Analiza oddziaływania allelopatycznego Synechococcus sp. oraz jego konsekwencje dla stanu środowiska Morza Bałtyckiego
Sylwia Śliwińska-Wilczewska1, Jakub Maculewicz1, Kinga Gergella1, Zuzanna Sylwestrzak1, Adam Latała1
1Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański, Al. M. Piłsudskiego 46, 81-378 Gdynia, e-mail:
ocessl@ug.edu.pl
Wstęp
Obecnie prowadzi się intensywne badania stanu i przemian środowiska Morza Bałtyckiego, poprzez monitorowanie i analizowanie zachodzących w nim procesów i ustalenie na tej podstawie strategii dalszych działań. W świetle wzrostu zainteresowania szkodliwymi zakwitami, allelopatia może być kluczowym czynnikiem wpływającym na dominację niektórych gatunków sinic w środowisku wodnym (Gross 2003, Legrand i in.
2003). Na chwilę obecną stosunkowo mało jest wiadomo o roli allelopatii w środowisku wodnym, lecz dane literaturowe wskazują, że oddziaływania allelopatyczne powodują przewagę konkurencyjną niektórych gatunków fitoplanktonu poprzez eliminowanie gatunków fizjologicznie słabszych (Suikkanen i in. 2004). Uważa się także, że oddziaływania allelopatyczne wpływają na biologię komórek, występowanie gatunków i sukcesję gatunkową, w tym na konkurencję pomiędzy sinicami (Legrand i in. 2003). Niekiedy allelopatia może być na tyle efektywną strategią niektórych gatunków sinic, że powoduje tworzenie się masowych zakwitów tych organizmów w wielu zbiornikach wodnych (Suikkanen i in. 2004). Gatunki tworzące masowe zakwity są dziś coraz poważniejszym problemem, zarówno ekologicznym, jak i ekonomicznym (Anderson i in. 2002). Zakwity sinic w Morzu Bałtyckim są powszechnie notowane od XIX wieku, lecz w ostatnich dziesięcioleciach znacznie się nasiliły (Kahru i in. 1994, Stal i in. 2003). Zakwity w Morzu Bałtyckim najczęściej tworzone są przez sinice nitkowate (Kahru i in. 1994), co czyni z nich szczególnie interesujący obiekt badań. Natomiast mniej rozpoznane sinice pikoplanktonowe z rodzaju Synechococcus i Synechocystis mogą w Bałtyku stanowić nawet 80% całkowitej biomasy sinic i 50% całkowitej produkcji pierwotnej w letnim zakwicie (Stal i in. 2003, Jodłowska i Śliwińska 2014). Ponadto badania wykazały, że pikoplanktonowe sinice Synechococcus sp. wykazują aktywność allelopatyczną (Śliwińska in. 2014), przez co mogą oddziaływać na otaczający je ekosystem. Zakwity sinic są często prawie monogatunkowe, co sugeruje na występowanie istotnego mechanizmu, który powoduje dużą przewagę tych gatunków nad innymi gatunkami fitoplanktonu. Dlatego w ostatniej dekadzie oddziaływania allelopatyczne sinic są coraz intensywniej badane i analizowane (Leflaive i Ten-Hage 2007).
Głównym celem niniejszej pracy było wykazanie wpływu oddziaływania allelopatycznego pikoplanktonowej sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki nitkowatych sinic bałtyckich poprzez analizę zmian ich liczebności, morfologii oraz tempa fotosyntezy.
1. Materiał i metody
Materiał wykorzystywany w doświadczeniach stanowiły szczepy bałtyckich pikoplanktonowych sinic Synechococcus sp. (BA-124) oraz nitkowatych sinic Geitlerinema amphibium (BA-13) i Nodularia spumigena (BA-15), które pochodziły z Kolekcji Kultur Glonów Bałtyckich (CCBA). W celu realizacji doświadczeń na uchwycenie zjawiska allelopatii występującego u analizowanej sinicy Synechococcus sp. została wykorzystana metoda „cross-culturing” (Suikkanen i in. 2004). W metodzie tej badania określające oddziaływanie allelopatyczne były prowadzone poprzez dodanie 2 ml przesączu uzyskanego z Synechococcus sp. do hodowli wszystkich badanych sinic. Przesącz pochodził z przefiltrowania kultur Synechococcus sp. przez sączki z bibuły szklanej Whatman GF/C i był dodawany wielokrotnie do 25 ml kolb Erlenmeyera zawierających 20 ml testowanych organizmów. We wszystkich eksperymentach wyjściowe stężenie chlorofilu a w kulturach badanych sinic wynosiło 0,8 µg chl a·ml-1. Próby kontrolne były sporządzane przez dodanie pożywki mineralnej f/2 (Guillard 1975) o objętości równej dodawanego przesączu. W przeprowadzonych doświadczeniach koncentracja komórek w hodowlach określona została przez pomiar gęstości optycznej bałtyckich szczepów sinic. Gęstość optyczna (OD) mierzona była na spektrofotometrze Thermo Scientific model Multiskan GO, dla długości fali 750 nm.
Zdjęcia komórek badanych sinic wykonano przy użyciu mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse 80i z kontrastem Nomarskiego. W przeprowadzanych doświadczeniach pomiary tempa wymiany gazowej zostały wykonane metodą polarograficzną przy użyciu elektrody tlenowej Clarka w odpowiednich komorach układu Chlorolab-2, firmy Hansatech. Przebieg krzywych świetlnych został dopasowany do danych pomiarowych z wykorzystaniem programu komputerowego Statistica® i funkcji podanej przez Jassby i Platt (1976). Każdy wariant doświadczenia był prowadzony w trzech powtórzeniach, a wyniki eksperymentów zostały przedstawione jako wartość średnia z trzech niezależnych pomiarów. Opracowanie statystyczne wyników wykonano przy użyciu programu komputerowego Statistica®. Testowanie istotności różnic pomiędzy średnimi wykonano za pomocą metody statystycznej ANOVA dla układów jednoczynnikowych na przyjętym poziomie istotności p=0,05.
2. Wyniki
W pracy określono liczebność komórek (% kontroli) G. amphibium i N. spumigena uzyskaną 1, 3 i 7 dnia hodowli z dodatkiem wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. (Rys. 1). Doświadczenia z dodaniem przesączu uzyskanym z kultur sinicy Synechococcus sp. wykazały statystycznie istotny hamujący jego wpływ na liczebność komórek G. amphibium i N. spumigena (p<0,05). Stwierdzono również, że wraz z wydłużonym czasem ekspozycji na zadany przesącz malała odpowiedź badanych sinic. W pracy wykazano, że ostatniego dnia eksperymentu pod wpływem wielokrotnego przesączu uzyskanego z kultur Synechococcus sp., spadek odpowiedzi u analizowanych sinic wyniósł odpowiednio: 56,4 (±2,9)% i 62,9 (±5,2)% w stosunku do kontroli (p<0,05).
Rys. 1 Liczebność komórek (% kontroli) dla a) G. amphibium (BA-13) i b) N. spumigena (BA-15) uzyskana 1, 3 i 7 dnia hodowli z dodatkiem wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. Wartości przedstawiono jako średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach. * - oznacza różnice istotne statystycznie w stosunku do kontroli (α=0,05).
Zmiany morfologiczne komórek sinic poddanych działaniu przesączu pochodzącego z kultur Synechococcus sp. przedstawiono na Rys 2. W pracy wykazano, że dodanie przesączu powodowało ograniczenie pigmentacji oraz lizę komórek u nitkowatych sinic G. amphibium i N. spumigena w porównaniu z hodowlami kontrolnymi. Obserwacje mikroskopowe wykazały ponadto występowanie zdegradowanych komórek oraz pękaniu i rozrywaniu nici, a efekt ten nasilał się wraz z czasem ekspozycji na zadane związki.
Rys. 2 Morfologia komórek dla a) G. amphibium i b) N. spumigena uzyskana 7 dnia hodowli dla A) kontroli oraz B) po dodaniu przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp.
W pracy wykonano również pomiary krzywych świetlnych fotosyntezy dla G. amphibium i N. spumigena uzyskane 7 dnia hodowli dla kontroli i doświadczeń z dodatkiem
wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. (Rys. 3). Wyniki wykazały, że dodanie przesączu z Synechococcus sp. powodowało istotny spadek parametru charakteryzującego fotosyntezę maksymalną - Pm u badanej sinicy G. amphibium i N.
spumigena, a ilość produkowanego tlenu po wielokrotnym dodaniu przesączu była odpowiednio o 67% i 35% niższa niż w warunkach kontrolnych (p<0,05).
Rys. 3 Krzywe świetlne fotosyntezy dla a) G. amphibium i b) N. spumigena uzyskane 7 dnia hodowli dla kontroli i doświadczeń z dodatkiem wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. (wartości średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach).
3. Dyskusja i podsumowanie
Oddziaływania pomiędzy różnymi gatunkami sinic poprzez wydzielanie związków allelopatycznych mogą odgrywać znaczącą rolę w środowisku wodnym (Gross 2003). Uważa się, że oddziaływania allelopatyczne wpływają na występowanie gatunków, sukcesję gatunkową oraz konkurencję pomiędzy sinicami i mikroglonami (Legrand i in. 2003).
Wytwarzanie aktywnych związków organicznych jest ważną adaptacją, dzięki której niektóre gatunki sinic mogą osiągać przewagę konkurencyjną nad pozostałymi producentami pierwotnymi (Legrand i in. 2003). Ciekawą koncepcją w kontekście ewolucyjnym jest wzajemne oddziaływanie allelopatyczne sinic. U sinic allelopatia wydaje się być szczególnie obecna wśród gatunków słodkowodnych (Gross 2003), lecz ostatnio przedstawiono dowody na hamowanie wzrostu organizmów targetowych także przez brakiczne sinice (Suikkanen i in.
2004). Mimo, iż występowanie oddziaływania allelopatycznego jest powszechne u wielu przedstawicieli sinic, dokładny mechanizm działania i charakterystyka wielu wydzielanych przez nie związków chemicznych pozostaje wciąż niewystarczająco poznana (Gross 2003;
Legrand i in. 2003). Najbardziej powszechną metodą określania oddziaływania allelopatycznego jest analiza zmian liczebności komórek targetowych (Suikkanen i in. 2004).
W pracy wykazano, że największa inhibicja wzrostu występowała ostatniego dnia eksperymentu dla sinicy G. amphibium, która wyniosła około 56% w stosunku do kontroli.
Wykonywanie doświadczeń z wielokrotnym dodaniem przesączu powoduje, że obserwowany efekt jest bliższy sytuacji występującej w środowisku naturalnym, gdyż związki
allelopatyczne są przypuszczalnie stale uwalniane do środowiska (Suikkanen i in. 2004).
Dane literaturowe wskazują, że niektóre nitkowate sinice zdolne są do produkowania związków antybiotycznych, które wpływają na wzrost innych gatunków sinic. Badania przeprowadzone przez Schagerl i in. (2002) wykazały, że Anabaena torulosa była sinicą, która hamowała wzrost Anabaena cylindrica i Microcystis flos-aquae. Również badania przeprowadzone przez Valdor i Aboal (2007) wykazały, że ekstrakty uzyskane z sinic Oscillatoria sp., Rivularia biasolettiana, Rivularia haematites, Geitlerinema splendidum, Phormidium sp., Tolypothrix distorta i Scytonema myochrous miały hamujący efekt na wzrost Nostoc sp., Pseudocapsa sp. i Scytonema sp. W tych badaniach Pseudocapsa sp. i Nostoc sp.
były najbardziej wrażliwymi gatunkami, a ich wzrost był całkowicie hamowany przez wszystkie ekstrakty sinic. Przypuszcza się, że sinice mogą redukować wzrost tych samych taksonów i właśnie to powoduje znaczące zmiany w strukturze fitoplanktonu (Legrand i in.
2003). Ponadto w niniejszym eksperymencie zaobserwowano zmiany morfologiczne u wszystkich badanych nitkowatych sinic. Pod wpływem przesączu z Synechococcus sp.
komórki sinic stały się puste oraz doszło do rozerwania łańcuchów i degradacji komórek.
Wyniki zaprezentowane przez Valdor i Aboal (2007), także wykazały, że przesącz z sinic z rzędu Oscillatoriales wpływał na rozdzielanie się nici Pseudocapsa sp. i Nostoc sp. na pojedyncze komórki. Uzyskane wyniki mogą w części wyjaśnić możliwe przyczyny osiągania przez pikoplanktonowe sinice Synechococcus sp. przewagi konkurencyjnej nad innymi gatunkami fitoplanktonu w wielu zbiornikach wodnych. Kolejnym możliwym mechanizmem działania związków allelopatycznych jest ich wpływ na aktywność fotosyntetyczną organizmów targetowych. W pracy wykazano spadek tempa fotosyntezy u badanych sinic pod wpływem dodania przesączu z Synechococcus sp. Dane literaturowe wskazują, że związki allelopatyczne wydzielane przez sinice mogą wpływać na proces fotosyntezy, a szczegółowe badania wykazały, że działają one głównie na fotosystem II (PSII). W swojej pracy von Elert i Jüttner (1997) wykazali, że związki allelopatyczne uzyskane z kultur T. doliolum hamowały przepływ elektronów w fotosystemie II innych sinic. Z kolei Singh i in. (2001) wykazali, że mikrocystyna powoduje inhibicję wzrostu Nostoc muscorum i Anabena sp., a inhibicja ta była związana z ograniczeniem tempa fotosyntezy (redukcją pochłaniania CO2 i wydzielania O2) oraz z redukcją aktywności wiązania azotu. Hamowanie fotosyntezy, głównego procesu fizjologicznego u konkurujących producentów pierwotnych może być efektywną strategią obronną występującą u sinic (Gross 2003). W pracy wykazano, że sinicowe związki allelopatyczne ograniczają aktywność fotosystemów i sprawność fotosyntezy, a to leży u podstaw zahamowania wzrostu hodowli organizmów targetowych. Na chwilę obecną niewiele jest wiadomo o dokładnej roli zjawiska allelopatii w środowisku wodnym, lecz uważa się, że allelopatia może być efektywną strategią niektórych gatunków sinic, powodującą tworzenie się masowych zakwitów tych organizmów (Legrand i in. 2003, Gross 2003). Mimo wagi problemu nie występuje zbyt wiele prac podejmujących temat oddziaływania allelopatycznego sinic w Morzu Bałtyckim. Dlatego tak ważne jest badanie oddziaływania allelopatycznego, aby móc w przyszłości lepiej rozumieć i monitorować nasilające się masowe zakwity sinic w Morzu Bałtyckim i na tej podstawie ustalać strategię dalszych działań.
Literatura
Anderson D. M., Glibert P. M., Burkholder J. M., 2002, Harmful algal blooms and eutrophication: nutrient sources, composition and consequences. Estuaries 25, 704–726.
Gross E. M., 2003, Allelopathy of Aquatic Autotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences 22, 313–339.
Guillard R. R. L., 1975, Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates [w:] Smith W. L., Chanley M. H. (Eds.). Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, 26–60.
Jassby A. D., Platt T., 1976, Mathematical formulation of the relationship between photosynthesis and light for phytoplankton. Limnology and Oceanography 21, 540–547.
Jodłowska S., Śliwińska S., 2014, Effects of light intensity and temperature on the photosynthesis irradiance response curves and chlorophyll fluorescence of three picocyanobacterial strains of Synechococcus (Cyanobacteria, Synechococcales).
Photosynthetica 52, 223–232.
Kahru M., Horstmann U., Rud O., 1994, Satellite detection of increased cyanobacterial blooms in the Baltic Sea: natural fluctuation or ecosystem change? Ambio 23, 469–472.
Leflaive J., Ten-Hage L., 2007, Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters: a comparison of Allelopathic compounds and toxins. Freshwater Biology 52, 199–214.
Legrand C., Rengefors K., Fistarol G. O., Granéli E., 2003, Allelopathy in phytoplankton - biochemical, ecological and evolutionary aspects. Phycologia 42, 406–419.
Schagerl M., Unterrieder I., Angeler D. G., 2002, Allelopathy among Cyanoprokaryota and Other Algae Originating from Lake Neusiedlersee (Austria). International Review of Hydrobiology 87, 365–374.
Singh D. P., Tyagi M. B., Kumar A, Thakur J. K., 2001, Antialgal activity of a hepatotoxin- producing cyanobacterium, Microcystis aeruginosa. World Journal of Microbiology and Biotechnology 17, 15–22.
Stal L. J., Albertano P., Bergman B., Bröckel K., Gallon J. R., Hayes P. K., Sivonen K., Walsby A. E., 2003, BASIC: Baltic Sea cyanobacteria. An investigation of the structure and dynamics of water blooms of cyanobacteria in the Baltic Sea – responses to a changing environment. Continental Shelf Research 23, 1695–1714.
Suikkanen S., Fistarol G. O., Granéli E., 2004, Allelopathic effects of the Baltic Cyanobacteria Nodularia spumigena, Aphanizomenon flos-aquae and Anabaena lemmermannii on algal monocultures. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 308, 85–101.
Śliwińska S., Skauradszun M., Niemirycz E., Latała A., 2014, The production and release of allelopathic compounds by Baltic cyanobacteria. Ecology and Safety 8, 583–589.
Valdor R., Aboal M., 2007, Effects of living cyanobacteria, cyanobacterial extracts and pure microcystins on growth and ultrastructure of microalgae and bacteria. Toxicon 49, 769–
779.
von Elert E., Jüttner F., 1997, Phosphorus limitation and not light controls the extracellular release of allelopathic compounds by Trichormus doliolum (Cyanobacteria). Limnology and Oceanography 42, 1796–1802.
