ości ty pu 1 (ang. high m obility group protein 1)
H N R N P A 2B 1
H P L C H sp IM P D H 2 L 1 C A M L A M P L C -M S /M S L D H L G A L S 3 B P L IM K M A G E A 4 /B 2
M A R T -1 M C A M M D R M H C I
M IA M L C K M M P M R P 1 M V B N euN A c N T A P A I-I / P A I-II P I3 K P M E L
P P P 2 R 1 A PS
R O C K SAA S E C S er T A C A T E M
heterogenna jąd ro w a rybonukleoproteina A2/B1 (ang. nuclear ribonucleoprotein A 2/B 1)
w ysokospraw na chrom atografia cieczow a (ang. high perform ance liquid chrom atography)
białko szoku cieplnego (ang. heat shock protein)
dehydrogenaza 2 inozyno-5'-m onofosforanu (ang. inosine-5'-m onophosphate dehydrogenase 2 )
neuronalna cząsteczka adhezyjna L1 (ang. L1 cell adhesion m olecule)
białko zw iązane z b ło ną lizosom ów (ang. lysosom e-associated m em brane protein ) chrom atografia cieczow a sprzężona z tandem o w ą spektrom etrią m as (ang. liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry)
dehydrogenaza m leczanow a (ang. lactate dehydrogenase) białko w iążące galektynę 3 (ang. galectin-3-binding protein) kinaza LIM (ang. LIM kinase)
antygeny zw iązane z czerniakiem ty p u 4 i B2 (ang. m elanom a-associated antigens 4/B 2)
antygen czerniaka rozpoznaw any przez lim focyty T (ang. m elanom a antigen recognized by T-cells)
cząsteczka adhezyjna kom órek czerniaka (ang. m elanom a cell adhesion m olecule) oporność w ielolekow a (ang. m ultidrug resistance)
głów ny kom pleksu zgodności tkankow ej klasy I (ang. m ajo r histocom patibility com plex class I)
białko regulatorow e pochodzące z czerniaka (ang. m elanom a inhibitory activity protein or m elanom a-derived grow th regulatory protein)
kinaza łańcuchów lekkich m iozyny (ang. m yosin light chain kinase)
m etaloproteinaza m acierzy zew nątrzkom órkow ej (ang. m atrix m etalloproteinases) białko oporności w ielolekow ej (ang. m ultidrug resistance protein 1)
ciałko w ielopęcherzykow e (ang. m ultivesicular body)
kw as A -acetyloneuroam inow y (sialow y) (ang. A -acetylneuram inic acid or sialic acid)
analiza ruchu nanocząstek (ang. N anoparticle Tracking A nalysis)
inhibitory aktyw atorów plazm inogenu typu I i II (ang. plasm inogen activator inhibito r type 1 and 2 )
kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (ang. phosphoinositide 3-kinase) białko m elanocytów P M E L (ang. prem elanosom e protein)
izoform a a 65 k D a regulatorow ej podjednostki A seryno-treoninow ej fosfatazy białkow ej 2A (ang. serine/threonine-protein phosphatase 2A 65 k D a regulatory subunit A a isoform )
fosfatydyloseryna (ang. phosphatidylserine)
R ho-zależna kin aza (ang. R ho-associated coiled-coil containing protein kinase) surow iczy am yloid A (ang. serum am yloid A)
chrom atografia w ykluczania zależnego od w ielkości cząsteczek (ang. size exclusion chrom atography)
seryna (ang. serine)
antygen cukrow y zw iązany z now otw orem (ang. tum or-associated carbohydrate antigen)
transm isyjn a m ikroskopia elektronow a (ang. transm ission electron m icroscopy)
T F T G F -ß T h r T IM P 3 T N F -a tP A T R A IL u P A u P A R
V A M P -3 V E G F
V E G F R 1
czynnik tkankow y (ang. tissue factor)
transform ujący czynnik w zrostu ß (ang. transform ing grow th factor ß) treo nina (ang. threonine)
tkankow y inhibitor m etaloproteinaz typu 3 (ang. tissue inhibitor o f m etalloproteinase 3)
czynnik m artw icy now otw oru a (ang. tu m o r necrosis factor)
tkankow y aktyw ator plazm inogenu (ang. tissue plasm inogen activator)
ligand czynnika m artw icy now otw oru indukujący apoptozę (ang. tu m o r necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)
urokinazow y aktyw ator plazm inogenu (ang. urokinase type plasm inogen activator) receptor d la urokinazow ego aktyw atora plazm inogenu (ang. urokinase plasm inogen activator receptor)
białko zw iązane z błoną pęcherzyków typ u 3 (ang. vesicle-associated m em branę protein 3)
czynnik w zrostu śródbłonka naczyń krw ionośnych (ang. vascular endothelial grow th factor)
receptor dla czynnik w zrostu śródbłonka naczyń krw ionośnych typ u 1 (ang. vascular endothelial grow th factor receptor 1)
S
t r e s z c z e n i eC zerniak złośliw y je s t agresyw nym now otw orem charakteryzującym się szybkim tem pem w zrostu i w czesnym pojaw ianiem się przerzutów . M iędzykom órkow y tran sfer bioaktyw nych cząsteczek zachodzący za pośrednictw em m ikropęcherzyków błonow ych (EVs) je s t jed n y m z czynników sprzyjających progresji now otw oru. Ektosom y, będące je d n ą z subpopulacji EVs, m o gą przenosić kw asy nukleinow e, lipidy oraz białka. Zatem badania dotyczące identyfikacji składników cargo ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka oraz w pływ u w yw ieranego przez nie na kom órki docelow e m ogą przyczynić się do lepszego poznania m olekularnych m echanizm ów progresji czerniaka.
C elem niniejszej pracy było w ykonanie pierw szej proteom icznej i glikom icznej analizy białkow ego cargo ektosom ów uw alnianych przez cztery linie kom órkow e czerniaka skóry (w yprow adzone ze zm ian pierw otnych: W M 115 i W M 793, oraz m etastatycznych: W M 266-4 i W M 1205L u) oraz linię kom órkow ą czerniaka gałki ocznej (M el202). E ktosom y w yizolow ano z kondycjonow anych pożyw ek m etodą w irow ania różnicow ego. N astępnie, stosując chrom atografię cieczow ą sprzężoną z tandem ow ą spektrom etrią m as (LC -M S/M S), zidentyfikow ano w poszczególnych próbkach od 936 do 1055 białek.
E ktosom y były nośnikam i w spólnego zbioru białek, głów nie błonow ych i cytoplazm atycznych, co w ynika z m echanizm u ich biogenezy, a także białek charakterystycznych (różnicujących) dla poszczególnych linii kom órkow ych czerniaka. W śród zidentyfikow anych białek obecne były te 0 udokum entow anej roli w inw azji i m igracji kom órek now otw orow ych, angiogenezie oraz tw orzeniu niszy prem etastatycznej, ja k rów nież b iałk a antyapoptotyczne, m odulujące odpow iedź im m unologiczną czy odpow iedzialne za oporność w ielolekow ą. W testach funkcjonalnych (test żyw otności A lam ar Blue 1 test gojenia ran) obecność ektosom ów stym ulow ała proliferację i prom ow ała m igrację docelow ych kom órek, a efekt ten zależny był od daw ki białek ektosom alnych.
S tosując lektynoblotting w ykazano w zbogacenie ektosom ów w A -glikany posiadające przedzielające cząsteczki G lcN A c, reszty fukozy oraz a2,6-w iązane kw asy sialow e, a preferencyjna inkorporacja tych struktur w skazuje n a ich rolę podczas sortow ania białek do ektosom ów . N a pow ierzchni ektosom ów stw ierdzono w yso ką ekspresję ß 1 ,6 -ro zg a^zio n y ch A -glikanów typu kom pleksow ego, przedzielającej G lcN A c, a także a2 ,6-w iązanych kw asów sialow ych. N iem niej jed n ak procent ektosom ów w ykazujących pow ierzchniow ą ekspresję w ybranych epitopów cukrow ych był niższy niż w przypadku uw alniających je kom órek czerniaka.
U zyskane w yniki dostarczyły w stępnych inform acji n a tem at roli w ybranych białek i struktur cukrow ych w biologii ektosom ów (biogenezie, sortow aniu białek oraz interakcjach z kom órkam i docelow ym i) oraz funkcjonalnego w pływ u ektosom ów n a kom órki now otw orow e. W ektosom alnym cargo zidentyfikow ano rów nież potencjalne m arkery czerniaka, a m ożliw ość ich w ykorzystania w praktyce klinicznej pow inna stać przedm iotem przyszłych badań.
A
b s t r a c tM alignant m elanom a is an aggressive type o f cancer characterized by rapid grow th and early m etastasis. Intercellular transfer o f bioactive m olecules by extracellular vesicles (EV s) is one o f the factors affecting tu m o r progression. E ctosom es are subpopulation o f EV s and facilitate the transfer o f num erous proteins, lipids and nucleic acids. Therefore, studies on ectosom es released by m elanom a cells and on th eir effect exerted on recipient cells are im portant to b etter understand the m echanism s o f m elanom a progression.
The aim o f this study w as the first proteom ic and glycom ic analysis o f ectosom es released by four cutaneous m elanom a cell lines (derived from prim ary lesions: W M 115 and W M 793, and m etastatic sites: W M 266-4 and W M 1205L u) and uveal m elanom a cells (M el202). Ectosom es w ere isolated from conditioned m edia by differential centrifugation. Then, using liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry (LC-M S / M S), from 936 to 1055 proteins w ere identified in individual ectosom e sam ples. Ectosom es w ere carriers o f a com m on set o f proteins (m ainly m em brane and cytoplasm ic, w hat reflects the m echanism o f th eir biogenesis w ithin the cell m em brane) as w ell as differentiating proteins for given m elanom a cell lines. M ultiple cancer-related proteins w ere also identified in ectosom es, including those involved in the invasion and m igration o f cancer cells, angiogenesis, prem etastatic niche form ation, escape from apoptosis, m odulation o f the im m une response and m ultidrug resistance. In functional tests (A lam ar Blue cell viability assay and w ound healing assay) ectosom es stim ulated cell proliferation and m igration, and the observed effect w as dependent on the dose o f ectosom al proteins.
L ectinblotting revealed the enrichm ent o f ectosom es in N -glycans having the bisecting G lcN A c m olecules, fucose residues and a2 ,6-bound sialic acids, and the preferential incorporation o f these structures indicates th eir im portance in the process o f protein sorting into ectosom es. On the other hand, cytom etric analysis revealed high expression o f com plex type ß1,6-branched N -glycans, bisecting G lcN A c, as w ell as a2,6-bound sialic acid on the surface o f ectosom es. In addition, the percentages o f ectosom es positively stained for given glycoepitopes w ere low er in com parison to referential staining o f m elanom a cells.
The obtained results provided basic inform ation concerning the role o f particular proteins and glycan structures in ectosom e biology (biogenesis, protein sorting and interactions w ith target cells), and the functional effects exerted by m elanom a-derived ectosom es. Potential m elanom a m arkers have also been identified in the ectosom al cargo, and the possibility o f th eir use in clinical practice should be the subject o f future research.
1. W
s t ę p1.1. M i k r o p ę c h r z y k i b ło n o w e - i n f o r m a c j e o g ó ln e
Rozwój i progresja czerniaka złośliw ego zachodzi w ieloetapow o, a tow arzyszą tem u m iedzy innym i zm iany w kom unikacji m iędzykom órkow ej i m ikrośrodow isku guza. Z m iany te są efektem działania szeregu czynników , w tym też cząsteczek transportow anych za pośrednictw em m ikropęcherzyków błonow ych (EVs, ang. extracellular vesicles) [1-3]. EV s to niew ielkie koliste struktury, otoczone fosfolipidow ą błoną i uw alniane do przestrzeni pozakom órkow ej przez w iększość typów kom órek zarów no w w arunkach fizjologicznych, ja k i w stanach patologicznych. Z a ich głów n ą funkcję uznaje się transport bioaktyw nych cząsteczek - białek, lipidów i kw asów nukleinow ych, m iędzy dow olnym i, niesąsiadującym i kom órkam i organizm u, a przez to m odulow anie zachodzących w kom órkach docelow ych procesów biologicznych, w tym ekspresji genów , biosyntezy białek, przebiegu szlaków m etabolicznych oraz sygnalizacji w ew nątrzkom órkow ej [4-5].
N a podstaw ie różnic w w ielkości, gęstości i m echanizm ie biogenezy, oraz obecności specyficznych cząsteczek m arkerow ych, najczęściej w yróżnia się trzy populacje EVs: ektosom y, egzosom y oraz ciałka apoptotyczne (R ycina 1). Ich biogeneza obejm uje tw orzenie uw ypukleń w błonie kom órkow ej (ektosom y) lub w błonach przedziałów endosom alnych (egzosom y), a w przypadku ciałek apoptotycznych - otoczenie b łoną kom órkow ą fragm entów cytoplazm y zaw ierających chrom atynę i funkcjonalne organella podczas apoptozy. P oza m echanizm em biogenezy, głów nym kryterium klasyfikacji EV s je s t ich w ielkość. Średnica egzosom ów w aha się w zakresie 30-100 nm. Bardziej heterogenną populację stanow ią ektosom y (0 ,1 - 1 pm ), natom iast średnica ciałek apoptotycznych m oże w ynosić od 1 do 5 pm [3,5].
O ddziaływ anie EV s n a kom órki docelow e zależy bezpośrednio od ich m olekularnego cargo, które to z kolei uw arunkow ane je s t typem uw alniającej EV s kom órki. T ransfer w ybranych cząsteczek do kom órki docelow ej m oże opierać się n a zasadzie interakcji ligand-receptor, fuzji m ikropęcherzyka z b łoną kom órki docelow ej lub jeg o endocytozie [4,5]. W w yniku w spom nianych interakcji, EVs poprzez przenoszone cargo m o gą w pływ ać n a przebieg procesów życiow ych kom órki w stanach fizjologicznych oraz patologicznych [1-3].
U form ow ane EV s są uw alniane do przestrzeni pozakom órkow ej, co um ożliw ia ich izolację z w iększości płynów ustrojow ych (m.in. m oczu, krwi, płynu m ózgow o rdzeniow ego czy śliny) lub kondycjonow anej pożyw ki w przypadku hodow li kom órkow ych in vitro [6-8]. N ajczęściej stosow aną m eto dą izolacji je s t w irow anie różnicow e, gdzie zastosow ana w zględna siła odśrodkow a determ inuje rozm iar izolow anych (sedym entujących) EV s [9,10]. M odyfikację tej m etody stanow i w irow anie w gradiencie gęstości (najczęściej sacharozy), które bazuje nie tylko n a różnicach w w ielkości izolow anych EVs, ale także n a ich zm iennej gęstości [11,12]. K olejną m etodą izolacji EV s je s t chrom otografia w ykluczeniow a (SEC, ang. size exclusion chrom atography), bazująca n a zależnym od rozm iaru EV s czasie retencji w kolum nie chrom atograficznej [13]. Do izolacji w ykorzystuje się rów nież
pow inow actw o w ybranych cząsteczek obecnych n a pow ierzchni EV s do odpow iednich ligandów , najczęściej przeciw ciał (tzw. im m unocapture) [14]. O statnia z m etod izolacji EV s w ykorzystuje filtry o określonej w ielkości porów , które zatrzym ują EVs, podczas gdy nadm iar płynów ustrojow ych lub pożyw ki zostaje usunięty m anualnie (np. przy użyciu filtrów strzykaw kow ych) lub pod ciśnieniem hydrostatycznym (HFD, ang. hydrostatic filtration dialysis) [15,16].
Rycina 1. P orów nanie trze ch g łów nych p o pulacji m ikropęcherzyków błonow ych: egzosom ów , ektosom ów i ciałek apoptotycznych, p o d w zględem w ielkości, m echanizm u biogenezy, składu i cząsteczek m arkerow ych.
W p o w iększeniu - przy k ład m olekularnego cargo typow ego ektosom u. A R F 6 - czynnik uczestniczący w A D P- rybozylacji białek, E G F R - recep to r dla epiderm alnego czynnika w zrostu, E R - retikulum endoplazm atyczne, L A M P-1 - białk o zw iązane z b ło n ą lizosom ów ty p u 1, M M P s - m etaloproteinazy m acierzy zew nątrzkom órkow ej, PS - fosfatydyloseryna, u P A - urokinazow y akty w ato r plazm inogenu, V A M P-3 - białko zw iązane z b ło n ą p ęcherzyków ty p u 3, V E G F - czynnik w zro stu śródbłonka n aczy ń krw ionośnych.
B iodostępność, łatw ość izolacji oraz szeroki zakres aktyw ności biologicznej spow odow ały, że EVs stały się w ostatnich latach obiektem licznych badań spraw dzających m ożliw ość ich w ykorzystania do celów diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych. Zm iany w liczbie uw alnianych EV s oraz szereg z w ystępujących n a ich pow ierzchni cząsteczek m ają charakter sw oistych m arkerów [17].
N atom iast ich w łaściw ości biologiczne (niska im m unogenność), fizyczne (niew ielkie rozm iary) i chem iczne (m ożliw ość dostarczania cząsteczek o charakterze terapeutycznym ) pozw alają n a ich w ykorzystanie jak o system ów dostarczania leków [18,19].
1.2. E k t o s o m y j a k o j e d n a z p o p u l a c j i m i k r o p ę c h r z y k ó w b ło n o w y c h 1.2.1. B io g en eza ektosom ów
Form ow anie ektosom ów w ym aga zm ian w asym etrii dw uw arstw y lipidow ej i reorganizacji cytoszkieletu. W efekcie aktyw acji kom órki przez różnych agonistów (np. A TP, czynniki w zrostu, cytokiny), dochodzi do uw alniania jo n ó w C a2+ z siateczki śródplazm atycznej i w zrostu ich stężenia w cytozolu, co pow oduje zm iany w aktyw ności translokaz odpow iedzialnych za przenoszenie lipidów w obrębie dw uw arstw y. N a skutek aktyw acji flopazy i skram blazy, fosfatydyloseryna i fosfatydyloetanolam ina przenoszone są z w ew nętrznej do zewnętrznej w arstw y błony kom órkow ej, a rów noczesna inhibicja flipazy uniem ożliw ia ponow ną ich relokację [3,20,21].
W zrost stężenia jo n ó w C a2+ w cytozolu pow oduje rów nież w zrost aktyw ności dw óch proteaz - kalpainy i gelsoliny, zdolnych do degradacji elem entów cytoszkieletu. W reorganizacji cytoszkieletu podczas uw alniania ektosom ów bierze rów nież udział białko R hoA, należące do rodziny GTP-az.
Poprzez aktyw ację dw óch kinaz - R ho-zależnej kinazy (R O C K , ang. R ho-associated coiled-coil containing protein kinase) i kinazy LIM (LIM K, ang. LIM kinase), R hoA pow oduje fosforylację kofiliny i zm iany w strukturze filam entów aktynow ych i m iozynow ych. Podobne działanie w ykazuje rów nież czynnik uczestniczący w A D P-rybozylacji białek (A R F6, ang. A D P -ribosylation factor 6).
A R F6 aktyw uje b iałka z rodziny kinaz regulow anych sygnałem zew nątrzkom órkow ym (ERK, ang.
extracellular signal-regulated kinases), w tym kinazę łańcuchów lekkich m iozyny (M LCK, ang. m yosin light chain kinase), pow odując polim eryzację aktyny i fosforylację łańcuchów lekkich m iozyny [3,20,21].
N a skutek zm ian w strukturze dw uw arstw y lipidow ej i organizacji cytoszkieletu, dochodzi do u w ypuklenia (pączkow ania, ang. blebbing) w ybranych fragm entów błony kom órkow ej. Dzięki aktyw ności skurczowej cytoszkieletu, uform ow any ektosom zostaje uw olniony z pow ierzchni kom órki (ang. shedding) do przestrzeni pozakom órkow ej. U w alnianie ektosom ów prow adzi do utraty m ateriału błonow ego. U bytki te są uzupełniane przez rekrutow ane do pow ierzchni kom órki w ew nątrzkom órkow ych pęcherzyków nieprzeznaczonych do sekrecji, które to uzupełniają ubytki lipidów , a ponadto transp ortują now o syntetyzow ane białka do błony, przez co przyczyniają się do dynam icznych zm ian w m olekularnym składzie aktualnie uw alnianych ektosom ów [3,20,21].
D la porów nania, biogeneza egzosom ów zw iązana je s t z w yznakow aniem ubikw ityną w ybranych fragm entów błony przez białka endosom alnego kom pleksu sortującego w ym aganego do transportu pęcherzyków (ESC R T, ang. endosom al sorting com plex required for transport) i ich internalizacją do w czesnych endosom ów . W czesne endosom y zaw ierające now opow stałe egzosom y są nazyw ane ciałkam i w ielopęcherzykow ym i (M VB, ang. m ultivesicular bodies), a po ich fuzji z b łoną kom órkow ą
następuje uw olnienie egzosom ów do przestrzeni pozakom órkow ej [22]. C iałka apoptotyczne pow stają w yłącznie podczas procesu apoptozy, kiedy to dochodzi do dezintegracji całej zaw artości kom órki, a jej fragm enty po otoczeniu błoną są uw alniane w postaci pęcherzyków . G łów ną cechą odróżniającą ciałka apoptotyczne od pozostałych populacji EV s je s t obecność w nich organelli kom órkow ych [23].
1.2.2. M o le k u la rn e cargo ektosom ów
E ktosom y pow stają w obszarach błony kom órkow ej zaw ierających duże ilości cholesterolu, tj.
tratw ach lipidow ych, i posiadają b iałka z nim i zw iązane m .in. flotylinę 1, czynnik tkankow y (TF, ang.
tissue factor) oraz specyficzne m arkery pow ierzchniow e uw alniającej je kom órki. Struktura lipidow a błon ektosom ów je s t ponadto w zbogacona w sfingom ielinę, ceram idy, a także fosfatydyloserynę, przenoszoną z w ew nętrznej do zew nętrznej w arstw y błony kom órkow ej podczas form ow ania ektosom ów . B iałkam i pow szechnie w ystępującym i w ektosom ach są integryny oraz m etaloproteinazy.
E ktosom y m ogą przenosić też ligand dla P-selektyny, białka szoku cieplnego, cytokiny, chem okiny oraz czynniki w zrostu (epiderm alny, śródbłonka naczyń, fibroblastów ). E ktosom y charakteryzują się rów nież bogatą zaw artością kw asów nukleinow ych, głów nie m icroR N A , ale rów nież m R N A i niekodujących R N A [3].
1.2.3. F izjologiczna rola ektosom ów oraz ich zn a cze n ie w p ro cesa ch p a tolo giczn ych
EV s zostały po raz pierw szy opisane przez W o lfa w 1967 roku [24]. U żyw ając term inu „pył p ły tko w y” (ang. „platelet dust”) opisał on ektosom y uw alniane przez płytki krw i. Jednak przez dekady podobne struktury traktow ane były jak o zbędny m ateriał kom órkow y (ang. cellular debris). Dopiero w ostatnich latach b adania potw ierdziły ich funkcjonalną rolę w kom unikacji m iędzykom órkow ej oraz w regulacji szeregu zarów no fizjologicznych, ja k i patologicznych procesów zachodzących w kom órkach.
Jak dotąd najw ięcej badań przeprow adzono n a ektosom ach obecnych w e krw i, uw alnianych przez m .in. erytrocyty, płytki krw i, neutrofile czy m akrofagi. Z a ich głów n ą funkcję uznaje się stym ulację procesu krzepnięcia krw i zw iązaną z transportem TF [25] i czynnika X II krzepnięcia [26], oraz ekspozycji anionow ych fosfolipidów (głów nie fosfatydyloseryny) w zewnętrznej w arstw ie błony ektosom ów pochodzenia płytkow ego, do których agregują dodatnio naładow ane dom eny białek tw orzących skrzep [25]. Obecne w układzie krążenia ektosom y m o gą rów nież regulow ać odpow iedź im m unologiczną organizm u, a w yw ierany przez nie efekt m oże być zarów no p ro - [27], ja k i przeciw zapalny [28,29]. Zależy to od rodzaju transportow anych przez nie cytokin i receptorów dla chem okin. Co w ięcej, ektosom y m og ą stym ulow ać syntezę różnego rodzaju cytokin w kom órkach docelow ych. E fekt niezależny od cytokin zaobserw ow ano natom iast w przypadku ektosom ów transportujących ligand FasL, który indukuje apoptozę kom órek układu odpornościow ego [30].
W ykazano rów nież, że ektosom y uw alniane przez neutrofile są zdolne do opsonizacji bakterii, co um ożliw ia ich późniejsze rozpoznanie przez kom órki fagocytujące [31].
W e w szystkich populacjach EV s zidentyfikow ano rów nież b iałka charakterystyczne dla chorób
neurodegeneracyjnych: choroby A lzheim era (ß-am yloid i białko tau), choroby P arkinsona (a-synukleina), pląsaw icy H untingtona (huntingtyna) oraz stw ardnienia zanikow ego bocznego (białko TD P-43) [32]. K rytyczna dla transportu w ym ienionych białek je s t populacja ektosom ów . Ektosom y uw alniane przez kom órki m ikrogleju przenoszą znacznie w iększe ilości b iałk a tau niż egzosom y [33], a nierozpuszczalna form a ß-am yloidu je s t w ektosom ach konw ertow ana do jeg o neurotoksycznej rozpuszczalnej form y [34]. Ponadto, w ektosom ach uw alnianych przez kom órki m ikrogleju potw ierdzono obecność anandam idu, psychoaktyw nego zw iązku z grupy kannabinoidów [35]. Zw iązek ten inhibuje uw alnianie kw asu y-am inom asłow ego (G A BA , ang. y-am inobutyric acid) w obrębie synapsy, czego następstw em je s t utrzym yw anie się stanu pobudzenia kom órek nerw ow ych i zw iększona pobudliw ość u pacjentów neurologicznych.
E ktosom y pełnią rów nież istotną rolę podczas regeneracji tkanek [36,37]. Po ich uw olnieniu przez kom órki uszkodzonej tkanki, ektosom y stym ulują m igrację i różnicow anie kom órek m acierzystych w m iejscu uszkodzenia [38]. Z drugiej strony, kom órki m acierzyste uw alniają ektosom y ham ujące apoptozę kom órek uszkodzonej tkanki [39] oraz regulujące syntezę cytokin przez kom órki dendrytyczne, efektorow e lim focyty T i kom órki N K (ang. natural killer cells), odpow iadające za odczyn zapalny w m iejscu uszkodzenia [36]. Ponadto, endotelialne kom órki m acierzyste uw alniają ektosom y w zbogacone w czynniki proangiogenne (głów nie jak o m R N A i m iR N A ), stym ulujące rew askularyzację uszkodzonych tkanek [40]. W łaściw ość ta czyni ektosom y potencjalnym celem w terapiach schorzeń zw iązanych z uszkodzeniem naczyń krw ionośnych [41,42].
1.3. Z n a c z e n ie e k to s o m ó w w p r o g r e s j i n o w o tw o r ó w
W szystkie populacje EV s m ogą być uw alnianie zarów no przez kom órki praw idłow e, ja k i kom órki przechodzące transform ację now otw orow ą. W porów naniu do ogrom nej liczby danych dotyczących znaczenia egzosom ów w procesie karcynogenezy, w iedza n a tem at ektosom ów pochodzenia now otw orow ego je s t w ciąż ograniczona. N iem niej jednak, stale rosnąca liczba badań nad tą populacją EV s potw ierdza ich funkcjonalną rolę n a różnych etapach progresji now otw oru oraz ich potencjał diagnostyczno-terapeutyczny.
U w alnianie ektosom ów przez kom órki now otw orow e zostało opisane po raz pierw szy w 1978 roku w badaniach z w ykorzystaniem hodow li tkankow ej guzów ze śledziony i w ęzłów chłonnych od pacjentów z chłoniakiem H odgkina [43]. W późniejszych latach u pacjentów z glejakiem w ielopostaciow ym [44], niedrobnokom órkow ym rakiem płuc [45] i szpiczakiem m nogim [46]
zaobserw ow ano w zrost liczby ektosom ów w e krw i obw odow ej. Z drugiej strony spadek liczby uw alnianych ektosom ów zaobserw ow ano u pacjentów z rakiem okrężnicy [47]. Tak w ięc zm iany w liczbie uw alnianych ektosom ów w ydają się być bezpośrednio zw iązane z typem now otw oru.
U w alnianie EVs, w tym ektosom ów , uznaw ane je s t rów nież za jed en z niegenetycznych m echanizm ów sprzyjających fenotypow ej transform acji kom órek now otw orow ych. B adania z w ykorzystaniem kom órek glejaka w ykazały, że uw alniane przez nie ektosom y tran spo rtu ją onkogenną w ersję receptora
dla epiderm alnego czynnika w zrostu (EG FR vIII, ang. epiderm al grow th factor receptor vIII) do nieinw azyjnych kom órek, czego efektem je s t ich w zm ożona proliferacja i nabyw anie fenotypu m ezenchym alnego [48].
B ioaktyw ne cargo ektosom ów m oże rów nież regulow ać proliferację, m igrację i inw azję kom órek now otw orow ych, a także proces angiogenezy i tw orzenie niszy prem etastatycznej. EV s są przede w szystkim nośnikam i białek biorących udział w degradacji m acierzy zew nątrzkom órkow ej (ECM , ang.
extracellular m atrix), głów nie m etaloproteinaz (M M Ps ang. m atrix m etalloproteinases) [49-54]
i adam alizyn [55], a także endogennych regulatorów ich aktyw ności: C D147 [56], urokinazow ego aktyw atora plazm inogenu (uPA, ang. urokinase plasm inogen activator) [53] czy serpiny B2 [57].
D otychczas obecność i aktyw ność proteolityczną M M P-2 i M M P-9 zaobserw ow ano w ektosom ach uw alnianych m .in. przez kom órki w łókniakom ięsaka [49], raka ja jn ik a [50], piersi [51], prostaty [52,53]
i płuc [54], a także przez kom órki podścieliska g u za (fibroblasty) [52].
A ktyw ność M M Ps w obrębie E C M je s t kluczow a zarów no d la m igracji i inw azji kom órek now otw orow ych, ja k rów nież dla procesu angiogenezy. Do innych czynników proangiogennych zidentyfikow anych w ektosom ach i m ających udokum entow any w pływ n a kom órki śródbłonka naczyń w w arunkach in vitro, zalicza się też czynnik w zrostu śródbłonka naczyniow ego (VEGF, ang. vascular endothelial grow th factor) [58,59], interleukinę 6 (IL -6) [59], transform ujący czynnik w zrostu ß (TG F-ß, ang. transform ing grow th factor ß) [60], sfingom ielinę [61] oraz cząsteczki m iR -1246 [60].
W w arunkach in vivo ektosom y uw alniane przez kom órki now otw orow e zw iększają m obilizację kom órek endotelialnych i gęstość sieci naczyniow ej g uza u m yszy, a efekt ten znosi uprzednia inkubacja ektosom ów z przeciw ciałam i anty-V EG F [62].
E ktosom y prom ują rów nież stan prokoagulacyjny, typow y dla progresji now otw oru. W ykazano, że ektosom y uw alniane w obecności trom biny przez kom órki neuroblastom y indukow ały agregację płytek krw i [63]. Co w ięcej, ektosom y pochodzenia now otw orow ego przenoszą cząsteczki CD41 i P -selektynę - specyficzne ligandy aktyw ow anych płytek krw i, prom ujące adhezję kom órek now otw orow ych do śródbłonka naczyń krw ionośnych i tw orzenie skrzepu [64,65]. W ektosom ach obserw uje się rów nież zw iększoną ekspresję TF, a jeg o poziom został skorelow any ze stopniem agresyw ności różnych linii kom órkow ych raka piersi [6 6].
EV s uczestniczą rów nież w ucieczce kom órek now otw orow ych spod nadzoru im m unologicznego.
Zaobserw ow ano m iędzy innym i ich działanie chem otaktyczne w zględem granulocytów , lim focytów i m akrofagów , co m oże stanow ić m echanizm , dzięki którem u kom órki odpornościow e w ykazujące aktyw ność przeciw now otw orow ą nie grom adzą się w obrębie gu za [67]. Ektosom y pochodzenia now otw orow ego m ogą rów nież ham ow ać różnicow anie m onocytów w kom órki dendrytyczne prezentujące antygen [6 8] lub prozapalne m akrofagi ty pu M1 [69]. Co w ięcej, ektosom y stym ulują syntezę przeciw zapalnych cytokin np. TG F-ß, ham ując w efekcie aktyw ność lim focytów T cytotoksycznych [6 8]. Im m unosupresyjny efekt nie je s t jed n ak obserw ow any w przypadku w szystkich
z hodow li różnych liniach kom órkow ych raka trzustki, okrężnicy i płuca indukow ały syntezę prozapalnych cytokin (IL-12 oraz czynnika m artw icy now otw oru a (TN F-a, ang. tu m o r necrosis factor)) oraz reaktyw nych form tlenu przez m akrofagi ty pu M1 [70].
E ktosom y pochodzenia now otw orow ego są rów nież nośnikiem białek zw iązanych z opornością w ielolekow ą - P-glikoproteiny oraz b iałk a oporności w ielolekow ej (M RP1, ang. m ultidrug resistance protein 1). Ektosom alny transfer obu białek z opornych na chem ioterapię kom órek białaczki m ieloidalnej, zm niejszał skuteczność terapii w przypadku inkubow ania kom órek linii w rażliw ych na leki z ektosom am i [71]. E ktosom y m og ą rów nież bezpośrednio uczestniczyć w usuw aniu chem ioterapeutyków z kom órek now otw orow ych. W ykazano, że kom órki raka piersi traktow ane doksorubicyną akum ulow ały, a następnie usuw ały lek za pośrednictw em ektosom ów [72]. W zw iązku z pow yższym , inhibicja procesu uw alniania ektosom ów oraz innych populacji EV s, m oże w niektórych przypadkach zw iększać skuteczność stosow anych terapii antynow otw orow ych. W przypadku kom órek raka prostaty traktow anych kalpeptyną (inhibitorem kalpainy, k tó ra to bierze udział w biogenezie ektosom ów ) zaobserw ow ano w zrost ich w rażliw ości n a docetaksel [73].
1.4. F u n k c j o n a l n a r o l a e k to s o m ó w w p r o g r e s j i c z e r n i a k a z ło ś liw e g o
C zerniak złośliw y to jed en z najbardziej agresyw nych now otw orów , charakteryzujący się szybkim w zrostem i w czesnym tw orzeniem przerzutów . Liczba diagnozow anych rokrocznie przypadków stale rośnie, a śm iertelność, pom im o rozw oju now oczesnych terapii, je s t nadal bardzo w ysoka [74].
N ow o tw ór ten diagnozow any je s t najczęściej ju ż po w ystąpieniu przerzutów , kiedy to rokow ania i szanse n a w yleczenie znacząco m aleją. W zw iązku z pow yższym , b adania dotyczące EVs, w tym ektosom ów , uw alnianych przez kom órki czerniaka oraz ich w pływ u n a kom órki docelow e są cenne w kontekście lepszego poznania m echanizm ów tow arzyszących progresji czerniaka.
Już w latach 80. X X w ieku zaobserw ow ano, że ektosom y uw alniane przez linie kom órkow e czerniaka po internalizacji przez kom órki o mniej inw azyjnym fenotypie zw iększały ich potencjał m etastatyczny [75]. B adania nad tą populacją EV s w znow iono niedaw no, w ykazując dw ukrotnie w yższą liczbę ektosom ów uw alnianych in vitro przez kom órki czerniaka w porów naniu do m elanocytów [76]. W porów naniu do m elanocytów , ektosom y przenoszą rów nież więcej TF inicjującego stan prokoagulacyjny [76]. Ponadto, m og ą one prom ow ać inw azję i tw orzenie przerzutów przez kom órki czerniaka poprzez transfer m etaloproteinaz i/lub ich endogennych aktyw atorów [77,78], podobnie ja k stym ulow ać proces specjalizacji fibroblastów w kierunku fibroblastów tw orzących podścielisko g uza (tzw. CAFs, ang. cancer-associated fibroblasts) [79]. W przypadku czerniaka, opisano rów nież supresję odpow iedzi im m unologicznej w w yniku ektosom alnego transferu ligandu Fas, inicjującego sygnalizację proapoptotyczną m .in. w lim focytach T [80].
Ze w zględu n a niew ielką liczbę badań nad ektosom am i uw alnianym i przez kom órki czerniaka, w arto w spom nieć o funkcjonalnym w pływ ie egzosom ów . Obie populacje są uw alniane przez kom órki czerniaka jednocześnie, a ze w zględu n a częściow e podobieństw o m olekularnego cargo, ich działanie
je s t często synergistyczne. B adania n a m odelu m ysim w ykazały zw iększoną proliferację i inw azyjność kom órek g uza po ich stym ulacji egzosom am i w yizolow anym i z kondycjonow anych pożyw ek z hodow li inw azyjnych kom órek czerniaka [81]. Co w ięcej, egzosom y te sprzyjały tw orzeniu guzów w tórnych w kościach. Z a organotropizm odpow iedzialna b y ła praw dopodobnie zróżnicow ana obecność integryn w egzosom ach. U m yszy inokulow anych egzosam am i przenoszącym i integryny a6ß4 i a6ß1 przew ażały przerzuty do płuc, podczas gdy obecność integryny avß5 p rom ow ała przerzuty do w ątroby [82].
Egzosom y w pływ ają rów nież n a inicjację przejścia epitelialno-m ezenchym alnego (EM T, ang.
epithelial-m esenchym al transition) w kom órkach czerniaka poprzez zm iany w ekspresji m arkerów m ezenchym alnych, to je s t ham ow anie ekspresji E -kadheryny i w zrost ekspresji w im entyny oraz czynników transkrypcyjnych Z E B 2 i SN A IL2 [83].
E gzosom y uw alnianie przez kom órki czerniaka są rów nież nośnikam i M M Ps, V E G F i innych klasycznych czynników proangiogennych [84]. U dokum entow ano ich zdolność do stym ulacji angiogenezy zarów no w obrębie g uza pierw otnego, ja k i w miej scach tw orzenia niszy prem etastatycznej m .in. w w ęzłach chłonnych, poprzez indukcję ekspresji V EG F, uPA , T N F -a oraz czynnika indukow anego hipoksją 1 (HIF-1, ang. hypoxia-inducible factor 1) [85].
W kontekście odpow iedzi im m unologicznej, egzosom y uw alniane przez kom órki czerniaka ham ują różnicow anie prezentujących antygen kom órek dendrytycznych, a także funkcjonow anie lim focytów T regulatorow ych, pośrednio ograniczając w ten sposób aktyw ację lim focytów T cytotoksycznych [86,87]. E gzosom y m ogą rów nież ograniczać aktyw ację lim focytów T cytotoksycznych, w pływ ając n a proces oddychania m itochondrialnego [8 8].
U w alnianie EV s m oże być rów nież jed n y m z czynników decydujących o nieskuteczności leków stosow anych w terapii czerniaka. W odpow iedzi n a leki z rodziny inhibitorów genu B R A F (w tym typow ej dla czerniaka m utacji B R A F V600E), kom órki czerniaka u w alniają egzosom y zaw ierające R N A sprzyjające oporności n a w spom nianą grupę leków [89]. Inne m echanizm y oporności w ielolekow ej opierają się n a egzosom alnym transporcie białek zaangażow anych w napraw ę D NA , co zw iększa przeżyw alność kom órek czerniaka i w zrost g uza niezależnie od stosowanej chem ioterapii [90].
Z decydow anie najm niej w iadom o o roli ciałek apoptotycznych produkow anych przez ulegające apoptozie kom órki czerniaka. Pojedyncze badania pokazały, że ciałka apoptotyczne uw alnianie przez kom órki m ysiej linii B16-F1 p osiadają w yższą aktyw ność prokoagulacyjną w stosunku do innych populacji EV s zw iązaną z ilością TF i fosfatydyloseryny. Co w ięcej, u m yszy, którym podano w yizolow ane ciałka apoptotyczne przed inokulacją kom órkam i czerniaka, pierw otne guzy rozw ijały się później niż w przypadku podania ektosom ów i egzosom ów [91]. W yniki te potw ierdziły w pływ ciałek apoptotycznych zarów no n a proces koagulacji, ja k i odpow iedź układu im m unologicznego w zględem kom órek now otw orow ych.
1.5 . Z n a c z e n ie g lik o z y la c ji b i a ł e k w b io lo g ii m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h
G likozylacja je s t je d n ą z najczęstszych m odyfikacji białek oraz lipidów . W przeciw ieństw ie do
biosyntezy DNA, R N A i białek, synteza glikanów nie zachodzi n a bazie żadnej m olekularnej m atrycy.
Przebieg procesu glikozylacji je s t regulow any pośrednio przez ekspresję genów kodujących syntezę enzym ów biorących udział w syntezie glikanów , ekspresję i aktyw ność glikozylotransferaz i glikozydaz oraz dostępności określonych reszt cukrow ych, dlatego w zględna ilość i struktura glikanów je s t kom órkow o-, tkankow o- i gatunkow o-specyficzna [92].
G likozylacja białek odgryw a kluczow ą rolę w szerokim spektrum procesów biologicznych, w tym sygnalizacji w ew nątrz- i m iędzykom órkow ej, rozpoznaw aniu kom órkow ym , adhezji i m igracji kom órek, transporcie w ew nątrzkom órkow ym białek i kontroli ich fałdow ania [93]. Z kolei proteoglikany stanow iące istotny składnik m acierzy zew nątrzkom órkow ej, w spółuczestniczą w tw orzeniu struktury tkanek [94]. Od niedaw na obserw ow any je s t w zrost liczby badań skupiających się n a analizie profilu glikozylacji EVs. W ykazano, że EV s przenoszą liczne glikoproteiny posiadające specyficzne struktury cukrow e, ale nadal niew iele w iadom o o roli ja k ą p ełnią te glikany w biologii EVs.
C oraz w iększa liczba badań potw ierdza, że różnorodne struktury cukrow e biorą udział w sortow aniu białek do EV s i istotnie w pływ ają n a w ydajność procesu sortow ania. W przypadku egzosom ów inhibicja enzym ów działających n a określonych etapach syntezy N -glikanów lub punktow e m utacje potencjalnych m iejsc N -glikozylacji obniżały lub zw iększały w ydajność sortow ania w ybranych białek do EV s [95,96], co zostanie szerzej om ów ione w D yskusji. W m echanizm ie sortow ania zależnym od glikozylacji biorą udział też proteoglikany. O becność siarczanu heparanu przyłączonego do syndekanu, transbłonow ego białka, w arunkow ała jeg o inkorporację do egzosom ów uw alnianych przez kom órki kilku typów now otw orów , co w ykazano stosując heparanazę, enzym katalizującego degradacje tego glikozoam inoglikanu [97]. K olejny potencjalny m echanizm sortow ania białek do EV s zależy od w ew nątrzkom órkow ego oddziaływ ania glikoprotein z białkam i należącym i do rodziny galektyn, będących lektynam i zdolnym i do w iązania ß-galaktozydów , w tym jedn ostek N -acetylolaktozoam inylow ych. B adania n a m odelu m ysim pokazały, że ilość jednostek N -acetylolaktozoam inylow ych w egzosom ach uw alnianych przez retikulocyty zależy od w ew nątrzkom órkow ej ekspresji (ilości) galektyny 5 [98].
G likoproteiny i proteoglikany obecne n a pow ierzchni EV s w ydają się odgryw ać kluczow ą rolę rów nież podczas interakcji EV s z kom órkam i docelow ym i. W dotychczasow ych badaniach indukow ane zm iany w profilu pow ierzchniow ej glikozylacji EV s, takie ja k ich deglikozylacja czy desialilacja, pow odow ały w zrost lub spadek stopnia inkorporacji EVs przez kom órki docelow e [99] lub w pływ ały n a stopień ich akum ulacji w określonych tkankach bądź narządach [100]. W innych badaniach po w prow adzeniu z w ykorzystaniem technik inżynierii genetycznej now ych potencjalnych m iejsc N -glikozylacji do struktury białka błonow ego zw iązanego z lizosom am i Lam p2b (ang. lysosom e- associated m em brane protein 2b) obserw ow ano zw iększoną internalizację Lam p2b-pozytyw nych egzosom ów przez kom órki neuroblastom y [101]. W przypadku egzosom ów uw alnianych przez retikulocyty szczura zaobserw ow ano, że do ich internalizacji przez m akrofagi konieczna je s t obecność w ich cargo glikozylow anej galektyny 5 [98]. Ponadto, w ykazano, że obecność siarczanu heparanu
w proteoglikanach zm niejsza internalizację EV s przez kom órki glejaka w ielopostaciow ego [102] i raka pęcherza m oczow ego [103] oraz praw idłow e kom órki gw iaździste w ątroby [104].
1.6. G l i k o z y la c ja m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h w c h o r o b a c h n o w o tw o r o w y c h
M olekularny skład EV s m oże różnić się w zależności od typ u uw alniających je kom órek, a także podlegać dynam icznym zm ianom w stanach patologicznych. Z m iany w profilu glikozylacji białek obserw ow ane są w różnych stanach chorobow ych nie tylko na poziom ie kom órkow ym , ale rów nież w w yizolow anych populacjach EVs. N a przykład, egzosom y w yizolow ane z m oczu pacjentów z galaktozem ią, genetycznie uw arunkow anym upośledzeniem przekształcania pochodzącej z laktozy galaktozy w glukozę, charakteryzow ały się m niejszą ilością N -glikanów typ u w ielom annozow ego w porów naniu do grupy kontrolnej [105].
Z m iany w profilu glikozylacji białek są rów nież charakterystyczne d la EV s uw alnianych przez kom órki różnych typów now otw orów . W ykorzystując m acierze lektynow e w ykazano, że egzosom y uw alniane przez kom órki czerniaka skóry, białaczki i raka okrężnicy p o siadają charakterystyczne w zory glikozylacji [106]. W e w szystkich przypadkach egzosom alne glikoproteiny były w zbogacone w N -glikany typu w ielom annozow ego oraz a2,6-sialilow ane N -glikany typ y kom pleksow ego. W innych badaniach w ysokospraw na chrom atografia cieczow a (H PLC , ang. high perform ance liquid chrom atography) pozw oliła zaobserw ow ać w iększą ilość N -glikanów typu w ielom annozow ego i trzyantenow ych N -glikanów typu kom pleksow ego z przedzielającą N -acetyloglukozoam ininą (G lcN A c) w egzosom ach uw alnianych przez kom órki raka ja jn ik a w porów naniu do egzosom ów uw alnianych przez kom órki praw idłow e. Z w iększoną ekspresję tych sam ych struktur zaobserw ow ano rów nież w tkance guza, co w skazuje n a m ożliw ość w ykorzystania egzosom ów w raku jajn ik a do celów diagnostycznych [107].
Profil glikozylacji w ybranych białek transportow anych przez EV s m oże prom ow ać progresję now otw oru. O becność w ielokrotnie N -glikozylow anych cząsteczek zew nątrzkom órkow ego czynnika indukującego aktyw ność m etaloproteinaz m acierzy zew nątrzkom órkow ej (E M M PR IN , ang.
extracellular m atrix m etalloproteinase inducer) w egzosom ach uw alnianych przez inw azyjne kom órki raka piersi zw iększała m igrację kom órek now otw orow ych, co udow odniono w eksperym entach z enzym atycznie deglikozylow anym i egzosom am i [108]. Innym i glikoproteinam i, których obecność została rów nież stw ierdzona w EV s są m .in. integryny, rodzina białek adhezyjnych odgryw ająca kluczow ą rolę podczas adhezji i m igracji kom órek, a także dw a czynniki w zrostu - TG F-ß i epiderm alny (EGF, ang. epiderm al grow th factor), których m utacje zalicza się do czynników prom ujących progresję now otw oru [109]. Jednakże, w pływ transferu w spom nianych glikoprotein za pośrednictw em EV s na behaw ior kom órek now otw orow ych nie został jeszcze zbadany.
W różnych populacjach EV s potw ierdzono obecność szeregu glikoprotein w ykorzystyw anych aktualnie w diagnostyce klinicznej now otw orów , w tym m ucyny-1 (M U C 1) będącej m arkerem raków pochodzenia nabłonkow ego (w tym raka piersi), antygenu C A 19-9 - m arkera raka trzustki, antygenu
karcinoem brionalnego (CEA, ang. carcinoem bryonic antigen) - m arkera rak a okrężnicy, oraz m arkerów now otw oru jajnika: CA 125, C D 24 i cząsteczki adhezyjnej kom órek nabłonkow ych (EpC A M , ang.
epithelial cell adhesion m olecule) [109]. U stalenie czy w ym ienione bądź też inne glikoproteiny charakterystyczne dla różnych typów now otw orów ulegają w zbogaceniu w EVs, które są obecne w płynach ustrojow ych pacjentów onkologicznych pow inno stać się przedm iotem szeroko zakrojonych badań, prow adzących do opracow ania now ych strategii diagnostycznych.
1.7. Z m i a n y w p r o f il u g lik o z y la c ji k o m ó r e k c z e r n i a k a z ło ś liw e g o i u w a ln i a n y c h p r z e z n ie m i k r o p ę c h e r z y k ó w b ło n o w y c h
W iedza n a tem at glikozylacji EV s uw alnianych przez kom órki czerniaka je s t znikom a w porów naniu do szeroko opisanych zm ian glikozylacji n a poziom ie kom órkow ym . Poniew aż w EV s nie dochodzi do syntezy de novo ani m odyfikacji glikanów , rodzaj struktur cukrow ych sortow anych i identyfikow anych w EV s zależy w yłącznie od w cześniejszego przebiegu procesu glikozylacji w kom órce. Określone zm iany w profilu glikozylacji kom órek czerniaka p ojaw iają się ju ż n a początku transform acji now otw orow ej m elanocytów i są obserw ow ane n a w szystkich etapach choroby, inne są charakterystyczne dla poszczególnych (lub kilku) faz w zrostu (radialnej, w ertykalnej) lub po jaw iają się w yłączenie w guzach w tórnych w kom órkach m etastatycznych [110,111]. Do najczęściej obserw ow anych zm ian zalicza się m .in. spadek lub nadekspresję w ybranych glikanów w stosunku do kom órek praw idłow ych, ekspresję glikanów obserw ow anych w yłącznie w tkankach em brionalnych, ekspresję niekom pletnych („skróconych”) łańcuchów oligosacharydow ych, a także ekspresję całkow icie now ych struktur cukrow ych tzw . neoglikanów [1 1 2 ].
W przypadku N -glikozylacji kom órek czerniaka, najbardziej charakterystyczną zm ianą tow arzyszącą transform acji now otw orow ej je s t w zrost ekspresji i/lub aktyw ności N -acetyloglukazoam inotransferazy V (GnT-V, ang. N -acetylglucosam inyltransferase V ), co pow oduje zw iększenie ilości ß 1 ,6 -rozga^zionych N -glikanów typu kom pleksow ego. Z drugiej strony, G nT-V konkuruje o ten sam substrat z N -acetyloglukazoam inotransferazą III (G nT-III, ang.
N -acetylglucosam inyltransferase III), katalizującą syntezę N -glikanów z przedzielającą N -acetyloglukazam iną (G lcN A c, ang. N -acetyloglucosam ine) W ysoka ekspresja i aktyw ność G nT-III un iem ożliw ia tw orzenie ß1,6-rozgałęzień łańcucha oligosacharydow ego przez G nT-V , co osłabia potencjał inw azyjny i m etastatyczny kom órek now otw orow ych [113]. N iem niej jed n ak w przypadku w ybranych innych typów now otw orów w zrost ekspresji G nT-III m oże rów nież prom ow ać progresję now otw oru [114].
Do glikoprotein m odyfikow anych przez G nT-V w kom órkach czerniaka należą m .in. integryny, receptor adhezyjny w iążący białko M ac-2 (ang. M ac-2 binding protein) oraz cząsteczka adhezyjna kom órek czerniaka (M CA M , ang. m elanom a cell adhesion m olecule) [115]. W w arunkach in vitro w yższa ekspresja ß1,6-ro zg a^z io n y c h struktur w kom órkach czerniaka gałki ocznej korelow ała ze zw iększoną m igracją kom órek po fibronektynie (składniku ECM ) [116,117]. Co w ięcej, w barw ieniu
histologicznym guzy w tórne w ykazyw ały bardziej hom ogenną ekspresję ß1,6-ro zg a^zio n y ch N -glikanów typu kom pleksow ego w porów naniu do guzów pierw otnych [118]. A ntagonistyczny efekt G nT-III zaobserw ow ano natom iast w m ysim m odelu czerniaka, gdzie inokulacja kom órkam i B16 z nadekspresją G nT-III daw ała m niejszą liczbę p rzerzutów do płuc w porów naniu do inokulacji kom órkam i kontrolnym i [119]. R edukcję potencjału m etastatycznego kom órek czerniaka w w arunkach in vitro i in vivo zaobserw ow ano rów nież w w yniku działania sw ainsoniny będącej inhibitorem a-m annozydazy II aparatu G olgiego i ham ującej syntezę N -glikanów ty pu kom pleksow ego [120,121].
M etastatyczne linie kom órkow e czerniaka w ykazują w iększą ekspresję a1,6-fukozylotransferazy (F U T -8, ang. a1,6-fucosyltransferase) w porów naniu do linii kom órkow ych w yprow adzonych z guzów pierw otnych [122]. R ów nież u pacjentów z przerzutam i czerniaka zaobserw ow ano w yższy poziom F U T- 8 w surow icy w porów naniu do chorych bez przerzutów , a w yniki te potw ierdzono w ykonując knockout F U T- 8 w liniach kom órkow ych oraz m ysim m odelu in vivo [123]. W tych sam ych badaniach w ykazano rów nież, że tw orzenie przerzutów m oże być zależne od rdzennej fukozylacji neuronalnej cząsteczki adhezyjnej (L1C A M , ang. L1 cell adhesion m olecule) w kom órkach czerniaka [123].
W kom órkach now otw orow ych obserw ow ane są rów nież zm iany stopnia sialilacji glikanów , co w y nik a ze zm ian w ekspresji i/lub aktyw ności a2,3/6/8-sialotransferaz. W zrost ilości kw asów sialow ych nadaje pow ierzchni kom órki bardziej ujem ny ładunek, a to osłabia adhezję kom órek g u za do kom órek podścieliska lub składników ECM , co w konsekw encji sprzyja ich rozsiew aniu. Co w ięcej, duża ilość term inalnych kw asów sialow ych tw orzy gęstą, am orficzną w arstw ę w obrębie glikokaliksu utrudniającą kom órkom układu odpornościow ego rozpoznaw anie epitopów znajdujących się w początkow ych fragm entach łańcucha glikanu n a pow ierzchni kom órek now otw orow ych [124,125].
W badaniach n a kilku liniach kom órkow ych czerniaka zaobserw ow ano, że ilość a2,3-w iązanych kw asów sialow ych w zrasta w raz potencjałem m etastatycznym kom órek, podczas gdy kom órki linii w yprow adzonych ze zm ian pierw otnych w ykazują przew agę kw asów sialow ych w iązanych a2,6-glikozydow o [126,127]. Ponadto, obecność cząsteczek a2,3-w iązanych kw asów sialow ych na pow ierzchni kom órek czerniaka prom ow ała ich m igrację po fibronektynie [128]. W przypadku cząsteczek z w iązaniem a2 ,6, enzym atyczna desialilacja lub w yciszenie genu dla ß-galakto zyd o-a2 ,6 - sialoltransferazy zm niejszała adhezję i inw azję kom órek czerniaka [129]. Znaczenie a2 ,3 - i a2,6- w iązanych kw asów sialow ych potw ierdziły rów nież badania na trzech liniach kom órkow ych czerniaka transfekow anych genem dla a1,3-galaktozylotransferazy, konkurującej o ten sam akceptor, tj. reszty N -acetyloaktozoam iny, z a2,3- i a2,6-sialoltransferazam i. Transfekow ane kom órki charakteryzow ały się obniżoną sialilacją białek błony kom órkow ej i niższym potencjałem m etastatycznym [130].
W zbogacenie w a2,3-w iązane kw asy sialow e dotyczy rów nież sialilow anych form antygenów Lew is X (N euN A c-a2,3-G al-ß1,4-(Fuc-a1,3)-G lcN A c-ß-) i Lew is A (N euN A c-a2,3-G al-ß1,3-(Fuc-a1,4)- G lcN A c-ß-) obecnych zarów no w O-, ja k i N -glikanach. A ntygeny te sprzyjają agregacji kom órek now otw orow ych z płytkam i krw i i leukocytam i, a także u czestniczą w ich ekstraw azacji dzięki
[131]. Praw idłow e ludzkie m elanocyty w ykazują brak ekspresji sialilow anej form y antygenu Lew is X i słabą ekspresję sialilow anego antygenu Lew is A; nadekspresją tych struktur je s t natom iast obserw ow ana w przypadku linii kom órkow ych czerniaka i rów nież tkanek g uza [132]. B adania w ykazały, że transfekcja genam i kodującym i enzym y zaangażow ane w syntezę sialilow anych form antygenów Lew is X i Lew is A, odpow iednio a1,3- i a1,4-fukozylotransferazy, zw iększała potencjał m etastatyczny kom órek czerniaka zarów no w w arunkach in vitro [133,134], ja k i w m ysim m odelu in vivo [135]. Co więcej, u m yszy z nadekspresją E-selektyny (wiążącej sialilow ane antygeny Lew is) w hepatocytach zaobserw ow ano zw iększoną liczbę przerzutów w w ątrobie [135].
W kom órkach czerniaka obserw uje się rów nież charakterystyczne zm iany w O -glikozylacji m .in.
w ekspresji antygenów T (G al-ß1,3-G alN A c-a1-O -S er/T hr) oraz Tn (G alN A c-a1-O -Ser/T hr), w tym jeg o sialilow anej form y (sTn, N euN A c-a2,6-G alN A c-a1-O -S er/T hr). E pitopy te są nieobecne n a kom órkach epitelialnych, co czyni je bardzo charakterystycznym m arkerem zm ienionych now otw orow o tkanek. A ntygen T zw iązany je s t ze zw iększoną proliferacją kom órek now otw orow ych, ale rów nież ich niskim potencjałem m etastatycznym , podczas gdy antygeny T n i sTn są typow e dla kom órek o bardziej agresyw nym fenotypie [136-138]. W barw ieniu histologicznym m etastatycznych guzów czerniaka z w ykorzystaniem lektyn zaobserw ow ano spadek ekspresji antygenu T, czem u tow arzyszył jednoczesny w zrost ekspresji jeg o prekursorow ej form y Tn w porów naniu do guzów pierw otnych [139].
W kom órkach czerniaka jed n y m z białek posiadających antygen Tn je s t nukleolina, zdolna do w iązania cząsteczek głów nego kom pleksu zgodności tkankow ej klasy I (M H C I, ang. m ajor histocom patibility com plex class I) [140]. A ntygen Tn obecny n a pow ierzchni kom órek czerniaka je s t zatem obiecującym celem w im m unodiagnostyce oraz im m unoterapii czerniaka.
D otychczasow a w iedza n a tem at glikozylacji EV s uw alnianych przez kom órki czerniaka pochodzi z zaledw ie trzech prac eksperym entalnych, z których dw ie zostały ju ż w spom niane w R ozdziałach 1.5 i 1.6. W badaniach tych w ykazano w zbogacenie egzosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka w N -glikany typu w ielom annozow ego, a2,6-sialilow ane N -glikany typy kom pleksow ego oraz jed no stki polilaktozoam inow e [106], a także zadem onstrow ano zależny od ilości N-glikanów typu kom pleksow ego m echanizm inkorporacji glikoproteiny EW I-2 do egzosom ów [95]. W najnow szych badaniach przy użyciu H P L C porów nano natom iast glikozylację trzech linii kom órkow ych m ysiego czerniaka (B 16-F1, B 16-F10 i B 16-B L6) i uw alnianych przez nie egzosom ów . Piki odpow iadające ośm iu strukturom N -glikanów o najw yższej ekspresji (głów nie czteroantenow ym ß 1 ,6-ro zga^zio ny m N -glikanom z rdzenną fukozą) w kom órkach B 16-F10 zidentyfikow ano rów nież w uw alnianych przez nie egzosom ach, a ich w zględna ekspresja b y ła 1 0 -krotnie w yższa w porów naniu do uw alniających je kom órek. K om órki pozostałych dw óch linii i odpow iadające im egzosom y rów nież w ykazyw ały w ysokie podobieństw o pod w zględem dom inujących typów N -glikanów . W przypadku egzosom ów uw alnianych przez kom órki linii B16-F1 nie zaobserw ow ano jed n ak typow ej dla kom órek wysokiej ekspresji w ybranych struktur trzyantenow ych [141].
W spom niane podobieństw a i różnice w profilu glikozylacji kom órek czerniaka i uw alnianych przez
nie EVs, czynią zasadnym i dalsze badania w ykorzystujące inne linie kom órkow e - reprezentujące różne stadia choroby czy też różne typy kliniczne czerniaka. Ponadto, dotychczasow e badania dotyczyły w yłącznie populacji egzosom ów . N a potrzebę przeprow adzania podobnych analiz w przypadku ektosom ów w skazuje przede w szystkim m echanizm ich biogenezy tj. form ow anie w obrębie błony kom órkow ej. W przeciw ieństw ie do egzosom ów (pow stających w ew nątrz kom órki), ektosom y przenoszą głów nie b iałka błonow e, przede w szystkim receptory i białk a adhezyjne, których profil glikozylacji m a kluczow e znaczenie d la sygnalizacji m iędzy- i w ew nątrzkom órkow ej oraz m igracji kom órek now otw orow ych. Co w ięcej, w zw iązku ze zw ykle zbyt późn ą diagnozą czerniaka, zw ykle w m om encie w ystąpienia przerzutów , i w yso ką śm iertelnością, m ożliw ość w ytypow ania potencjalnych m arkerów czerniaka w śród białek (w tym glikoprotein) obecnych w ektosom ach p łynów ustrojow ych, m ogłaby przyczynić się w przyszłości do opracow ania now ych m etod diagnostycznych i leczenia tego now otw oru z w ykorzystaniem EV s jak o system ów dostarczania leków.
2. C
e l p r a c y,
h i p o t e z y i z a d a n i a b a d a w c z eW e W stępie do poniższej pracy doktorskiej w ykazano, że m ikropęcherzyki błonow e są nośnikam i szeregu białek zaangażow anych w proces karcynogenezy, a w tym glikoprotein. O ile liczba badań nad składem białkow ym i cukrow ym egzosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka stale rośnie, nie przeprow adzono ja k dotąd analogicznej analizy dotyczącej cargo ektosom ów .
W poniższej pracy podjęto zatem próbę w eryfikacji hipotezy zakładającej, że ektosom y uw alniane przez kom órki czerniaka złośliw ego:
1. są nośnikam i szeregu białek zw iązanych z rozw ojem i progresją now otw oru,
2 . są nośnikam i struktur cukrow ych odgryw ających rolę podczas sortow ania białek do ektosom ów , 3. posiadają cukrow e antygeny zw iązane z now otw orem (TA CA s, ang. tum or-associated carbohydrate
antigens) analogiczne do tych obecnych w kom órkach czerniaka,
4. m o g ą w yw ierać funkcjonalny w pływ n a kom órki o mniej inw azyjnym potencjale.
C elem poniższej pracy doktorskiej b y ła p ro te o m ic z n a i g lik o m icz n a a n a liz a c a rg o b iałk o w eg o ek to so m ó w u w a ln ia n y c h w w a ru n k a c h in vitro p rz e z p ięć lin ii k o m ó rk o w y c h lu d zk ieg o c z e rn ia k a sk ó ry i gałk i ocznej re p re z e n tu ją c y c h ró ż n e s ta d ia ch o ro b y . Podjęte zadania badaw cze obejm ow ały:
1. izolację ektosom ów z kondycjonow anych pożyw ek z hodow li in vitro czterech linii kom órkow ych czerniaka skóry (w yprow adzonych ze zm ian pierw otnych: W M 115 i W M 793, oraz m etastatycznych:
W M 266-4 i W M 1205L u) oraz jednej linii czerniaka gałki ocznej (M el202) m eto dą w irow ania różnicow ego,
2 . ocenę czystości uzyskanych populacji ektosom ów z w ykorzystaniem transm isyjnej m ikroskopii elektronow ej (TEM , ang. Transm ission Electron M icroscopy), analizatora ruchu nanocząstek (NTA, ang. N anoparticle Tracking A nalysis) oraz W estern Blot,
3. identyfikację cargo białkow ego ektosom ów m etodą chrom atografii cieczowej sprzężonej z tandem ow ą spektrom etrią m as (LC -M S/M S, ang. liquid chrom atography coupled w ith tandem m ass spectrom etry) oraz bioinform atyczną analizę w yników ,
4. porów naw czą analizę profilu glikozylacji ekstraktów kom órkow ych, białek błonow ych i ektosom ów techniką lektynoblottingu,
5. porów naw czą analizę pow ierzchniow ej glikozylacji kom órek czerniaka i uw alnianych przez nie ektosom ów z w ykorzystaniem cytom etrii przepływ ow ej,
6 . ocenę funkcjonalnego w pływ u ektosom ów uw alnianych przez kom órki czerniaka n a proliferację i m igrację m niej inw azyjnych kom órek w w arunkach in vitro.