W pracy przedstawiono podstawowe mechanizmy nieprawid³owoœci (am- plifikacjê genów, mutacje punktowe i delecje, zaburzenia ekspresji ge- nów) wiod¹cych do onkogennej ak- tywacji receptorowych kinaz tyrozy- nowych rodziny ErbB (HER) oraz techniki badania tych zaburzeñ.
Czêœæ I obejmuje zjawisko amplifika- cji genów rodziny ErbB (HER) i meto- dy najczêœciej stosowane do jego de- tekcji.
S³owa kluczowe: onkogeny, recepto- ry ErbB (HER), amplifikacja genów, iloœciowe techniki PCR.
The paper reviews mechanisms (ge- ne amplifications, point mutations and deletions, gene expression altera- tions) leading to excessive activity of the ErbB (HER) family receptor tyro- sine kinases, as well as techniques used in the research on these anoma- lies. Part I shortly describes the phe- nomenon of ErbB (HER) family gene amplification and methods used for its determination.
Key words: oncogenes, ErbB (HER) receptors, gene amplification, quan- titative PCR.
1
1PPrraaccoowwnniiaa DDiiaaggnnoossttyykkii MMoolleekkuullaarrnneejj,, M
Miiêêddzzyyuucczzeellnniiaannyy WWyyddzziiaa³³ BBiiootteecchhnnoollooggiiii U
Unniiwweerrssyytteettuu GGddaaññsskkiieeggoo ii AAkkaaddeemmiiii M
Meeddyycczznneejj ww GGddaaññsskkuu 2
2EEuurrooppeeaann LLaabboorraattoorryy AAssssoocciiaattiioonn,, SSeeccttiioonn IIbbbbeennbbuueerreenn,, IIbbbbeennbbuueerreenn,, GGeerrmmaannyy 3
3IInnssttiittuutt ffüürr KKlliinniisscchhee CChheemmiiee uunndd LLaabboo-- rraattoorriiuummssmmeeddiizziinn,, WWeessttffääiisscchhee WWiillhheellmmss-- U
Unniivveerrssiittäätt MMüünnsstteerr,, MMüünnsstteerr,, GGeerrmmaannyy 4
4WWyyddzziiaa³³ CChheemmiiii UUnniiwweerrssyytteettuu GGddaaññsskkiieeggoo W
Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000000)) vvooll.. 44;; 33 ((110022––110077))
Zaburzenia funkcji receptorów ErbB (HER): mechanizmy i metody badania Czêœæ I. Amplifikacja genów
rodziny ErbB (HER)
Anomalies of ErbB (HER) receptor functions:
mechanisms and methods of detection.
Part I. Gene amplification of ErbB (HER) family
Krzysztof P. Bielawski
1, Ulf Vogt
2, Burkhard H. Brandt
3, Bogdan Falkiewicz
1, 4WSTÊP
Klasê I receptorowych kinaz tyrozyno- wych stanowi¹ receptory epidermalnych czynników wzrostowych, zwane rodzin¹ re- ceptorów ErbB, które wydaj¹ siê szczegól- nie wa¿ne w rozwoju prawid³owych tkanek ró¿nych typów oraz rozwoju procesów no- wotworowych w tkankach pochodzenia epi- dermalnego. Ich budowa i funkcja zosta³y wstêpnie omówione w poprzednim artyku- le [1]. Opisano 4 rodzaje receptorów nale-
¿¹cych do tej grupy:
EGFR (ang. epidermal growth factor re- ceptor) – receptor naskórkowego czynni- ka wzrostu, znany tak¿e jako ErbB-1,
ErbB-2 (jego odpowiednik u gryzoni no- si nazwê NEU),
ErbB-3,
ErbB-4.
Ludzkie receptory tego typu czêsto na- zywane s¹ odpowiednio HER1, HER2, HER3 i HER4. Spoœród nich, ErbB-1 i -2 s¹ onkoproteinami, natomiast ErbB-3 i -4 bia³kami o prawdopodobnej funkcji onko- gennej [2–4]. Niektóre zaburzenia jakoœcio- we i iloœciowe w funkcjonowaniu kinaz tej rodziny zosta³y definitywnie okreœlone jako œciœle zwi¹zane z powstawaniem, rozprze- strzenianiem i odpowiedzi¹ nowotworów na leczenie, co do wielu innych istnieje takie przypuszczenie [5].
Sta³a aktywacja kinaz receptorowych, prowadz¹ca do nadmiernej aktywacji wio- d¹cego przez nie szlaku sygnalizacyjnego, mo¿e byæ wynikiem ró¿norodnych zabu- rzeñ. W uproszczeniu podzieliæ je mo¿na na 3 grupy [5]:
1) mutacje wiod¹ce do konstytutywnej ak- tywnoœci kinazy, niezale¿nej od liganda i nie poddaj¹cej siê inhibicji,
2) autokrynna aktywacja kinazy (produkowa-
nej w prawid³owych iloœciach) przez wy- twarzany przez komórkê w nadmiarze li- gand lub nadekspresja kinazy w obecno- œci wytwarzanego przez komórkê liganda, 3) inne zaburzenia w procesach reguluj¹-
cych aktywnoœæ szlaku wiod¹cego po- przez kinazê receptorow¹, np. dezakty- wacja odpowiedniej fosfatazy.
Na powy¿sze procesy sk³adaæ siê mog¹ ró¿ne zmiany genetyczne i zaburzenia w procesach biochemicznych. Oprócz po- wy¿szych, wystêpuj¹ tak¿e nieprawid³owoœci o nie wyjaœnionym dotychczas szczegó³owo mechanizmie, byæ mo¿e odpowiadaj¹ce czê- œciowo punktowi 1., np. zwi¹zek ekspresji wariantów mRNA genów ErbB, powstaj¹cych w wyniku alternatywnego sk³adania, z onko- genez¹ [6] czy zdolnoœci¹ raka piersi do przerzutowania [7]. Nieprawid³owoœci te i metody ich badania zostan¹ bli¿ej omówio- ne w tym i nastêpnych artyku³ach. Nale¿y podkreœliæ, ¿e znaczenie ka¿dego z nich w onkogennej aktywacji poszczególnych re- ceptorów ErbB jest wyraŸnie ró¿ne.
Jak siê wydaje, najczêstszym spoœród wymienionych mechanizmów jest nad- ekspresja kinazy. U jej pod³o¿a le¿eæ mo-
¿e zjawisko amplifikacji (zwielokrotnienia) liczby kopii genu kinazy w komórce i/lub zjawisko nadmiernej aktywnoœci procesów ekspresji kinazy przy obecnoœci jednego (bez amplifikacji) lub wiêkszej (z amplifika- cj¹) liczby kopii jej genu w komórce.
AMPLIFIKACJA GENÓW RODZINY ErbB
Amplifikacja sekwencji DNA jest proce- sem, w którym selektywnie wzrasta iloœæ kopii okreœlonej czêœci DNA komórki [8, 9].
Zjawisko to dotyczy g³ównie 2 grup genów:
genów warunkuj¹cych opornoœæ na leki oraz protoonkogenów komórkowych. Ka¿-
da jednostka zamplifikowanej sekwencji DNA (amplikon) mo¿e mieæ wielkoœæ od kil- kuset tys. do kilku mln par zasad. Ampli- kony zwykle zorganizowane s¹ w ci¹gi, u³o¿one jeden za drugim. Stwierdza siê czasami obecnoœæ 1–2 powtórzeñ, lecz w literaturze opisano tak¿e przypadki no- wotworów nios¹cych w komórkach ponad 1 tys. kopii onkogenu [10]. Zamplifikowa- ne geny s¹ zlokalizowane albo w chromo- somach, zwykle wewn¹trz szczególnej po- staci fragmentów chromatyny, znanych jako regiony o zatartej strukturze pr¹¿kowej HSR (ang. homogeneously staining regions) lub ABR (ang. abnormally banded regions), al- bo te¿ pozachromosomalnie, jako submikro- skopowe koliste fragmenty DNA lub znacz- nie wiêksze, widoczne w mikroskopie œwietl- nym, autonomiczne, episomalne fragmenty DNA pozbawione centromerów, tzw. ma³e dodatkowe chromosomy lub malutkie chro-
mosomy, zwane M (ang. minute) lub DM (ang. double minute) [8].
Regiony HSR mog¹ wykazywaæ wysok¹ z³o¿onoœæ, nie bêd¹c prost¹ amplifikacj¹ ge- nów jednego chromosomu. Ich wystêpowa- nie stwierdzono w blisko 60 proc. guzów sut- ka analizowanych bezpoœrednimi technikami cytogenetycznymi [11]. W wielu ludzkich no- wotworach nastêpuje amplifikacja okreœlonych protoonkogenów, przy czym najczêœciej ule- gaj¹ amplifikacji geny c-myc, N-myc, c-myb, K-ras/N-ras, H-ras, ets-1, c-abl, Hist-1/Int-2, geny rodziny ErbB [9, 11, 12].
Nie wiadomo, dlaczego wystêpuj¹ 2 for- my amplifikowanego DNA. Nie s¹ te¿ do koñca poznane mechanizmy prowadz¹ce do powstawania zwiêkszonej liczby kopii okreœlonego genu. Najbardziej prawdopo- dobny wydaje siê model zak³adaj¹cy inicju- j¹cy proces amplifikacji, pêkniêcie jednej nici DNA w chromosomie. W prawid³owej
komórce powstaj¹ jednoniciowe przerwy w DNA, prawdopodobnie jako wynik natu- ralnych procesów replikacji i rekombinacji, jednak dalsza replikacja zostaje zatrzyma- na do momentu naprawy uszkodzeñ. Funk- cjê reguluj¹c¹ cykl komórkowy pe³ni tu m.in. bia³ko p53. Gdy jest ono uszkodzone lub go brak, replikacja uszkodzonych nici biegnie dalej, mimo obecnoœci pêkniêæ w jednej nici DNA, generuj¹c pe³ne dwuni- ciowe pêkniêcia chromosomów [9]. Wg kon- cepcji Von Hoffa, ulegaj¹ce w tych warun- kach delecji fragmenty DNA tworz¹ koliste episomy, które z kolei mog¹ b¹dŸ multime- ryzowaæ, formuj¹c chromosomy DM, b¹dŸ ponownie integrowaæ do chromosomów [8].
Chromosomy DM tak¿e mog¹ integrowaæ do chromosomów, tworz¹c regiony o zatar- tej strukturze pr¹¿kowej [8].
Chocia¿ amplifikacja genów generalnie umo¿liwia komórkom wytwarzanie du¿ych ilo- œci kodowanego w amplifikowanym regionie RNA i/lub bia³ka [8], nadekspresja genów nie zawsze wymaga ich amplifikacji, co wiê- cej, niejednokrotnie stwierdza siê wystêpo- wanie zjawiska amplifikacji bez równoczesnej nadekspresji amplifikowanego onkogenu.
Z drugiej strony, amplifikowane sekwencje DNA s¹ potencjalnym celem terapeutycznym;
w niektórych przypadkach obserwowano eli- minacjê chromosomów DM z nowotworowych linii komórkowych i ich ró¿nicowanie w wy- niku zastosowania siarczanu dimetylu (DMSO) lub hydroksymocznika [13].
Oprócz amplifikacji genów znaleziono dowody, ¿e tak¿e duplikacja czêœci se- kwencji genu (np. topoizomerazy I) na po- ziomie DNA lub RNA i wytwarzanie w jej wyniku przez komórki nowotworowe zmo- dyfikowanych bia³ek o wiêkszej masie cz¹- steczkowej, mo¿e byæ odpowiedzialna za opornoœæ komórek nowotworowych na œrod- ki terapeutyczne dzia³aj¹ce poprzez inhibi- cjê tych bia³ek [14].
Metody detekcji zjawiska amplifikacji genów
Badania wystêpowania amplifikacji w po- staci regionów o zatartej strukturze pr¹¿ko- wej HSR lub chromosomów DM mo¿na wy- konaæ technikami cytogenetycznymi, szcze- gólnie bezpoœrednimi, gdy¿ w czasie prowadzenia hodowli zmniejsza siê iloœæ ko- mórek nowotworowych zawieraj¹cych te za- burzenia [11]. Techniki te nie bêd¹ w tej pracy szerzej omawiane, zosta³y bowiem niedawno doskonale przedstawione [15, 16]. Badania iloœciowe amplifikacji genów przeprowadza siê g³ównie technikami hy- brydyzacyjnymi lub ró¿nymi odmianami ilo- œciowej techniki PCR [17, 18].
T
Teecchhnniikkii hhyybbrryyddyyzzaaccyyjjnnee
Wœród technik hybrydyzacyjnych do oznaczania amplifikacji wci¹¿ stosuje siê klasyczn¹ hybrydyzacjê wg Southerna [19, 20], która polega na (kolejno):
ciêciu wyizolowanego DNA odpowiednim enzymem restrykcyjnym,
Ryc. 1. Hybrydyzacja metod¹ Southerna
Trawienie DNA
enzymem restrykcyjnym Elektroforeza
Różnicowa PCR
Kompetycyjna PCR
lub
Reakcja PCR
Reakcja PCR Reakcja PCR
Elektroforeza
Elektroforeza Elektroforeza
hybrydyzacja
Barwienie
Barwienie
BADANY FRAGMENT
BADANY FRAGMENT
BADANY FRAGMENT
BADANY FRAGMENT SONDA C MATRYCA DNA
MATRYCA DNA KOMPETENCYJNA
MATRYCA KOMPETYCYJNA
MATRYCA STANDARD ILOŚCIOWY WEWNĘTRZNY STANDARD
WEWNĘTRZNY STANDARD
BADANY FRAGMENT WEWNĘTRZNY STANDARD
Hybrydyzacja transfer
na nośnik
Ryc. 2. Porównanie ró¿nicowej i kompetycyjnej techniki PCR A
A
B A
A
A B
B
B B
C D
SONDA D
SONDA D SONDA C
elektoforetycznym rozdziale w ¿elu aga- rozowym uzyskanych fragmentów pod wzglêdem ich d³ugoœci,
przeniesieniu rozdzielonych fragmentów na b³onê (filtr) nitrocelulozow¹ lub nylonow¹,
hybrydyzacji sekwencyjnie specyficznych w stosunku do poszukiwanych sekwencji genów, znakowanych radioaktywnie (gene- ralnie wiêksza czu³oœæ) lub nieizotopowo (generalnie mniejsza czu³oœæ) sond oligo- nukleotydowych do odpowiednich fragmen- tów DNA znajduj¹cych siê na filtrze [21].
Sygna³y (radioaktywnoœæ, sygna³ barw- ny lub fluorescencja, w zale¿noœci od spo- sobu wyznakowania zastosowanej sondy) odpowiadaj¹ce genowi badanemu i kon- trolnemu (nie ulegaj¹cemu amplifikacji, ja- ko kontrolê stosuje siê tak¿e zdrow¹ tkan- kê) s¹ nastêpnie mierzone i porównywane, co pozwala na oznaczenie stopnia ampli- fikacji lub delecji badanego genu.
Coraz czêœciej w badaniach amplifika- cji znajduj¹ zastosowanie techniki hybrydy- zacji in situ, w tym najczêœciej fluorescen- cyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescen- ce in situ hybridization, FISH) [15, 22, 23].
W technikach tych hybrydyzacjê przepro- wadza siê bezpoœrednio na odpowiednio przygotowanym materiale tkankowym, bez koniecznoœci wczeœniejszej izolacji i trans- feru zawartego w nim DNA na b³ony nitro- celulozowe czy inny noœnik [24, 25].
T
Teecchhnniikkii aammpplliiffiikkaaccyyjjnnee
Spoœród technik PCR, w badaniach am- plifikacji genów zastosowanie znajduj¹ ró¿- ne odmiany iloœciowej reakcji PCR (ang.
quantitative PCR, qPCR), której celem jest oszacowanie liczby cz¹steczek matrycy w badanej próbie [17, 18]. Decyzja o wy- borze konkretnego wariantu pomiarów ilo- œciowych zale¿y od kilku czynników, z któ- rych najistotniejsze to:
rodzaj matrycy, której liczba kopii ma byæ zbadana,
wymagana dok³adnoœæ pomiaru,
wymagany sposób oszacowania iloœci:
w wartoœciach bezwzglêdnych b¹dŸ te¿
wzglêdem standardu.
Spoœród metod pomiaru liczby kopii ba- danej sekwencji kwasów nukleinowych, naj- szersze zastosowanie znajduj¹: metoda ró¿nicowej PCR (ang. differential PCR, dPCR), w tym odmiana ró¿nicowa techni- ki PCR TaqMan z zastosowaniem sond flu- orescencyjnych i metoda kompetycyjnej PCR (ang. competitive PCR, cPCR).
R
Róó¿¿nniiccoowwaa PPCCRR
Metoda równoczesnej amplifikacji bada- nego genu i fragmentu genu kontrolnego, okreœlana terminem ró¿nicowej techniki PCR (dPCR), zosta³a opisana w 1989 r.
przez Frye’a i wsp. [26] w badaniach am- plifikacji onkogenów; nastêpnie wielokrot- nie optymalizowana [27–33]. Zak³ada ona zastosowanie wewnêtrznego standardu w postaci równoczesnego powielania frag-
mentu badanego DNA i fragmentu DNA z in- nego miejsca tej samej matrycy (DNA ko- mórki). Reakcja zachodzi przy udziale 2 par starterów oligonukleotydowych w tym sa- mym naczyniu reakcyjnym:
1. pary dla sekwencji docelowej ampli- fikowanego onkogenu,
2. pary dla sekwencji genu referencyjne- go (np. ludzkiej β-globiny).
Na geny referencyjne wybierane s¹ ge- ny, które zwykle nie ulegaj¹ w komórkach modyfikacjom. Metoda ta spe³nia swoje za- danie wówczas, gdy obie sekwencje am- plifikowane s¹ ze zbli¿on¹ wydajnoœci¹, co wczeœniej ustala siê empirycznie przez sta- ranne dobranie kombinacji par primerów.
W wyniku wspólnej amplifikacji uzyskuje siê 2 produkty PCR, które nastêpnie analizo- wane s¹ poprzez rozdzia³ w ¿elu poliakry- lamidowym lub agarozowym. Oznaczenie iloœci sekwencji badanej w próbie mo¿liwe jest dziêki porównaniu iloœci produktów re- akcji PCR sekwencji badanej i kontrolnej, powstaj¹cych na danej matrycy, za pomo- c¹ szeregu ró¿nych metod [17, 34], m.in.:
pomiaru iloœci DNA w ¿elu agarozowym, wybarwionym bromkiem etydyny, przy pomocy densytometru laserowego,
pomiaru scyntylacji znakowanych radio- aktywnie produktów PCR,
wbudowania do produktu PCR znaczni- ka fluorescencyjnego i póŸniejszego od- czytu fluorymetrycznego,
oznaczenia kolorymetrycznego produktów PCR, unieruchomionych na filtrze, po hy- brydyzacji z oligonukleotydami znakowa- nymi np. digoksygenin¹,
wizualnego porównania ze wzorcami.
W efekcie uzyskuje siê informacjê o sto- sunku iloœciowym fragmentów DNA bêd¹cych produktami PCR. W ró¿nicowej technice PCR nie mierzymy bezwzglêdnej liczby kopii okre- œlonego onkogenu w komórce czy próbce, tylko jej stosunek do liczby kopii genu refe- rencyjnego, w postaci tzw. œredniej (dla ba- danej w próbce liczby komórek) liczby kopii genu (ang. average gene copy number, AGCN). W przypadku nie zmienionej tkanki, AGCN wynosi 1 (ryc. 3.). Jeœli natomiast sto- sunek iloœciowy obu produktów dPCR nie jest
Ryc. 3. Ró¿nicowa PCR w badaniu protoonkogenu w prawid³owej tkance, nie wykazuj¹cej zjawiska amplifikacji b¹dŸ delecji genu
Ryc. 4. Wykrywanie delecji genu w tkance raka piersi za pomoc¹ metody ró¿nicowej PCR
Onkogen
Elektroforeza
Skanowanie i densytometria
Stosunek intensywności
prążków
< 1 Gen referencyjny
32 cykle PCR
Onkogen
Elektroforeza
Skanowanie i densytometria
Stosunek intensywności
prążków
< 1 Gen referencyjny
32 cykle PCR
Zaburzenia funkcji receptorów ErbB (HER): mechanizmy i metody badania. Czêœæ I. Amplifikacja genów rodziny ErbB (HER)
105
równy 1 (ryc. 4., 5.) mówimy o zjawisku de- lecji (wartoœæ AGCN < 1) lub amplifikacji (wartoœæ AGCN > 1) genu badanego.
Ró¿nicowa PCR zosta³a dotychczas kil- kakrotnie zmodyfikowana, w celu uzyskania dok³adniejszych wyników iloœciowych. Ju¿
najprostsze zastosowanie seryjnych rozcieñ- czeñ próbki badanej (badanego DNA ko- mórkowego) w kontroli DNA referencyjnego jako matrycy do przeprowadzenia reakcji dPCR umo¿liwia dok³adniejsz¹ ocenê AGCN [35]. Podwójna ró¿nicowa technika PCR (ang. double-differential PCR, ddPCR) [36]
charakteryzuje siê zastosowaniem podczas powielania DNA 2 genów referencyjnych, wy-
stêpuj¹cych w organizmie ludzkim w poje- dynczej liczbie kopii oraz genu badanego.
Oprócz fragmentu genu badanego, powiela- niu w reakcji ddPCR poddawane s¹ frag- menty np. genu β-globiny (HBB) i genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD2).
W ka¿dym oznaczeniu, w identycznych wa- runkach reakcyjnych, stosuje siê obok am- plifikacji w 1 probówce onkogenów razem z 1 genem referencyjnym, kontrolê w posta- ci amplifikacji w 2. probówce obu genów re- ferencyjnych (β-globina i dysmutaza ponad- tlenkowa). Analizuj¹c produkty reakcji ddPCR, przede wszystkim szacuje siê sto- sunek iloœci powsta³ych fragmentów DNA obu genów referencyjnych. Wartoœæ
1:1 œwiadczy o prawid³owym zaprojektowa- niu i stê¿eniu primerów w reakcji oraz zrów- nowa¿onym przebiegu reakcji PCR. Techni- ka ddPCR pozwala uzyskiwaæ powtarzalne wyniki amplifikacji DNA ze 100 ng-1 µg tkan- ki raka sutka, a koszty jej zastosowania w rutynowym laboratorium diagnostycznym s¹ oko³o 20-krotnie ni¿sze ni¿ w przypadku hybrydyzacji metod¹ Southerna [4, 37, 38].
W 1999 r. Beckmann i wsp. wprowadzili bez- poœredni¹ ró¿nicow¹ technikê PCR (ang. di- rect-double-differential PCR, dddPCR) [39].
Modyfikacja opiera siê na zastosowaniu wspólnego powielania sekwencji badanej i 2 sekwencji genów referencyjnych w 1 naczy- niu reakcyjnym, przy czym powielane frag- menty sekwencji genów referencyjnych s¹ odpowiednio: 1 d³u¿szy, 2. krótszy od po- wielanego fragmentu genu badanego. Umo¿- liwia to w znacznym stopniu eliminacjê b³ê- dów wynikaj¹cych z nierównomiernego po- wielania matryc o ró¿nych d³ugoœciach.
Zastosowanie w tej technice fluorescencyj- nie znakowanych primerów, rozdzia³u pro- duktów PCR za pomoc¹ elektroforezy kapi- larnej i prostego wzoru matematycznego, po- zwala na dok³adne wyznaczenie AGCN genu badanego, tak¿e w czêœciowo zdegradowa- nym materiale (np. DNA izolowane z tkanek utrwalonych w parafinie), jednak cena ozna- czenia jest wy¿sza ni¿ w przypadku standar- dowej ddPCR [39].
R
Róó¿¿nniiccoowwaa ooddmmiiaannaa tteecchhnniikkii PPCCRR TTaaqqMMaann z
z zzaassttoossoowwaanniieemm ssoonndd fflluuoorreesscceennccyyjjnnyycchh Ró¿nicowa wersja techniki PCR TaqMan (ryc. 6.) [18] z zastosowaniem sond fluore- scencyjnych jest technik¹ stosunkowo no- w¹, szybko te¿ zosta³a zastosowana do oznaczeñ amplifikacji genów rodziny ErbB [40–42]. Podstaw¹ metody jest zastosowa- nie w reakcji PCR polimerazy Taq z Ther- mus aquaticus oraz nie ulegaj¹cej amplifi- kacji sondy oligonukleotydowej o sekwencji komplementarnej do sekwencji powielane- go fragmentu genu. Sonda ta znakowana jest kowalencyjnie na koñcu 5’ znacznikiem fluorescencyjnym (np. 6-karboksyfluoresce- in¹), zaœ na koñcu 3’ wygaszaczem fluore- scencji (np. 6-karboksytetrametylorodami- n¹), odpowiednio dobranym do tego znacz- nika. W tak skonstruowanej sondzie, dopóki znacznik fluorescencyjny i wygaszacz znaj- duj¹ siê stosunkowo blisko siebie, po wzbu- dzeniu znacznika du¿a czêœæ energii fluore- scencji poch³aniana jest przez wygaszacz, w wyniku transferu energii typu Förstera.
W trakcie reakcji PCR sondy hybrydyzuj¹ do komplementarnej sekwencji powielanych fragmentów DNA. Je¿eli zachodzi amplifi- kacja PCR, polimeraza Taq degraduje zhy- brydyzowane sondy w wyniku swojej aktyw- noœci 5’-egzonukleazy, co uwalnia znacznik fluorescencyjny od s¹siedztwa wygaszacza.
Wzbudzenie znacznika odpowiednim impul- sem laserowym wyzwala wówczas znacznie silniejsz¹ fluorescencjê, która mo¿e byæ mierzona fluorymetrycznie. Oczywiœcie, im wiêcej powielonych fragmentów i im wydaj-
Ryc. 5. Wykrywanie amplifikacji genu w tkance raka piersi za pomoc¹ metody ró¿nicowej PCR
Ryc. 6. Technika TaqMan iloœciowej reakcji PCR
Onkogen
5’3’
5’
5’3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Elektroforeza
Skanowanie i densytometria
Stosunek intensywności
prążków
> 1 Gen referencyjny
32 cykle PCR
STARTER
„SENSOWNY”
STARTER
„ANTYSENSOWNY”
STARTER
„ANTYSENSOWNY”
SONDA
ZNACZNIK FLUORESCENCYJNY
WYGASZACZ FLUORESCENCYJNY
SONDA
STARTER
„SENSOWNY”
TAQ
TAQ W
W
W
Z
Z
Z
Zaburzenia funkcji receptorów ErbB (HER): mechanizmy i metody badania. Czêœæ I. Amplifikacja genów rodziny ErbB (HER)
107
niejszy przebieg reakcji PCR, tym wiêcej zdegradowanych sond i uwolnionych cz¹- steczek znacznika, i tym silniejsza fluore- scencja po wzbudzeniu. Wzbudzanie i po- miar fluorescencji mo¿na prowadziæ pod- czas reakcji PCR, obserwuj¹c narastanie fluorescencji w czasie rzeczywistym. W ce- lu oznaczenia AGCN stosuje siê odpowied- ni pomiar dla sekwencji badanej i kontrol- nej [42]. Technika jest bardzo czu³a, umo¿- liwia detekcjê amplifikacji ErbB-2 nawet w DNA kr¹¿¹cym we krwi [42].
K
Koommppeettyyccyyjjnnaa PPCCRR
W reakcji kompetycyjnej techniki PCR (cPCR, ryc. 2.) [18] rolê standardu iloœciowe- go spe³nia odpowiednio skonstruowana syn- tetyczna matryca, czyli kompetytor (nie zaœ endogenna sekwencja odniesienia w obrêbie badanego DNA, jak w ró¿nicowej technice PCR opisanej powy¿ej). Amplifikacji technik¹ cPCR poddaje siê seriê prób zawieraj¹cych tak¹ sam¹ iloœæ badanego DNA oraz ró¿ne iloœci (seryjne rozcieñczenia o znanym stê-
¿eniu) kompetytora. Jest on tak zaprojekto- wany, i¿ obie sekwencje, badana i kontrolna, amplifikowane s¹ w jednej probówce za po- moc¹ tej samej pary primerów i wspó³zawod- nicz¹ ze sob¹ w mieszaninie reakcyjnej o wszystkie jej sk³adniki (st¹d nazwa meto- dy). Jeœli spe³nione jest podstawowe za³o¿e- nie jednakowej wydajnoœci amplifikacji se- kwencji badanej i kontrolnej, wówczas stosu- nek iloœciowy tych sekwencji znajduje odzwierciedlenie w stosunku iloœciowym od- powiednich produktów PCR, a poniewa¿ zna- my bezwzglêdn¹ iloœæ zastosowanego kom- petytora, mo¿emy okreœliæ bezwzglêdn¹ iloœæ badanej sekwencji w analizowanej próbce.
Najwa¿niejsza jest tu mo¿liwoœæ rozró¿nienia obu rodzajów produktów amplifikacji. Kon- strukcja kompetytora umo¿liwia najczêœciej rozró¿nienie produktów amplifikacji sekwencji badanej i kontrolnej, dziêki ró¿nicy wielkoœci lub za pomoc¹ metody hybrydyzacji ze spe- cyficznymi, ró¿nymi dla obu fragmentów DNA, sondami molekularnymi. W oznaczaniu amplifikacji genów przeprowadza siê najczê- œciej oddzielnie reakcjê cPCR dla genu ba- danego i dla genu referencyjnego, oznacza- j¹c bezwzglêdn¹ liczbê ich kopii w próbce, nastêpnie oblicza siê ich stosunek [43–48].
Kombinacje techniki ró¿nicowej i kom- petycyjnej w reakcji PCR zosta³y opisane jako odmiany:
kompetycyjno-ró¿nicowa (ang. competi- tive-differential PCR, cdPCR) [49],
ró¿nicowo-kompetycyjna PCR (ang. diffe- rentially competitive PCR, dcPCR) [50].
Mog¹ byæ one szczególnie u¿yteczne w badaniach ma³ych próbek DNA.
PIŒMIENNICTWO
1. Bielawski KP, Vogt U, Falkiewicz B. Wspó³cze- sna Onkologia 1999; 6: 241-3.
2. Carraway KL, Carothers Carraway CA, Carra- way KL. III J Mammary Gland Biol Neoplasia 1997; 2: 187-198.
3. Gullick WJ. Biochem Soc Symp 1998; 63: 193-8.
4. Vogt U, Bielawski K, Schlotter CM, et al. Gene 1998; 223: 375-80.
5. Kolibaba KS, Druker BJ. Biochim Biophys Acta 1997; 1333: F217-F248.
6. Sawyer C, Hiles I, Page M, Crompton M, Dean C. Oncogene 1998; 17: 919-24.
7. Gebhardt F, Zänker KS, Brandt B. Biochem Biophys Res Commun 1998; 247: 319-23.
8. Von Hoff DH. Cancer Treat Res 1991; 57: 1-11.
9. Hamlin JL. Drug resistance: DNA sequence am- plification. Encyclopedia of Cancer, vol. 1, Academic Press, Inc., 1997; 571-86.
10. Chor¹¿y M. Nowotwory 1997; 47: 251-63.
11. Limon J. Czynniki genetyczne. [W:] Jassem J (red.). Rak sutka. Podrêcznik dla studentów i le- karzy. Springer PWN, Warszawa, 1998; 84-97.
12. Bielawski K. Zastosowanie techniki PCR w ba- daniach onkogenów ErbB i receptorów hormo- nów steroidowych jako potencjalnych czynników prognostycznych i predykcyjnych w raku sutka.
Praca doktorska. Miêdzyuczelniany Wydzia³ Biotechnologii Uniwersytetu Gdañskiego i Aka- demii Medycznej w Gdañsku, Gdañsk, 1998.
13. Eckhardt SG, Dai A, Davidson KK, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91, 6674-8.
14. Komatani H, Morita M, Sakaizumi N, et al.
Cancer Res 1999; 59: 2701-8.
15. Bocian E, Limon J. Metody badañ cytogenetycznych.
[W:] Bal J (red.). Badania molekularne i cytogene- tyczne w medycynie. Elementy genetyki klinicznej.
Springer PWN, Warszawa 1998; 84-101.
16. Limon J, Siedlecki A. Choroby nowotworowe.
[W:] Bal J (red.). Badania molekularne i cytoge- netyczne w medycynie. Elementy genetyki klinicz- nej. Springer PWN, Warszawa 1998; 141-174.
17. Jungerman M. Post Bioch 1997; 43: 250-6.
18. Orlando C, Pinzani P, Pazzagli M. Clin Chem Lab Med 1998; 36: 255-69.
19. Southern EM. J Mol Biol 1975; 98: 503-27.
20. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Scien- ce 1987; 235: 177-82.
21. Bal J. Metody badania kwasów nukleinowych.
[W:] Bal J (red.). Badania molekularne i cytoge- netyczne w medycynie. Elementy genetyki kli- nicznej. Springer PWN, Warszawa 1998; 71-83.
22. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, et al. J Clin Oncol 1999; 17: 1974-82.
23. Madeja Z. Post Biol Kom 1997; 24 (Suppl. 8):
87-100.
24. Ishikawa T, Kobayashi M, Mai M, et al. Am J Pathol 1997; 151: 761-8.
25. Ooi A, Kobayashi M, Mai M, et al. Lab Invest 1998; 78: 345-51.
26. Frye RA, Benz CC, Liu E. Oncogene 1989; 4:
1153-7.
27. Friedrichs K, Lohmann D, Hofler H. Virchows Arch B Cell Pathol 1993; 64: 209-12.
28. Neubauer A, Neubauer B, He M, et al. Onco- gene 1992; 7: 1019-25.
29. Underwood MA, Bartlett JM, Cooke TG. PCR Methods Appl. 1994; 4: 178-184.
30. Zeillinger R, Schneeberger C, Speiser P, et al.
Biotechniques 1993; 15: 89-95.
31. Sundfors CH, Collan YUI. FASEB J 1997; 11:
897-903.
32. Sundfors C, Collan Y. Cell Mol Biol 1995; 41:
671-81.
33. Sundfors C, Collan Y. Electrophoresis 1996;
17: 44-8.
34. Kricka LJ. Clin Chem 1999; 45: 453-8.
35. Gallego S, Reventos J, Sanchez de Toledo J, et al. Anticancer Res 1998; 18: 1211-15.
36. Brandt B, Vogt U, Griwatz C, et al. Detection of amplified oncogenes by differential polymera- se chain reaction. In: Rolfs A, Weber-Rolfs I, Finckh U, editors. Methods in DNA amplifica- tion. New York: Plenum Press 1994: 55-64.
37. Brandt B, Vogt U, Harms F, et al. Gene 1995;
159: 29-34.
38. Brandt B, Vogt U, Schlotter CM, et al. Gene 1995; 159: 35-42.
39. Beckmann A, Vogt U, Huda N, et al. Clin Chem 1999; 45: 141-3.
40. Gelmini S, Orlando C, Sestini R, et al. Clin Chem 1997; 43: 752-8.
41. Bieche I, Olivi M, Champeme MH, et al. Int J Cancer 1998; 78: 661-6.
42. Chiang P-W, Beer DG, Wei W-L, et al. Clin Cancer Res 1999; 5: 1381-6.
43. Hruza C, Dobianer K, Beck A, et al. Eur J Cancer 1993; 29A: 1593-7.
44. Li BD, Harlow SP, Budnick RM, et al. Cancer 1994; 73: 2771-8.
45. Sestini R, Orlando C, Zentilin L, et al. Clin Chem 1994; 40: 630-6.
46. Selli C, Amorosi A, Vona G, et al. J Urol 1997;
158: 245-7.
47. Orlando C, Sestini R, Zentilin L, et al. J Biolu- min Chemilumin 1994; 9: 223-8.
48. Orlando C, Sestini R, Vona G, et al. J Urol 1996; 156: 2089-93.
49. Roetger A, Brandt B, Barnekow A. DNA Cell Biol 1997; 16: 443-8.
50. Deng G, Yu M, Chen LC, et al. Breast Cancer Res Treat 1996; 40: 271-81.
ADRES DO KORESPONDENCJI dr n. med. KKrrzzyysszzttooff BBiieellaawwsskkii Pracownia Diagnostyki Molekularnej Miêdzyuczelniany Wydzia³ Biotechnologii Uniwersytetu Gdañskiego i Akademii Medycznej w Gdañsku
ul. K³adki 24 80-822 Gdañsk
Praca wykonana w ramach projektu BW UG nr B000-5-0134-9, finansowanego przez KBN.
