T: Analiza niskorozdzielczych widm mas związków metaloorganicznych metodami chemometrycznymi

POLITECHNIKA POZNAŃSKA

WYDZIAŁTECHNOLOGIICHEMICZNEJ

ROZPRAWA DOKTORSKA

T: Analiza niskorozdzielczych widm mas związków metaloorganicznych metodami chemometrycznymi

mgr inż. Ernest Pujszo

P r o mo tor : d r h ab . J ac ek A. S z ymu r a , pr of . n ad z w. UTP

Poznań 2015

Panu dr. hab. Jackowi A. Szymurze, prof. UTP dziękuję za opiekę oraz cenne uwagi i sugestie udzielane podczas wykonywania tej pracy, a także za życzliwość, co umożliwiło przygotowanie jej w miłej atmosferze

Panu dr. inż. Janowi Lamkiewiczowi dziękuję za wsparcie merytoryczne oraz owocne dyskusje problemów napotkanych podczas realizacji niniejszej pracy

Panu Profesorowi Kurtowi Varmuzie

z Technicznego Uniwersytetu Wiedeńskiego dziękuję za owocne dyskusje problemów współczesnej chemometrii a także za udostępnienie autorskiego programu MassFeatGen

Mojej Małżonce Marcie oraz Rodzicom dziękuję za wyrozumiałość i wsparcie okazane mi podczas realizacji niniejszej pracy

Spis treści

Wykaz skrótów i akronimów użytych w pracy ... 6

1. Wstęp ... 8

2. Cel i zakres pracy ... 12

3. Charakterystyka widm mas EI ... 14

3.1. Procesy fragmentacyjne wpływające na wygląd widma mas ... 16

3.2. Rodzaje widm mas ze względu na rozdzielczość ... 17

3.3. Biblioteki widm mas ... 19

3.3.1.Wiley Registry of mass spectral data ... 21

3.3.2.NIST/EPA/NIH mass spectral library ... 23

3.3.3.Połączone wydania bibliotek widm mas Wiley i NIST/EPA/NIH ... 24

3.3.4.Inne biblioteki widm mas... 25

3.4. Interpretacja widm mas związków organicznych ... 26

3.4.1.Przeszukiwanie bibliotek widm ... 26

3.4.2.Standardowa procedura interpretacji widm mas ... 29

3.4.3.Klasyfikatory widm związków organicznych ... 31

3.5. Interpretacja widm związków metaloorganicznych ... 32

3.5.1.Dekonwolucja interferencji izobarycznych w widmach mas ... 33

3.5.2.Eliminacja interferencji jonów M-nH w pasmach niskorozdzielczych widm mas... ... 35

4. Pochodne organiczne wybranych metali multiizotopowych – ich aktywność biologiczna i zastosowanie ... 36

4.1. Pochodne organiczne cyny ... 36

4.2. Pochodne organiczne żelaza ... 38

4.3. Pochodne organiczne niklu ... 39

5. Metody chemometryczne zastosowane w niniejszej pracy do analizy widm mas... 41

5.1. Analiza składu pasm (BCA) ... 41

5.1.1.Teoretyczne podstawy procedury BCA ... 41

5.1.2.Przykładowe obliczenia realizowane przez algorytm BCA w procesie dekonwolucji widma związku metaloorganicznego ... 45

5.2. MassFeatGen ... 48

5.3. Analiza głównych składowych (PCA) ... 51

5.4. Analiza wiązkowa (CA) ... 63

6. Analiza widm mas EI związków metaloorganicznych połączonymi metodami chemometrycznymi ... 65

6.1. Widma pochodnych organicznych cyny szeregu (CH3)3SnR ... 65

6.1.1.Wyniki analizy widm (CH3)3SnR za pomocą MassFeatGen – PCA i ich dyskusja . ... 67

6.1.2.Wyniki analizy widm (CH3)3SnR za pomocą BCA – PCA – CA i ich dyskusja . 72 6.2. Wyniki analizy widm pochodnych organicznych żelaza za pomocą MassFeatGen – PCA i ich dyskusja ... 74

6.3. Widma pochodnych organicznych niklu analizowane za pomocą BCA – PCA – CA ... 78

6.3.1.Wyniki analizy widm i ich dyskusja dla związków, w których podstruktura cyklopentadienu jest połączona z atomem niklu wiązaniem koordynacyjnym .... 78

6.3.2.Wyniki analizy widm i ich dyskusja dla związków niklu z grupą fosfinową ... 89

7. Wnioski ... 98

8. Literatura ... 100

9. Spis tabel ... 113

10.Spis rysunków ... 115

11.Streszczenie ... 118

12. Summary ... 120

6

Wykaz skrótów i akronimów użytych w pracy

API – American Petroleum Institute, Amerykański Instytut Naftowy BCA – band composition analysis, analiza składu pasm

CA – cluster analysis, analiza wiązkowa

CAS – Chemical Abstracts Service, baza danych związków chemicznych

CEC – Consolidated Electrodynamics Corporation, Skonsolidowana Korporacja Elektrodynamiczna

CI – chemical ionization, jonizacja chemiczna EI – electron ionization, jonizacja elektronami

EIMS – electron ionization mass spectrometry, spektrometria mas z jonizacją elektronami

EPA – Environmental Protection Agency, Agencji Ochrony Środowiska GC – gas chromatography, chromatografia gazowa

GC–MS – gas chromatography mass spectrometry, spektrometria mas sprzężona z chromatografią gazową

HL – hit list, lista trafień

HRMS – high resolution mass spectrometry, wysokorozdzielcza spektrometria mas IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry, Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej

JCAMP – Joint Committee on Atomic and Molecular Physical Data, Połączony Komitet do Fizycznych Danych Atomowych i Cząsteczkowych

kFN – k–farthest neighbour, metoda k–najdalszego sąsiada kNN – k–nearest neighbour, metoda k–najbliższego sąsiada LC – liquid chromatography, chromatografia cieczowa LLM – linear learning machine, liniowa maszyna ucząca się

LRMS – low resolution mass spectrometry, niskorozdzielcza spektrometria mas MMAO – modified methylaluminoxane, zmodyfikowany aluminoksan metylowy MS – mass spectrometry, spektrometria mas

MSDC – Mass Spectrometry Data Center, centrym danych spektrometrii mas NBS – National Bureau of Standards, Narodowe Biuro Standaryzacji

NIH – National Institute of Health, Narodowy Instytut Zdrowia

NIST – National Institute of Standards and Technology, Narodowy Instytut Standaryzacji i Technologii

7 PC – principal component, główna składowa

PCA – principal component analysis, analiza głównych składowych PCBs – polychlorinated biphenyls, polichlorowane bifenyle

SIP – standard interpretation procedure, standardowa procedura interpretacji widm mas SISCOM – search for identical and similar compounds, system do wyszukiwania identycznych i podobnych zwiazków chemicznych na podstawie widm mas

STIRS – self–training interpretive and retrieval system, samouczący się system wyszukiwania i interpretacji widm mas

8

1. Wstęp

Współczesna spektrometria mas MS (ang. mass spectrometry) jest metodą analityczną, której początek datuje się na rok 1911, w którym Thomson skonstruował pierwszy spektrometr, czyli urządzenie służące do pomiaru ilorazu masy i ładunku elektrycznego jonów. Z uwagi na bardzo wysoką czułość przyrządu (na poziomie 10^-15 g) MS jest powszechnie wykorzystywana do wykrywania obecności ekstremalnie małych ilości związków chemicznych. Wśród jej wyjątkowo licznych zastosowań, oprócz typowych, do których od szeregu lat należą badania związków chemicznych (oraz mieszanin) w celu ich identyfikacji, względnie ustalenia struktury, składu pierwiastkowego lub izotopowego, można również wymienić:

 proteomikę, w której służy do wyjaśnienia struktury białek [1,2],

 badania antydopingowe [3–6],

 kontrolę jakości żywności [7–9],

 badania w dziedzinie toksykologii i ochrony środowiska [10,11].

Na uwagę zasługuje ponadto kilka bardzo spektakularnych i szczegółowych przykładów użycia spektrometrii mas do:

 wyjaśniania struktur metabolitów (metabolika) na podstawie zawartych w nich podstruktur [12],

 ilościowego i jakościowego określenia zawartości lotnych związków w proszkach stosowanych w starożytnych Chinach do leczenia wrzodów żołądka [13],

 określenia składu olejków eterycznych w produktach naturalnych [14–16],

 szybkiego i taniego rozróżniania gatunków win [17–19] oraz do kontroli autentyczności win [20], czy tequili [21],

 określenie wieku całunu turyńskiego [22],

 badań kosmosu, w tym do analizy składu komet [23–26].

Kwestie związane z identyfikacją związków chemicznych oraz wyjaśnienie ich struktury odgrywają istotną rolę w nowoczesnej chemii analitycznej i stanowią wciąż fascynujący temat badawczy, zarówno dla niewielkich cząsteczek [27], jak i dużych skomplikowanych struktur chemicznych (np. w proteomice) [28]. Pionierskie prace z tego zakresu, do których wykorzystano widma spektrometrii mas, były prowadzone

9

już na początku drugiej połowy XX wieku [29], kiedy to Beynon [30,31], Stenhagen i Ryhage [32–35] oraz McLafferty [36–38] badali charakterystyczne reakcje fragmentacji wybranych grup związków chemicznych. Ogólne prawa fragmentacji jonów, które wówczas sformułowano, pozwoliły na wyjaśnienie struktury prostych substancji nieznanych, będących głównie produktami naturalnymi [39]. Jednak przełomowym momentem było zredagowanie w 1963 roku przez McLafferty'ego [40]

pracy zbiorowej powstałej przy współudziale wielu ówczesnych spektrometrystów. Po raz pierwszy opisano w niej ogólne reguły rozpadu wybranych klas związków organicznych. Jej kolejne wydanie pod zmienionym tytułem [41] jest wciąż bardzo pomocne przy ręcznej procedurze wyjaśniania struktury związków chemicznych głównie organicznych, w oparciu o zarejestrowane dla nich widma MS.

Obserwowany trend powiększania pamięci komputerów oraz związana z tym możliwość zapisu i gromadzenia coraz większej ilości danych, spowodowały wyraźny wzrost wykorzystania cyfrowych bibliotek, w których zapisano nawet kilkaset tysięcy referencyjnych widm mas. Większość z tych kolekcji zawiera widma niskiej rozdzielczości LR (ang. low resolution) wykonane techniką jonizacji strumieniem elektronów EI (ang. electron ionization). Służą one jako wzorce, z którymi porównuje się widma mas substancji nieznanych celem ich identyfikacji. Stanowią one ponadto cenne zbiory danych dla wielu metod chemometrycznych umożliwiających ustalenie budowy związku chemicznego w oparciu o rozpoznane w nim fragmenty struktury, tj.

podstruktury, które nie zawsze oznaczają grupy funkcyjne. Metody te są szczególnie pomocne wówczas, gdy widmo badanego związku nie występuje w dostępnych bibliotekach danych.

Generalnie, do identyfikacji podstruktur w badanych widmach mas nieznanych związków chemicznych wykorzystuje się cztery poniższe podejścia [42].

 Metody bazujące na wiedzy spektroskopowej, która pozwala na tworzenie modeli matematycznych opisujących zależności w układzie widma mas – struktury odpowiadających im związków chemicznych, a następnie implementację uzyskanych korelacji w programach komputerowych do interpretacji widm MS.

 Techniki przeszukiwania dostępnych bibliotek widm, które umożliwiają ustalenie podstruktur obecnych w badanym związku chemicznym, nawet gdy jego widmo nie zostało wcześniej zarejestrowane w tych bibliotekach.

10

 Tabele korelacyjne zawierające dane widmowe z odpowiadającymi im podstrukturami.

 Klasyfikatory widm mas, czyli algorytmy matematyczne wykorzystujące metody statystyki multiwariacyjnej do odnajdywania korelacji widmo mas – struktura związku chemicznego.

Pomimo dostarczania przez MS wielu cennych informacji ułatwiających ustalanie struktur nieznanych związków chemicznych, wciąż otwarte pozostają kwestie dotyczące wyjaśniania skomplikowanych zależności pomiędzy strukturą związku, a jego widmem oraz problemy podobieństwa widm, zwłaszcza w odniesieniu do połączeń metaloorganicznych. Ich widma mas, w odróżnieniu od widm związków typowo organicznych (tj. zawierających w cząsteczkach atomy C, H, O, N, S) posiadają bardzo złożony charakter, spowodowany występowaniem większości metali w postaci dwóch lub więcej izotopów (multiizotopowość). Ten złożony charakter widm związków metaloorganicznych, spotęgowany efektami hydrogenacji/dehydrogenacji¹ jonów sprawia, że ich interpretacja jest wyjątkowo trudnym zagadnieniem badawczym.

W ostatnich kilkunastu latach do rozwiązania powyższych problemów zaczęto stosować różne metody chemometryczne, wspomagane komputerowo.

Chemometria jest dziedziną chemii, która wykorzystuje matematykę i statystykę do następujących zadań [43a]:

 stworzenia lub wyboru optymalnej procedury przeprowadzenia eksperymentu,

 uzyskania wiedzy o procesie chemicznym (np. pomocnej do ustalenia rzędowości reakcji chemicznej),

 dostarczenia maksymalnej ilości istotnej informacji chemicznej o analizowanym chemicznym zbiorze danych.

Realizacja ostatniego z nich doprowadziła do powstania przełomowej pracy na temat wykorzystania metod chemometrycznych do stworzenia klasyfikatorów widm mas, opublikowanej w 1996 roku przez Varmuzę i Werthera [44]. Autorzy ci po raz pierwszy zdefiniowali pojęcie klasyfikatora widm jako algorytmu matematycznego, który

1 Poprzez wymienione efekty uznaje się przyłączenie lub utratę przez jon, jednego lub więcej indywiduów wodorowych, takich jak: H⁺, H^-, H⁰, H^•.

11

wykorzystywał metody statystyki multiwariacyjnej do automatycznego rozpoznawania podstruktur w związku chemicznym. Danymi wejściowymi do tego klasyfikatora były wartości m/z oraz intensywności, a wynikiem obliczeń – numeryczna odpowiedź zawierająca informacje o obecności lub braku określonej podstruktury. Autorzy omawianej pracy świadomi, że ich wyniki objęły stosunkowo niewielki obszar głównie z zakresu chemii organicznej, wyrazili przekonanie o potrzebie rozwijania badań nad klasyfikatorami widm dla innych grup związków chemicznych. Konieczność uzupełniania bibliotek widm mas o widma kolejnych związków oraz ciągłego rozwoju klasyfikatorów pozostaje wciąż aktualna, o czym wspominają w niedawno opublikowanej pracy Schymansky i współprac. [45].

W świetle powyższych opinii oraz z uwagi na zapotrzebowanie na nowe procedury do analizy bardzo złożonych widm związków metaloorganicznych, a także rosnące znaczenie tych związków w gospodarce człowieka, tematyka niniejszej pracy dobrze wpisuje się w trendy współczesnej spektrometrii mas.

12

2. Cel i zakres pracy

Przeważającą część dotychczasowych automatycznych oraz manualnych metod analizy widm mas, łącznie z tą zaproponowaną przez Varmuzę i Werthera [44], opracowano oryginalnie do badań widm związków typowo organicznych. Widma te cechuje stosunkowo prosty charakter (obraz), wskutek obecności pierwiastków takich jak: C, H, O, N, S, posiadających 2 naturalne izotopy (o istotnych udziałach procentowych), z których jeden stanowi formę dominującą. Metody ich analizy nie sprawdzają się w przypadku widm pochodnych metaloorganicznych. Ich złożony obraz, będący efektem występowania licznych sygnałów od multiizotopowych metali, dodatkowo komplikują interferencje od produktów różnych reakcji następczych (głównie hydrogenacji i dehydrogenacji), zachodzących w komorze jonizacyjnej spektrometru.

W konsekwencji, w widmie pojawiają się trudne do analizy pasma złożone, będące wynikiem nakładania się sygnałów pasm prostych od dwóch lub więcej jonów.

Powyższe trudności, brak ogólnych reguł fragmentacji związków metaloorganicznych oraz ich wciąż stosunkowo skromna reprezentacja w popularnych bazach danych widm MS stanowią główne przeszkody na drodze do opracowania efektywnych metod analizy tych widm. W szczególności problem ten dotyczy badań licznych serii widm mających za zadanie poszukiwanie korelacji w układzie widmo – struktura, względnie trendów fragmentacyjnych związków metaloorganicznych.

Przedstawione fakty skłoniły autora pracy do podjęcia studiów, których zasadniczym celem było znalezienie odpowiedzi na pytanie, czy użycie odpowiedniej kombinacji już istniejących metod chemometrycznych do analizy serii widm mas organicznych pochodnych metali pozwala na rozróżnienie wśród nich grup o tych samych podstrukturach i tym samym dokonanie klasyfikacji. Powyższe zadanie zrealizowano przy wykorzystaniu ustalonych cech widmowych obliczonych dla całego widma (za pomocą MassFeatGen) albo dla jednego pasma (za pomocą BCA), w którym spodziewano się występowania obecności sygnałów jonu metalu kończącego zwykle główną ścieżkę fragmentacji pochodnej metaloorganicznej.

Do realizacji wytyczonego celu posłużyły następujące metody chemometryczne (opisane w rozdziale 5): BCA – analiza składu pasm widmowych, MassFeatGen –

13

program do wyznaczania cech spektralnych z widma mas, PCA – analiza głównych składowych, CA – analiza wiązkowa.

Przyjęty w pracy plan badań przewidywał chronologiczne wykonanie następujących zadań. Na początku zajęto się analizą serii widm reprezentujących pochodne trimetylocyny za pomocą połączonych metod MassFeatGen – PCA. Następnie chemometryczną analizę tych samych widm powtórzono połączonymi metodami BCA – PCA – CA. Do kolejnego etapu skierowano zestaw widm pochodnych organicznych żelaza. Mając na uwadze podobieństwo profilu izotopowego tego metalu do profilu węgla (obecność jednego z izotopów o dominującym udziale), widma te poddano analizie za pomocą metod MassFeatGen – PCA stosowanych dotychczas wyłącznie do związków typowo organicznych, zmieniając wartości liczbowe w parametrach cech spektralnych zdefiniowanych w MassFeatGen. W ostatnim etapie przeanalizowano dwie oddzielne serie widm organicznych pochodnych niklu, stosując kombinację metod BCA – PCA – CA.

Materiał badawczy do niniejszej pracy stanowiły referencyjne widma mas EI pochodnych cyny, żelaza i niklu skatalogowane w prestiżowych bibliotekach NIST02 [46] oraz NIST08 [47]. Zawarte w nich widma, zgodnie z założeniami przyjętymi przez Steina – głównego administratora bazy (podrozdział 3.3.2.), cechuje wysoka jakość, będąca konsekwencją ich starannego doboru oraz stałej weryfikacji, prowadzonej przed publikacją każdej następnej edycji tej bazy. Wszystkie serie widm skierowanych do badań zawierały związki o pewnych podobieństwach strukturalnych tak, aby istniała możliwość ich klasyfikacji.

Wybierając do analizy chemometrycznej widma mas związków organicznych trzech metali kierowano się przede wszystkim zróżnicowaniem ich profili izotopowych, tj.: Sn – najbogatszy profil (10 trwałych izotopów), Fe – ubogi profil (4 trwałe izotopy) przypominający węgiel, Ni – średnio liczny profil (5 trwałych izotopów). Wzięto również pod uwagę wysoką aktywność biologiczną ich związków, duże znaczenie w gospodarce człowieka, ale także możliwości, które stwarza ich analityka środowiskowa realizowana za pomocą nowoczesnej techniki instrumentalnej jaką jest spektrometria mas.

14

3. Charakterystyka widm mas EI

Aby zarejestrować widmo MS nieznanej substancji należy ją wprowadzić do komory jonizacyjnej spektrometru mas, najlepiej bez domieszek (zanieczyszczeń), które mogłyby spowodować pojawienie się dodatkowych sygnałów w widmie i tym samym utrudnić jego interpretację. W tym celu, przed wykonaniem widma próbki stanowiącej mieszaninę związków, bardzo często dokonuje się jej wstępnego rozdziału [48a] za pomocą chromatografii gazowej GC (ang. gas chromatography) lub cieczowej LC (ang.

liquid chromatography). Podstawową zaletą obu metod jest separacja składników badanej próbki na wyjściu z chromatografu i stopniowe dostarczanie ich do komory jonizacyjnej spektrometru. Korzyścią zastosowania sprzężenia GC–MS jest ponadto dodatkowy parametr, tzw. indeks retencji, będący jedną z wielkości charakterystycznych danej substancji, która ułatwia wyjaśnienie jej struktury [49,50].

W ostatnim wydaniu biblioteki widm mas NIST14 [51] z roku 2014 jego wartość podano dla ponad 80 tys. związków chemicznych.

Widma mas służą do analizy jakościowej i ilościowej substancji chemicznych obecnych w badanych próbkach. Zazwyczaj zapisuje się je w postaci tabelarycznej (tabela 1) lub wykresu (rysunek 1).

Tabela 1. Przykładowe widmo mas 2,2–dimetylobutanu przedstawione w postaci tabelarycznej.

W tabeli pominięto sygnały m/z, dla których wartość intensywności względnej wynosi zero

m/z intensywność

względna [%] m/z intensywność

względna [%] m/z intensywność względna [%]

1 0,5 38 1,3 61 0,1

2 0,2 39 24,92 62 0,1

12 0,1 40 3,3 63 0,1

13 0,1 41 61,26 64 0,1

14 0,9 42 5,21 65 0,2

15 11,51 43 100 66 0,1

16 0,6 44 3,5 67 0,4

25 0,1 45 0,1 68 0,1

26 2,7 49 0,1 69 0,8

27 36,34 50 0,7 70 3,3

28 5,61 51 1,6 71 73,37

29 50,85 52 0,5 72 4

15

Tabela 1. cd.

30 1,1 53 3,9 73 0,1

31 0,1 54 0,8 77 0,1

32 0,1 55 14,71 79 0,1

33 0,1 56 29,43 85 0,2

34 0,1 57 98,2 86 0,1

36 0,1 58 4,2

37 0,6 59 0,1

Na wykresie na osi rzędnych odkłada się rozkład intensywności względnej jonów, a na osi odciętych stosunek ich masy do ładunku m/z [52a]. Sygnał m/z o najwyższej intensywności w widmie mas nosi nazwę sygnału podstawowego (głównego) i przypisuje mu się wartość 1 (100%). Intensywność względną wyraża się w procentach [53a] i definiuje jako iloraz intensywności sygnałów rozpatrywanego i podstawowego.

Z kolei sygnał o największej wartości m/z należy do kationorodnika jonu molekularnego badanego związku.

Z uwagi na fakt, że większość pierwiastków występujących w przyrodzie posiada więcej niż jeden trwały izotop, w widmie mas ich związków, zamiast pojedynczych sygnałów m/z, obserwuje się tzw. pasma, czyli zwarte zespoły (klastery) sygnałów odróżniające się od pozostałych. Wysokie wartości intensywności względnej sygnałów pasm wyraźnie odcinają się od często występujących sygnałów tła, o bardzo małych intensywnościach (np. seria sygnałów w tabeli 1 widocznych w regionie 59-68 m/z).

16

Rysunek 1. Przykładowe widmo mas związku organicznego, 2,2–dimetylobutanu przedstawione w formie wykresu, gdzie: A – region pasm jego jonów fragmentacyjnych, B – region pasma jego jonu molekularnego [47].

3.1. Procesy fragmentacyjne wpływające na wygląd widma mas

W komorze jonizacyjnej wytwarzane są jony badanej próbki wskutek bombardowania jej cząsteczek strumieniem elektronów, zgodnie z reakcją [48b]:

M + e → M^+• + 2e gdzie:

M – cząsteczka wprowadzonej próbki, M^+• – jon molekularny,

e – elektron.

Cząsteczki większości związków chemicznych mają energię jonizacji rzędu 10 ± 3 eV [41a]. W technice EI elektrony dysponują znacznym nadmiarem energii (tj. 70 eV), wskutek czego zwykle po jonizacji następuje rozpad wytworzonego jonu molekularnego na jony fragmentacyjne. Ten pierwszy jon może się rozpaść na dwa sposoby, tworząc [48c]:

 jon parzystoelektronowy EE⁺ (ang. even electron) i rodnik R^•,

 jon nieparzystoelektronowy OE^+• (ang. odd electron) i cząsteczkę obojętną N.

Zarówno EE⁺ jak i OE^+• mogą ulegać dalszym procesom fragmentacji, wskutek czego w widmie mas pojawia się liczna grupa sygnałów pochodzących od jonów

m/z

intensywność względna [%]

0 20

20

40 40

60 60

80 80

100 100

A Sygnał podstawowy

0

C CH2

H C3 C CH3

CH3

CH3

B

5

17

fragmentacyjnych. Warto zauważyć, że bardzo często możliwy jest równoległy (konkurencyjny) przebieg rozpadu jonu, co wprowadza dodatkowe utrudnienie w procesie interpretacji widma. Przykładowo, jon molekularny ketonu etylowo–1–

propylowego może równolegle odszczepić dwa rodniki: etylowy i propylowy [54].

W konsekwencji w jego widmie występują dwa rodzaje jonów fragmentacyjnych pochodzących od jonu molekularnego, a każdy z nich daje początek nowej ścieżce fragmentacji (rysunek 2).

Rysunek 2. Równoległy rozpad jonu molekularnego ketonu etylowo–1–propylowego, zachodzący z odszczepieniem rodnika etylowego oraz propylowego [54].

3.2. Rodzaje widm mas ze względu na rozdzielczość

Widma mas ze względu na ich rozdzielczość (W1) można podzielić na niskorozdzielcze LR (ang. low resolution) oraz wysokorozdzielcze HR (ang. high resolution). Te pierwsze rejestrowane są od momentu skonstruowania przez Thomsona spektrometru mas i zwyczajowo przyjmuje się, że zapisane są z dokładnością do jednostkowej wartości m/z. Z kolei początek rejestracji widm HRMS datuje się na lata 70-te XX wieku, kiedy zaczęto budować pierwsze spektrometry wyposażone w dwa następujące po sobie analizatory: elektryczny oraz magnetyczny. Taka konstrukcja przyrządu doprowadziła do uzyskania rozdzielczości od 10000 do 20000, jednak osiągnięcie wspomnianego zakresu wymagało dodatkowo zastosowania optymalnych warunków wykonania widma, takich jak wysoka czystość źródła jonów oraz możliwie jak najniższa wartość ciśnienia w komorze jonizacyjnej spektrometru [55]. Za pomocą HRMS rejestruje się ułamkowe wartości m/z, a rozdzielczość takich widm jest wg Komisji Europejskiej większa od 10 000 [56], przy 10% dolinie pomiędzy pikami sąsiadujących jonów (rysunek 3). Generalnie przyjęło się, że rozdzielczość spektrometru mas, to zdolność jego analizatora do wyodrębnienia jonów o różnych wartościach m/z [57], którą definiuje się następująco [53b]:

C

+

+

+

C H_{2 5}

-C H_{2 5} C H_{3 7}

O

-C H_{3 7} C H_{2 5} C O

C C H_{3 7} O

18 R M

 M

 W1

gdzie:

M – jednostkowa masa cząsteczkowa lub atomowa rozdzielanych jonów,

∆M – różnica dokładanych mas cząsteczkowych lub atomowych rozdzielanych jonów.

Rysunek 3. Schemat obrazujący pojęcie 10% doliny w widmie mas pomiędzy rozdzielanymi pikami dwóch sąsiednich jonów.

Problem przyporządkowania piku do odpowiedniego jonu można przykładowo przedyskutować dla trzech kationorodników, a mianowicie CO₂^+• (kationorodnik cząsteczki dwutlenku węgla), C3H₈^+• (kationorodnik cząsteczki propanu) oraz C2H₃OH^+•

(kationorodnik cząsteczki alkoholu winylowego). W widmie niskorozdzielczym każdy z nich będzie widoczny przy m/z=44. Aby możliwe było uzyskanie trzech pików, dla których intensywność doliny między nimi osiągnie 10%, należy wykorzystać spektrometr o rozdzielczości, której minimalną wartość można ustalić na podstawie poniższych obliczeń. W ich początkowym etapie oblicza się dokładne masy cząsteczkowe trzech ww. jonów:

CO2

M  12, 000000 (2 15,994915)  43,989830

3 8

MC H  3 12, 000000 (8 1, 007825)  44, 062600

2 3

C H OH

M   2 12, 000000 (4 1, 007825) 15,994915   44, 026215

m/z

intensywność względna [%]

20 40

10%

dolina 60

80 100

0

M+ MΔ ΔM

M

19

Po podstawieniu obliczonych mas do wzoru W1 otrzymuje się rozdzielczości wymagane do rozdzielenia trzech pików:

R dla pary CO2+•

i C3H8+•

= 44

44, 062600 43,989830605

 R dla pary C3H8+•

i C2H3OH^+• = 44

44, 062600 44, 0262151209

 R dla pary CO2+•

i C2H3OH^+•= 44

44, 026215 43,989830 1209



Powyższy przykład pokazuje, że przydatne byłoby wykonanie wszystkich widm spektrometrem o rozdzielczości R ≥ 1209. Zapis cyfrowy takich widm stanowił do początku XXI wieku znaczne obciążenie pamięci stosowanych wówczas komputerów (kilkadziesiąt wartości intensywności w obszarze jednostkowej wartości m/z) oraz bibliotek widm. Niekorzystne były ponadto [58,59]: duży koszt wysokorozdzielczych spektrometrów oraz trudniejszy do nich dostęp [59]. Ze względu na relatywnie niski koszt wykonywania badań oraz możliwość tworzenia obszernych bibliotek widm, najbardziej rozpowszechniona stała się niskorozdzielcza spektrometria mas z jonizacją elektronami EI.

3.3. Biblioteki widm mas

Cechą charakterystyczną niskorozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronami jest stosunkowo dobra powtarzalność uzyskiwanych widm. Oznacza to, że przy zdefiniowanych warunkach (takie same wartości: energii jonizacji, temperatury, ciśnienia oraz brak zanieczyszczeń) panujących w komorze jonizacyjnej spektrometru otrzymuje się bardzo podobne widma tej samej substancji, niezależnie od miejsca i instrumentu, na którym zostały wykonane.

Powtarzalność widm EIMS sprzyja ich kolekcjonowaniu w komputerowych bazach danych (biblioteki widm mas). Dla ich efektywnego wykorzystania stworzono liczne programy komputerowe umożliwiające wykonanie szeregu poniższych operacji ułatwiających procedury interpretacji widm.

20

 Import widma mas badanego związku do biblioteki (np. celem jego porównania z widmami referencyjnymi).

 Eksport widm (w postaci danych numerycznych jak i struktur) z biblioteki.

 Wyszukiwanie widma mas wg licznych kryteriów, np.: wzoru sumarycznego, masy cząsteczkowej, występowania sygnału przy określonej wartości lub zdefiniowanym zakresie m/z, nazwy cząsteczki, obecności danego pierwiastka w cząsteczce, komentarza do danego widma, numeru CAS (ang. Chemical Abstracts Service) – unikatowy numer substancji, nie posiadający znaczenia chemicznego, lub numeru NIST – unikatowy numer widma mas w bibliotece NIST.

 Analiza wybranego widma mas. Przykładowo, jedną z opcji programu MS Interpreter [60] wchodzącego w skład biblioteki NIST08 jest wyświetlanie na ekranie komputera wszystkich możliwych jonów fragmentacyjnych, po najechaniu kursorem myszy na sygnał w badanym widmie mas i podświetlenie na kolorowo w strukturze cząsteczki fragmentów, które mogą odpaść dla zadanej wartości m/z.

Należy zauważyć, że w przypadku przeszukiwania biblioteki, wysokie wartości współczynników dopasowania Match lub Match Factor na liście trafień HL (ang. hit list) nie zawsze oznaczają odnalezienia prawidłowego związku chemicznego. Mogą one być błędne z kilku powodów, a przede wszystkim z uwagi na brak widma danego związku w bibliotece [61] lub podobieństwo strukturalne pomiędzy związkiem nieznanym i zarejestrowanym w bibliotece.

Od kilku dziesięcioleci istnieją dwa główne światowe zbiory (kolekcje) referencyjnych widm mas będące w powszechnym użyciu spektrometrystów [62a]. Powstały one i rozwijają się w USA, chociaż widma do swoich kolekcji czerpią również z licznych źródeł zlokalizowanych głównie w Europie i Japonii. Zbiór większy, wydawany jako Wiley Registry of mass spectral data, jest zarządzany przez McLafferty'ego, a mniejszym z nich administrowanym przez Narodowy Instytut Standaryzacji i Technologii NIST (ang. National Institute of Standards and Technology) zarządza Stein.

21 3.3.1. Wiley Registry of mass spectral data

Pierwszą bazę niskorozdzielczych widm mas EI utworzono w roku 1956 z kolekcji widm zebranych przez Amerykański Instytut Naftowy API (ang. American Petroleum Institute) oraz Skonsolidowaną Korporacją Elektrodynamiczną CEC (ang. Consolidated Electrodynamics Corporation). Zawierała ona łącznie 1500 widm w większości węglowodorów. Oprócz samych widma mas, już w pierwszych papierowych wydaniach tego katalogu można było znaleźć także struktury odpowiadających im związków oraz ich numery CAS. Od początku istnienia biblioteki Wiley, spektrometryści zdawali sobie sprawę, że dla jednoznacznego wyjaśnienia struktury badanego związku jego widmo powinno być zarejestrowane na tym samym przyrządzie i przy zachowaniu analogicznych warunków, jak w przypadku widma referencyjnego. Użycie innego sprzętu i warunków mogłoby spowodować pojawienie się błędów oraz różnic w liczbie sygnałów m/z.

Dlatego też, jak wspominają w swojej pracy McLafferty i współprac. [63], już w latach 60–tych oraz na początku 70–tych XX wieku, nad jakością widm w każdym kolejnym wydaniu biblioteki Wiley pracował zespół naukowców, do którego należeli m. in.

Stenhagen, McLafferty oraz Tatematsu. W cytowanej pracy znajduje się także informacja, że w tym samym czasie Proskauer przekonał autorów bazy Wiley do opracowywania widm wysokiej jakości, co spowodowało, iż każde rejestrowane przez nich widmo było sprawdzane przez dwóch niezależnych ekspertów. W ten sposób zweryfikowano jedynie 1100 widm, po czym w roku 1972, ze względu na bardzo wysoki koszt operacji, zaprzestano tej strategii pracy. W roku 1974 opublikowano bibliotekę zawierającą 19000 widm, bez kosztowej procedury ich weryfikacji. Do oceny jakości widm biblioteki Wiley zaczęto wykorzystywać tzw. indeks jakości (ang. quality index), którego wartość była w latach 70-tych XX wieku obliczana na podstawie siedmiu parametrów takich jak [64]:

 źródło pochodzenia widma,

 warunki jonizacji,

 obecność zanieczyszczeń o wyższej masie niż jon molekularny związku,

 niemożliwe z punktu widzenia chemicznego (np. niekorzystne energetycznie) utraty cząsteczek obojętnych w procesie fragmentacji,

22

 zgodność intensywności izotopów z ich naturalnym rozpowszechnieniem w przyrodzie,

 liczba sygnałów w widmie,

 najniższa wartość m/z zarejestrowana w widmie.

Obecnie indeks ten bierze pod uwagę również kilka dodatkowych parametrów takich jak [63]:

 czystość próbki,

 kalibracja spektrometru,

 ustawienie wzmacniacza, odpowiedzialnego za przekazanie danych z detektora jonów do komputera.

Należy zaznaczyć, że szereg błędów w widmach, uwzględnionych w wartościach indeksu jakości i wynikających z wadliwej kalibracji spektrometru mas, czy też nieprawidłowego zapisu danych, można obecnie wyeliminować. Wykonuje się to poprzez automatyczne wyszukanie wszystkich widm obecnych w bibliotece Wiley o tym samym numerze CAS i jednoczesne ich wyświetlenie na ekranie monitora.

Wizualne porównanie danych widmowych umożliwia identyfikację nieprawidłowości w zakresie nazwy lub struktury związku a następnie ich korektę. W tabeli 2 zebrano chronologicznie wszystkie dotychczasowe wydania biblioteki Wiley, wraz z liczbą zawartych w niej widm oraz związków.

Tabela 2. Kolejne wydania biblioteki Wiley Rok

wydania Nazwa biblioteki Liczba

widm

Liczba związków

1956 Brak danych 1500 brak danych

1969 Atlas of Mass Spectra, 1st edition 6800 brak danych

1974 Registry of mass spectral data, 2nd edition 19000 brak danych 1978 Registry of mass spectral data, 3rd edition 41000 brak danych 1982 Registry of mass spectral data, 4th edition 73000 62000 1989 Registry of mass spectral data, 5th edition 140000 107000 1994 [62b] Wiley Registry of mass spectral data, 6th edition 229119 200500 2000 Wiley Registry of mass spectral data, 7th edition 338000 289000 2006 [65] Wiley Registry of mass spectral data, 8th edition 399383 310000

23

Tabela 2. cd.

2009 [61] Wiley Registry of mass spectral data, 9th edition 662780 590000 2012 Wiley Registry of mass spectral data, 10th edition 719000 638000

3.3.2. NIST/EPA/NIH mass spectral library

Zespół naukowców odpowiedzialnych za bibliotekę NIST postawił sobie za cel osiągnięcie wysokiej jakości gromadzonych w niej widm. Każde z nich musiało posiadać numer CAS. Najlepsze jakościowo widmo danego związku chemicznego zamieszczone w tej bazie wybrano komputerowo spośród licznego zbioru jego dostępnych widm, na podstawie wysokiej wartości indeksu jakości wspomnianego w podrozdziale 3.3.1. W przypadku pojedynczych widm związków o danych numerach CAS, pojawiały się one w bibliotece NIST niezależnie od wartości tego indeksu [66].

Jednak jego niska wartość była cenną informacją dla użytkowników bazy NIST o tym, że jakość widma może być niewystarczająca. Należy odnotować fakt, iż przed rokiem 1992 kolejne edycje bazy NIST zawierały wyłącznie pojedyncze widma dla każdego związku. Dopiero w wydaniu z roku 1992 pojawiły się ich repliki [63].

Najnowsze wydanie biblioteki cyfrowej NIST14 z roku 2014 [51] zawiera widma zaczerpnięte głównie ze źródeł instytucji amerykańskich, takich jak:

 Narodowe Biuro Standaryzacji NBS (ang. National Bureau of Standards) – istniejące od roku 1901, przekształcone w roku 1988 w NIST,

 Agencja Ochrony Środowiska EPA (ang. Environmental Protection Agency),

 Narodowy Instytut Zdrowia NIH (ang. National Institute of Health).

Pierwsze wydania omawianej biblioteki zawierały widma, z których każde posiadało wyłącznie 8 sygnałów o największej intensywności względnej. Wprawdzie oszczędzało to pamięć komputera, lecz znacznie ograniczało przydatność takich widm w nowoczesnej analityce środowiska [62c]. Od chwili powstania, bibliotekę NIST wydawano pod różnymi nazwami. Począwszy od roku 1998 rozpoczęto używanie formatu nazwy NISTYY, w której dwie ostatnie litery oznaczają końcówkę roku dystrybucji. Przykładowo, NIST98 została wydana w roku 1998, a NIST02 – w roku 2002. Pomimo, że już przed rokiem 1998 istniała konwencja nazewnictwa opracowana

24

przez NBS, zawierająca ciąg znaków NBSZZZK (gdzie ZZZ oznaczało liczbę widm, a K było skrótem od tysięcy) [67a], to jednak nie była ona konsekwentnie stosowana.

W tabeli 3 zebrano dotychczasowe wydania biblioteki NIST, wraz z liczbą widm oraz związków.

Tabela 3. Kolejne wydania biblioteki NIST Rok

wydania

Nazwa biblioteki

Liczba widm

Liczba związków 1978 [67a] EPA/NIH Mass Spectral Database 25556 brak danych 1980 [67a] EPA/NIH Mass Spectral Database (supplement 1) 8807* brak danych 1988 [68] NBS/EPA/MSDC Mass Spectral Database 44000 brak danych

1992 NIST/EPA/NIH Mass Spectral Database 74828 62000

1998 [66] The NIST98 Mass Spectral Library & Search Software (NIST 1998/EPA/NIH)

129136 107886

2002 The NIST02 Mass Spectral Library & Search Software (NIST 2002/EPA/NIH)

174948 147198

2005 The NIST05 Mass Spectral Library & Search Software (NIST 2005/EPA/NIH)

190825 163198

2008 The NIST08 Mass Spectral Library & Search Software (NIST 2008/EPA/NIH)

220460 192108

2011 The NIST11 Mass Spectral Library & Search Software (NIST 2011/EPA/NIH)

243893 212961

2014 NIST14 Mass Spectral and Retention Index Libraries 276248 242466

* w 1980 roku wydano wyłącznie suplement do edycji biblioteki z roku 1978 uzyskując sumarycznie liczbę 34363 widm.

3.3.3. Połączone wydania bibliotek widm mas Wiley i NIST/EPA/NIH

Biblioteka Wiley Registry of mass spectral data, 9th edition była reklamowana jako ta, która posiada ponad dwa razy więcej widm niż NIST11. Jednak liczba widm nie jest jedynym czynnikiem odróżniającym obie kolekcje. Równie istotna jest jakość zgromadzonych w nich widm. Zespół pracowników NIST ustawicznie kontroluje ten parametr i w razie konieczności usuwa widma, których jakość jest zbyt niska. Z kolei zespół Wileya pozostawia w swoich zbiorach nawet widma niskiej jakości. Bardzo często zdarzało się, że pomimo tak licznych zbiorów, widmo danego związku występowało wyłącznie w jednym z nich, co zmuszało spektrometrystów do posiadania obydwu omawianych kolekcji [67b]. W odpowiedzi na takie zapotrzebowanie od ponad dekady Wiley i NIST rozpoczęły współpracę, która stworzyła możliwość nabycia obu

25

zbiorów w jednym zakupie. Spowodowało to znaczne ułatwienie pracy w czasochłonnej procedurze przeszukiwania bibliotek. Dane dotyczące połączonych wydań obu bibliotek wraz z liczbą widm i związków zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Połączone wersje bibliotek Wiley i NIST Rok

wydania

Nazwa biblioteki

Liczba widm

Liczba związków brak danych Wiley 7th i NIST02 444000 360000 brak danych Wiley 7th i NIST05 461000 brak danych 2006 Wiley 8th i NIST05 532573 brak danych brak danych Wiley 8th i NIST08 562000 brak danych brak danych Wiley 9th i NIST08 796000 667000 brak danych Wiley 9th i NIST11 800000 680000 2014 Wiley 10th i NIST12 870000 736000

3.3.4. Inne biblioteki widm mas

Oprócz dwóch omówionych bibliotek widm mas, istnieje jeszcze wiele mniejszych, zwykle bardziej specjalistycznych kolekcji widm, które były czasami włączone do różnych edycji baz NIST i Wiley. Do najważniejszych z nich należą:

 zbiór widm mas związków organicznych [69], zawierający 37055 widm,

 zbiór widm mas leków, obejmujący 20296 widm [70],

 zbiór widm mas związków lotnych obecnych w żywności, obejmujący 1620 widm [71],

 zbiór widm mas i danych z chromatografii gazowej leków, trucizn, pestycydów, zanieczyszczeń i ich metabolitów, obejmujący 8650 widm [72],

 zbiór widm mas związków smakowych i zapachowych, obejmujący 3000 widm [73],

 zbiór widm mas pestycydów, obejmujący 958 widm [74],

 zbiór widm mas związków geochemicznych, petrochemicznych i biomarkerów, obejmujący 1100 widm [75],

 zbiór widm mas związków aktywnych fizjologicznie, w tym leków, hormonów sterydowych i związków zaburzających gospodarkę hormonalną, obejmujący 4182 widma [76].

26

Powyższa lista nie uwzględnia kolekcji prywatnych, będących w dyspozycji licznych grup badawczych i laboratoriów specjalistycznych wyposażonych w spektrometry mas i reprezentujących różne szczegółowe dziedziny przemysłu, medycyny, nauki oraz ochrony środowiska.

3.4. Interpretacja widm mas związków organicznych

Przed przystąpieniem do interpretacji widma mas nieznanego związku należy ustalić pochodzenie i historię próbki, co często ułatwia wyjaśnienie jego struktury chemicznej.

Takie postępowanie zwykle zawęża liczbę substancji, których widma wykazują duże podobieństwo do widma związku w badanej próbie [48d]. Gdy widmo mas zawiera sygnały pochodzące od mieszaniny kilku substancji, wówczas jego interpretacja jest bardzo trudna, a jej końcowy wynik niepewny. W takim przypadku próbkę poddaje się najczęściej chromatograficznemu frakcjonowaniu na składowe, przed sekwencyjnym wprowadzeniem ich do komory jonizacyjnej spektrometru [52b].

Do interpretacji widm mas nieznanych związków organicznych najczęściej stosuje się jedną z trzech wymienionych poniżej metod:

 przeszukanie bibliotek,

 standardową procedurę interpretacji SIP (ang. standard interpretation procedure),

 klasyfikatory widm mas.

3.4.1. Przeszukiwanie bibliotek widm

Biblioteki widm mas są powszechnie wykorzystywane jako pomoc w identyfikacji nieznanych związków chemicznych, na podstawie ich widm wykonanych najczęściej techniką jonizacji elektronami [77]. Podczas procesu przeszukania tych bibliotek (ang.

library search) związki, których widma wykazują największe podobieństwo do widma związku nieznanego są prezentowane w postaci tzw. listy trafień HL (ang. hit list) uporządkowanej wg malejącego indeksu podobieństwa, wygenerowanego przez zastosowany algorytm wyszukiwania [78]. Przykładowo, w celu identyfikacji związku

27

nieznanego techniką przeszukania biblioteki NIST08 [47], należy zaimportować plik z jego danymi widmowymi (wartości m/z i ich intensywności względne) w zdefiniowanym formacie. Do takich formatów należą: pliki z rozszerzeniem .msp opracowane przez NIST oraz .jdx zdefiniowane przez Połączony Komitet do Fizycznych Danych Atomowych i Cząsteczkowych JCAMP (ang. Joint Committee on Atomic and Molecular Physical Data). Należy zauważyć, że format pliku JCAMP powszechnie wykorzystywany w chemii analitycznej obejmuje dwie wersje [79]:

 JCAMP–DX [80] zawierającą dane widmowe,

 JCAMP–CS [81] zawierającą dane strukturalne.

Istnieje również możliwość zaimportowania danych widmowych w innym formacie niż wyżej wspomniane, jednak każdą próbę wprowadzenia danych widmowych nieznanego związku chemicznego do biblioteki należy potwierdzić empirycznie [82]. Poniżej przedstawiono procedurę przykładowego przeszukania biblioteki NIST08, celem zidentyfikowania widma związku nieznanego, którego rolę pełniło widmo butanu wyeksportowane z ww. biblioteki w pliku z rozszerzeniem .msp (rysunek 4).

Rysunek 4. Dane zawarte w pliku z rozszerzeniem .msp dla butanu wyeksportowane z biblioteki NIST08 [47].

W następnym etapie plik ten zaimportowano z powrotem do biblioteki NIST08 (traktując go jako badane widmo nieznanego związku chemicznego) i przeprowadzono proces jej przeszukania otrzymując wynik w postaci listy trafień (tabela 5).

28

Tabela 5. Lista trafień HL będąca wynikiem przeszukania biblioteki NIST08, po zaimportowaniu do niej widma butanu

Lp. Lib. Match R.Match Prob. [%] Name

1 M 999 999 95,9 butane

2 R 986 986 95,9 butane

3 R 961 966 95,9 butane

4 M 849 849 2,64 isobutane

5 R 840 845 2,64 isobutane

6 R 836 836 2,64 isobutane

7 R 819 819 2,64 isobutane

8 R 796 801 0,52 pentane

9 R 769 770 0,15 acetic acid, 2–propenyl ester

10 M 764 771 0,12 pentanal, 2–methyl

Lib. – biblioteka, z której pochodzi widmo: M – mainlib – biblioteka główna, R – replib – biblioteka replik (ang. Replicates Library).

Match lub Match Factor – współczynnik dopasowania dla widma związku nieznanego i tego z biblioteki. Jego wartość bazuje na zsumowaniu i porównaniu wartości intensywności wszystkich sygnałów związku nieznanego i obecnego w bibliotece.

W przypadku bardzo dobrego dopasowania, wartość Match wynosi 999. W miarę jej obniżania, maleje podobieństwo porównywanych widm. Wartość Match równa zero oznacza, że widma nie posiadają wspólnych sygnałów [77].

R.Match (lub Reverse Search Match Factor) – współczynnik dopasowania widm związku nieznanego i z biblioteki, który w obliczeniach pomija sygnały widma związku nieznanego, nieobecne w widmie referencyjnym [83].

Prob. [%] – prawdopodobieństwo, że wynik na HL jest poprawny. Zakłada ono, że widmo związku nieznanego występuje w przeszukiwanej bibliotece [83];

Name – nazwa związku chemicznego.

Z powyższego przykładu wynika, że w przypadku obecności badanego związku w przeglądanej bibliotece MS, zastosowana procedura pozwala na odnalezienie odpowiadającego mu widma, przy czym u góry listy trafień pojawią się związki chemiczne o identycznej lub bardzo zbliżonej budowie. Metoda porównania widma związku nieznanego z widmami referencyjnymi z biblioteki będzie mniej efektywna wówczas, gdy widmo związku nieznanego nie zostało wcześniej skatalogowane [84].

W takim przypadku można podjąć próbę wyszukiwania podstruktur na podstawie zdefiniowanego uprzednio zestawu cech widmowych (ang. spectral features). Niestety

29

ich identyfikacja w badanym widmie mas bardzo często okazuje się trudna lub wręcz niemożliwa, ponieważ nawet powszechnie występujące podstruktury mogą dawać odmienne wartości m/z, w zależności od związku chemicznego, który tworzą.

Przyczyną takich rozbieżności jest inna skala fragmentacji konkurencyjnych, ściśle związanych z budową cząsteczek [84].

Do roku 1995 opracowano wiele programów komputerowych służących jako pomoc do wyjaśniania struktury nieznanej substancji, takich jak: program SISCOM (ang. search for identical and similar compounds), opracowany przez Henneberga i współprac.

[85,86] do wyszukiwania identycznych i podobnych związków chemicznych na podstawie widm mas, czy samouczący się system wyszukiwania i interpretacji widm mas STIRS (ang. self–training interpretive and retrieval system) wynaleziony przez grupę badawczą McLafferty'ego [87]. Jednak przełomową pod tym względem okazała się dopiero praca opublikowana w 1996 roku przez Varmuzę i Werthera [44], w której wprowadzono pojęcie klasyfikatora widm mas i pokazano przekonywujące przykłady implementacji metod statystyki multiwariacyjnej do wyjaśniania struktury wybranych pochodnych organicznych, w oparciu o ich niskorozdzielcze widma mas zarejestrowane techniką EI.

3.4.2. Standardowa procedura interpretacji widm mas

Po stwierdzeniu, że badane widmo mas zawiera sygnały wyłącznie od jednej substancji, wyjaśnienie jej struktury można dokonać według zasad tzw. standardowej procedury interpretacji SIP (ang. standard interpretation procedure) widm opracowanej przez McLafferty'ego i Turečka [41a]. Obejmuje ona sekwencję następujących po sobie czynności, zmierzających kolejno do ustalenia:

 masy cząsteczkowej, składu pierwiastkowego, obecności pierścieni oraz wiązań podwójnych,

 obecności podstruktur,

 obecności wiązań chemicznych pomiędzy odnalezionymi podstrukturami,

 możliwych struktur cząsteczek oraz porównanie każdej z nich ze wszystkimi dostępnymi danymi zebranymi w bibliotekach widm.