• Nie Znaleziono Wyników

Małe RNA Małe RNA

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Małe RNA Małe RNA"

Copied!
69
0
0

Pełen tekst

(1)

Małe RNA Małe RNA

Monika

Monika Zakrzewska Zakrzewska- -Płaczek Płaczek

monika.z@ibb.waw.pl

monika.z@ibb.waw.pl

(2)

2

Małe RNA (small RNAs, sRNAs) Małe RNA (small RNAs, sRNAs)

sRNA – 21-30 nt

wyciszanie ekspresji genów:

(gene silencing, RNA silencing)

post-transkrypcyjne wyciszanie genów

(post-transcriptional gene silencing, PTGS)

degradacja mRNA, inhibicja translacji

transkrypcyjne wyciszanie genów

(transcriptional gene silencing, TGS)

epigenetyczne modyfikacje chromatyny

AAAAA

RNA Pol modyfikacja

modyfikacja histon histonó ów w, , metylacja metylacja DNA DNA

(3)

3

mirtrony pochodzące z intronów prekursorów mRNA genów kodujących białka; występują u zwierząt; niezależne od Drosha

Regulacja post- transkrypcyjna TAS RNA cięte przez

miRNA DCL4

21nt rośliny

tasiRNA

(trans-acting siRNA)

Regulacja genów odpowiedzi na stres Transkrypcja

dwukierunkowa indukowana stresem DCL2

DCL1 24nt

rośliny 21nt natsiRNA

(natural antisense transcripts-derived siRNA)

siRNA

(small interferring RNA) – większość działa in cis, za wyjątkiem tasiRNA

Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów Transkrypcja

dwukierunkowa lub

zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami

pseudogenów o przeciwnej orientacji Dicer

~21nt rośliny,

grzyby, zwierzęta, Protista endo-siRNA

(pochodzenia endogennego)

Post-transkrypcyjna

regulacja ekspresji genów, obrona przeciwwirusowa Transgeniczny, wirusowy

lub inny egzogenny RNA Dicer

21-24nt rośliny,

grzyby, zwierzęta, Protista exo-siRNA

(pochodzenia egzogennego)

Regulacja stabilności mRNA (cięcie mRNA), inhibicja translacji

Transkrypcja przez Pol II/Pol III Drosha

(u zwierząt)

+ Dicer 20–25nt

rośliny, zwierzęta, wirusy, Protista

miRNA

(microRNA)

PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów

Klasy ma

Klasy mał łych RNA: ych RNA:

(4)

4

Modyfikacja chromatyny Transpozony, powtórzenia

DCL3 24-26nt

rośliny, S. pombe hc-siRNA

(heterochromatic siRNA)

siRNA

(small interferring RNA)

Regulacja aktywności transpozonów, inne nieznane funkcje Długie pierwotne

transkrypty (?) niezależne

od Dicer 24–30nt

Drosophila, C. elegans, ssaki, Danio rerio

piRNA

(Piwi-interacting RNA)

Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów Transkrypcja

dwukierunkowa lub

zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami

pseudogenów o przeciwnej orientacji Dicer

~21nt rośliny,

grzyby, zwierzęta, Protista endo-siRNA

(pochodzenia endogennego)

TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów

Klasy ma

Klasy mał łych RNA: ych RNA:

(5)

5

Bia Bia łka ł ka Dicer Dicer i i Argonaute Argonaute (AGO): (AGO):

g g łó ł ówne elementy szlaku wyciszania RNA wne elementy szlaku wyciszania RNA

Dwuniciowy

Dwuniciowy RNA RNA

(double ( double- -stranded RNA stranded RNA, , dsRNA dsRNA) )

jest ci

jest ci ę ę ty przez ty przez Dicer Dicer na kr

na kr ó ó tkie tkie dwuniciowe dwuniciowe cz cz ą ą steczki RNA, steczki RNA,

kt kt ó ó re s re s ą ą wi wi ą ą zane zane przez jedno z bia

przez jedno z bia ł ł ek ek rodziny

rodziny ARGONAUTE ARGONAUTE . .

DICER

AGO

wyciszenie

(6)

6

Wyciszanie ekspresji gen

Wyciszanie ekspresji gen ów ó w

DCL

MIR gene

RNA Pol

AGO AAAn AAAn

RNA Pol

miRNA -

inhibicja translacji, cięcie mRNA

AAAn

mRNA

AGO

DCL

AGO AAAn

AGO

RNA Pol

siRNA -post-

AGO

transkrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów

AGO

AAAn

(7)

7

PAZ

RIII

RIII

MacRae

MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., , I.J., Zhou, K., Li, F., RepicRepic, A., Brooks, A.N., , A., Brooks, A.N., CandeCande, W.., Adams, P.D., and , W.., Adams, P.D., and DoudnaDoudna, J.A. (2006) Science, J.A. (2006) Science

Podczas biogenezy siRNA i miRNA,

białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o strukturze spinki

(hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.

Podczas biogenezy siRNA i miRNA,

białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o strukturze spinki

(hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.

Struktura bia

Struktura biał łka ka Dicer Dicer umo umoż żliwia r liwia ró ównomierne rozcinanie wnomierne rozcinanie RNA RNA na fragmenty o takiej samej d

na fragmenty o takiej samej dł ługo ugoś ści. ci.

Dicer

Dicer i i Dicer Dicer - - like like

(8)

8

PAZ

RIII

RIII

Dicer

Dicer i i Dicer Dicer - - like like

2 domeny typu 2 domeny typu

RNazy RNazy III III

aktywno

aktywność ść endonukleolityczna endonukleolityczna 5’ 5 ’P / 3 P / 3’ ’OH OH

PAZ PAZ

konserw

konserw owana owana domena domena wiążą wi ążą ca dsRNA ca dsRNA

(

(dsRBD dsRBD- - dsRNA dsRNA- -binding binding domain) domain ) oddzia

oddzia łuje z ko ł uje z koń ń cem 3’ cem 3 dsRNA dsRNA

MacRae

MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., , I.J., Zhou, K., Li, F., RepicRepic, A., Brooks, A.N., , A., Brooks, A.N., CandeCande, W.., Adams, P.D., and , W.., Adams, P.D., and DoudnaDoudna, J.A. (2006) Science, J.A. (2006) Science

(9)

9

Argonaute Argonaute

Bohmert

Bohmert, K., , K., CamusCamus, I., , I., BelliniBellini, C., , C., BouchezBouchez, D., , D., CabocheCaboche, M., and , M., and BenningBenning, C. (1998) EMBO , C. (1998) EMBO J. Song, J.

J. Song, J.--J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and JoshuaJ., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua--TorTor, L. (2004) Science, L. (2004) Science

Białka ARGONAUTE wiążą sRNA i mRNA

A

A. . thaliana thaliana ago1 ago1

Nazwa ARGONAUTE pochodzi od mutanta

argonaute1 A. thaliana; który swoim kształtem przypomina ośmiornicę żeglarka

(Argonauta).

Argonauta Argonauta argo argo

PAZ

PIWI

N -te rm MID

(10)

10

Argonaute Argonaute

Białka ARGONAUTE wiążą sRNA i mRNA

PAZ

PIWI N -te rm MID

PAZ PAZ

oddzia

oddzia łuje z ko ł uje z koń ń cem 3’ cem 3 sRNA sRNA

MID MID ( (middle middle) )

oddzia

oddzia ł ł uje z nukleotydem uje z nukleotydem na ko

na koń ń cu 5’ cu 5 sRNA sRNA

PIWI PIWI

struktura podobna do

struktura podobna do RNazyH RNazyH

w niekt

w niektó órych bia rych biał łkach Ago: kach Ago:

ci ci ęcie RNA ę cie RNA zwiazanego zwiazanego z sRNA z sRNA

(slicer ( slicer activity) activity )

(11)

11 -

2 (Dicer + Drosha) 4

4 Homo sapiens

- 2 (Dicer + Drosha)

4 4

Danio rerio

- 3 (2 Dicers + Drosha) 3

2 Drosophila melanogaster

4 2 (Dicer + Drosha)

3 5

Caenorhabditis elegans Metazoa

Metazoa

2 1

- 1

Aspergillus nidulans

3 1

- 1

Neurospora crassa

1 1

- 1

Schizosaccharomyces pombe

- -

- -

Saccharomyces cerevisiae Fungi

Fungi

5 5

- 18

Oryza sativa

6 4 (DCL 1-4)

- 10 (AGO1-10) Arabidopsis thaliana

Plantae

PIWI PIWI Argonaute

Argonaute Dicer- Dicer -like like RdRP RdRP Argonaute

Argonaute- -PIWI PIWI -like - like Species

Species

Dicer

Dicer i i Argonaute Argonaute

u r u r ó ó ż ż nych organizm nych organizm ów ó w

(12)

12

U ro U ro ś ś lin w biogenezie miRNA lin w biogenezie miRNA i i siRNA siRNA uczestnicz

uczestniczą ą r r óż ó ż ne bia ne bia ł ł ka ka DCL DCL

Margis

Margis, R., , R., FusaroFusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J.,, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J.,and Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lettand Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lett. .

Ro

Roś śliny maj liny mają ą 4 (i wię 4 (i wi ęcej) bia cej) biał łek DCL: wi ek DCL: wię ększa ni ksza niż ż u innych u innych organizm

organizmó ów liczba bia w liczba biał łek DCL ek DCL umo u moż żliwia ro liwia roś ślinom bardziej linom bardziej precyzyjn

precyzyjną ą i i skuteczną skuteczn ą obronę obron ę przed patogenami przed patogenami. .

AtDCL1

AtDCL1 miRNA miRNA

AtDCL2

AtDCL2 - - 4 siRNA 4 siRNA

DCL4

DCL1

(13)

13

U ro U ro ś ś lin w biogenezie miRNA lin w biogenezie miRNA i i siRNA siRNA uczestnicz

uczestniczą ą r r óż ó ż ne bia ne bia ł ł ka ka DCL DCL

AtDCL1

AtDCL1 miRNA miRNA

AtDCL2

AtDCL2 - - 4 siRNA 4 siRNA

DCL4 DCL1

Arabidopsis

Arabidopsis thaliana thaliana: :

DCL1 → DCL1 21nt miRNA 21nt miRNA → → AGO1/7/10 AGO1/7/10

DCL2 → DCL2 22nt siRNA 22nt siRNA

••

DCL3 → DCL3 24nt siRNA 24nt siRNA → → AGO4/6 AGO4/6

••

DCL4 → DCL4 21nt siRNA 21nt siRNA ( (tasiRNA tasiRNA) ) → → AGO1 AGO1

Bologna

BolognaN.G., VoinnetN.G., VoinnetO.O.(20(201414) ) AnnuAnnu. . RevRev. Plant . Plant BiolBiol. .

(14)

14

siRNA

siRNA stra stra ż ż nicy nicy genomu genomu

ochrona

ochrona genomu genomu przed „ przed „obcym obcym” materiał materia łem em genetycznym (

genetycznym (exo exo- -siRNA siRNA): ):

transgenicznym transgenicznym wirusowym

wirusowym (VIGS ( VIGS – viral viral induced induced gene gene silencing silencing) )

endo- endo -siRNA siRNA: : wyciszanie

wyciszanie transpozon transpozonó ów w i sekwencji i sekwencji powt powt órzonych ó rzonych

utrzymywanie niekt

utrzymywanie niektó órych gen rych gen ów ó w

w stanie epigenetycznie nieaktywnym w stanie epigenetycznie nieaktywnym

Lam, E., Kato

Lam, E., Kato,, N., and Lawton, M. (2001N., and Lawton, M. (2001)). . NatureNature

(15)

15

Exo-siRNA: wyciszanie transgenów Exo-siRNA: wyciszanie transgenów

Transgeny

Transgeny wprowadzane sztucznie s wprowadzane sztucznie są ą czę cz ęsto wyciszane przez sto wyciszane przez siRNA siRNA

Wyciszenie mo

Wyciszenie moż ż e być e by ć wywoł wywo łane: ane:

• • bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu

• • dwuniciowym dwuniciowym RNA RNA pochodzą pochodz ą cym z ekspresji transgenu cym z ekspresji transgenu

• • nieprawidł nieprawid łowymi RNA pochodz owymi RNA pochodzą ą cymi z ekspresji transgenu cymi z ekspresji transgenu

Transgeny

Transgeny s ą wyciszane wyciszane post- post -trans transkrypcyjnie krypcyjnie i i transkrypcyjnie trans krypcyjnie

DCL

AGO AAAn

AGO

RNA Pol

siRNA -post-

AGO

transkrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów

RISC

RISC (RNA ( RNA- -induced induced silencing silencing complex) complex )

(16)

16

Post Post - - transkrypcyjne transkrypcyjne wyciszanie gen wyciszanie gen ó ó w u roś w u ro ś lin lin

t

transgene ransgene -induced post - induced post- -transcriptional silencing transcriptional silencing

Eksperymenty modyfikacji koloru kwiatów petunii (Petunia hybrida)

- odkrycie mechanizmu wyciszania genów

Martha Hawes, University of Arizona Martha Hawes, University of Arizona

kom komó órka ro rka roś ślinna linna

jądro komórkowe

DNA

Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens tumefaciens na powierzchni na powierzchni kom

komó órki ro rki roś ślinnej linnej

(17)

17

Manipulacja ekspresj

Manipulacja ekspresj ą ą genu genu syntazy syntazy chalkonowej chalkonowej : :

zmiana pigmentacji kwiat

zmiana pigmentacji kwiat ów petunii ó w petunii

Dzikie kwiaty petunii Dzikie kwiaty petunii zawieraj

zawieraj ą ą antocyjaniny antocyjaniny nadaj

nadaj ące purpurow ą ce purpurową ą barw barw ę ę

syntaza chalkonowa (CHS)

enzym szlaku biosyntezy antocyjanin

syntaza chalkonowa (CHS)

enzym szlaku biosyntezy antocyjanin

Aksamit

Aksamit--StachurskaStachurskaet al. BMC Biotechnology 2008et al. BMC Biotechnology 2008 Foto:

Foto: RichardRichardJorgensenJorgensen

antocyjaniny antocyjaniny

CHS CHS

(18)

18

Oczekiwanie

Oczekiwanie synteza RNA o prawid synteza RNA o prawid ł ł owej owej orientacji pog

orientacji pogłę łę bi barwę bi barw ę kwiat kwiat ów ó w... ...

PRO ORF

gen

mRNA

transgen

mRNA translacja

mRNA mRNA

dodatkowa translacja mRNA

konstrukt o orientacji „sens”

(19)

19

a synteza RNA o odwr a synteza RNA o odwr ó ó conej orientacji conej orientacji zablokuje syntez

zablokuje syntez ę ę barwnika barwnika

RNA RNA antysensowny antysensowny

transgen tworzenie dupleksó tworzenie dupleks ów RNA w RNA

„sens sens - - antysens antysens → → inhibicja inhibicja translacji

translacji

konstrukt o orientacji „sens”

PRO ORF

gen

mRNA

transgen

mRNA translacja translacja

mRNA mRNA

dodatkowa translacja dodatkowa translacja mRNA

konstrukt o orientacji „antysens”

(20)

20

Nieoczekiwanie, wprowadzenie zar

Nieoczekiwanie, wprowadzenie zar ó ó wno wno konstrukt

konstrukt ów ó w sens sens jak i jak i antysens antysens prowadzi prowadzi do inhibicji syntezy barwnika

do inhibicji syntezy barwnika

Foto:

Foto: RichardRichardJorgensenJorgensen

roś ro ś liny zawierają liny zawieraj ą ce ce transgen transgen CH CH S S

CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : S CH sens sens antysens antysens

lub lub

(21)

21

W modyfikowanych ro

W modyfikowanych roś ś linach nie dochodzi linach nie dochodzi do syntezy ani endogennej ani

do syntezy ani endogennej ani transgenicznej transgenicznej CHS CHS

Napoli

Napoli, C., , C., LemieuxLemieux, C., and Jorgensen, R, C., and Jorgensen, R..(1990) Plant Cell(1990) Plant Cell

transgeniczny RNA

endogenny RNA

purpurowe kwiaty

białe

kwiaty Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego

odpowiednika nazywamy

kosupresją

Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego

odpowiednika nazywamy

kosupresją

RNase

RNase protection protection

(22)

22

Kosupresja

Kosupresja jest wynikiem produkcji jest wynikiem produkcji siRNA siRNA

De Paoli, E., Dorantes

De Paoli, E., Dorantes--Acosta, A., Zhai, J., Acosta, A., Zhai, J., AccerbiAccerbi, M., , M., JeongJeong, D., D.--H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (20H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). RNA09). RNA

PRO ORF

typ dziki typ dziki

mRNA

mRNA

translacja translacja

gen gen

mRNA

konstrukt

konstrukt „sens sens”

roś ro ś lina lina transgeniczna transgeniczna kosupresja kosupresja

PRO ORF

gen gen mRNA

AGO AAA

A AGO AAAA AGO

produkcja produkcja

siRNA

siRNA

(23)

23

VIGS

VIGS - - viral viral induced induced gene gene silencing silencing

AGO1

Większość roślinnych wirusów to wirusy

RNA, których replikacja odbywa się

poprzez dsRNA

wirusowy ssRNA wirusowy dsRNA

DCL4

wirusowa polimeraza RNA

zależna od RNA

AGO1

dsRNA jest cięty przez DCL4 DCL 4powstają siRNA które wiążą się z AGO AGO1 1wyciszenie

replikacji wirusa

(24)

24

Waterhouse, P.M. and

Waterhouse, P.M. and FusaroFusaro, A.F. (2006) Science., A.F. (2006) Science.

Mutanty biogenezy

Mutanty biogenezy siRNAsiRNAsą mniej odporne na choroby wirusowesą mniej odporne na choroby wirusowe WT

WT Arabidopsis Arabidopsis inokulowany inokulowany TRVTRV

Podwójny

Podwójnymutant dcl2mutant dcl2--dcl4dcl4 inokulowany

inokulowanyTRVTRV Wyciszanie wirusa TRV

Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega

objawom choroby.

Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji.

Deleris

Deleris, A., , A., GallegoGallego--BartolomeBartolome, J., , J., BaoBao, J., , J., KasschauKasschau, K., Carrington, J.C., and , K., Carrington, J.C., and VoinnetVoinnet, O. (2006) Science, O. (2006) Science

VIGS

VIGS - - viral viral induced induced gene gene silencing silencing

Obrona przeciwwirusowa u roślin: głównie na poziomie wyciszania RNA

TRV: 21-nt (DCL4), 24-nt siRNA (DCL3) TCV (Turnip Crinkle Virus): 22-nt siRNA (DCL2) degradacja wirusowego RNA: 21-nt i 24-nt siRNA

(25)

25

Ma Ma ł ł e RNA komplementarne do wirusowego RNA e RNA komplementarne do wirusowego RNA są s ą obecne zaró obecne zar ó wno w liś wno w li ś ciach inokulowanych ciach inokulowanych, , jak i w m

jak i w mł łodszych odszych dystalnych dystalnych liś li ś ciach ciach

(ale nie w li

(ale nie w liś ściach kontrolnych) ciach kontrolnych)

liść li ść inokulowany inokulowany

Infekcja wirusowa powoduje akumulacj

Infekcja wirusowa powoduje akumulacj ę ę siRNA siRNA

dni po inokulacji

Northern Northernblotblot Hamilton, A.J., and

Hamilton, A.J., and BaulcombeBaulcombe, D.C. (1999), D.C. (1999)ScienceScience li

liśćść

inokulowany inokulowany

li liśćść dystalny dystalny

(26)

26

Infekcja wirusowa powoduje akumulacj

Infekcja wirusowa powoduje akumulacj ę ę siRNA siRNA

DCL

liść inokulowany

AGO

(27)

Sarkies

27

SarkiesP., Miska E.A. (2014) P., Miska E.A. (2014) NatNat. . RevRev. MCB. MCB

Sygna

Sygna ł ł wyciszaj wyciszaj ą ą cy mo cy mo ż ż e rozprzestrzenia e rozprzestrzenia ć ć si si ę ę w cał w ca łej ro ej roś ś linie poprzez floem linie poprzez floem

• • egzogenne siRNA egzogenne siRNA 21 i 24nt

21 i 24nt (PTGS) (PTGS) – wyciszanie

wyciszanie transgenu transgenu GFP GFP

• • endogenne 24nt endogenne 24nt siRNA siRNA

(TGS poprzez

(TGS poprzez remodelowanie remodelowanie chromatyny, pochodz

chromatyny, pochodzą ą z z transpozon

transpozonó ów w i innych i innych zmetylowanych

zmetylowanych rejonó rejon ów w genomu

genomu) )

• • miRNA m iRNA (PTGS) (PTGS) inokulowany liść wyciszenie

Voinnet

Voinnet, O., and , O., and BaulcombeBaulcombe, D. (1997) Nature, D. (1997) Nature

(28)

28

Mutanty biogenezy

Mutanty biogenezy siRNA siRNA s s ą ą mniej odporne mniej odporne na choroby wirusowe i

na choroby wirusowe i patogeny patogeny bakteryjne bakteryjne

Deleris

Deleris, A., , A., GallegoGallego--BartolomeBartolome, J., , J., BaoBao, J., , J., KasschauKasschau, K., Carrington, J.C., and , K., Carrington, J.C., and VoinnetVoinnet, O. (2006) Science, O. (2006) Science

WT WT Arabidopsis Arabidopsis inokulowany

inokulowany TRV TRV

Podw Podwó ójny jny mutant mutant

dcl2 dcl2- -dcl4 dcl4 inokulowany inokulowany TRV TRV

Wyciszanie wirusa TRV Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu)

w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby. Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji.

A. thaliana dzikiego typu (La-er) i mutanty biogenezy sRNA (dcl1-9 i hen1-1) inokulowane bakteriami Pseudomonas.

Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and

Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and VoinnetVoinnet, O. (2008) Science, O. (2008) Science

(29)

29

VIGS - podsumowanie

Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem

Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem siRNA siRNA jest ważnym jest ważnym mechanizmem obrony roślin przed

mechanizmem obrony roślin przed patogenami patogenami wirusami i bakteriami wirusami i bakteriami siRNA

siRNA hamują replikację hamują replikację wirusową wirusową u roślin u roślin (również u zwierząt (również u zwierząt - - Drosophila Drosophila melanogaster

melanogaster) )

siRNA

siRNA działają ogólnoustrojowo – działają ogólnoustrojowo u roślin mogą się przemieszczać u roślin mogą się przemieszczać poprzez wiązki przewodzące

poprzez wiązki przewodzące

Większość wirusów wytwarza białka

Większość wirusów wytwarza białka supresorowe supresorowe, hamujące szlak , hamujące szlak wyciszania

wyciszania

(30)

30

dsRNA

dsRNA najsilniejszy inicjator wyciszania najsilniejszy inicjator wyciszania

modyfikacje genetyczne nicienia

modyfikacje genetyczne nicienia C. C. elegans elegans: :

Fire, A. et al., (1998) Nature Fire, A. et al., (1998) Nature

RNA RNA sens sens

RNA RNA antysens

antysens ds dsRNA RNA

bez zmian bez zmian fenotypowych fenotypowych

fenotyp fenotyp twitching twitching Wprowadzanie do

organizmów nicieni Caenorhabditis elegans

RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA,

odpowiadających sekwencji genu unc-22,

kodującego

miofilamentowe białko komórek mięśniowych.

Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching)

Wprowadzanie do organizmów nicieni Caenorhabditis elegans

RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA,

odpowiadających sekwencji genu unc-22,

kodującego

miofilamentowe białko komórek mięśniowych.

Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching)

bez zmian bez zmian fenotypowych fenotypowych

Exo Exo - - siRNA siRNA u zwierz u zwierz ą ą t: t:

(31)

31

Exo Exo - - siRNA siRNA u zwierz u zwierz ą ą t: t:

U ssak

U ssakó ów i w i C. C. elegans elegans – – tylko jedno bia tylko jedno biał łko ko Dicer Dicer, odpowiada za biogenez , odpowiada za biogenezę ę zaró zar ó wno wno siRNA

siRNA, jak i , jak i miRNA miRNA

Drosophila

Drosophila melanogaster: melanogaster : Dcr1 Dcr1 – – miRNA miRNA

Dcr2 Dcr2 – – siRNA siRNA, ,

wią wi ązane przez zane przez AGO2 AGO2 obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa

egzogenny

egzogenny dsRNA dsRNA wirusowy

wirusowy dsRNA dsRNA

cię ci ę cie mRNA cie mRNA

obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa

Okamura

OkamuraK. & K. & LaiLaiE.C.E.C.(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol

(32)

32

Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany

przez amplifikacj

przez amplifikacj ę ę siRNA siRNA

DC L

2-rzędowy siRNA RdRP

DC L

1-rzędowy siRNA

Wyciszenie może się

rozprzestrzeniać poza miejsce infekcji wirusowej dzięki aktywności RdRP

(RNA-dependent RNA polymerase)

i biogenezie 2-rzędowych siRNA.

RdRP RdRP polimeraza polimeraza RNA zależ RNA zale żna od RNA na od RNA ( (RNA RNA- -dependent dependent RNA Polymerase RNA Polymerase) )

(33)

33

Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany

przez amplifikacj

przez amplifikacj ę ę siRNA siRNA

1 ° siRNA siRNA 1 ° siRNA siRNA

2 ° siRNA siRNA

2

° siRNA siRNA

Ghildiyal

Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet

‘primaryprimaryArgonauteArgonaute’

(34)

34

Endo Endo - - siRNA siRNA : :

Ghildiyal

Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet

(35)

35

Większość endogennych siRNA powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA

Większość endogennych siRNA powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA

Kasschau

Kasschau, K.D., , K.D., FahlgrenFahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., , N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., CumbieCumbie, J.S., , J.S., GivanGivan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) , S.A., and Carrington, J.C. (2007) PLoSPLoSBiolBiol

Większość siRNA w komórce pochodzi z sekwencji transpozonowych

i powtórzonych. U Arabidopsis thaliana duże zagęszczenie tego typu sekwencji występuje w rejonach centromerowych chromosomów.

ma

mał łe e RNA RNA

t transpo ranspoz zon ony y retrotranspo retrotranspozony zony

Chromosom Chromosom

Centromer Centromer

Wysoko

Wysoko--przepustowe przepustowe sekwencjonowaniesekwencjonowaniemamałłych RNAych RNA

(36)

36

Endo Endo - - siRNA siRNA u roślin u roślin : :

Ghildiyal

Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet

cis

cis- -acting acting siRNA siRNA

(

(casiRNAcasiRNA, , hchc--siRNAsiRNA))

trans

trans- -acting acting siRNA siRNA

(

(tasiRNAtasiRNA))

natural

natural antisense antisense siRNA siRNA

(

(natsiRNAnatsiRNA))

(37)

37

tasiRNA

tasiRNA : roś : ro ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA

gen TAS

RNA Pol II

AGO

RDR6

transkrypcja locus TAS przez polimerazę RNA II

wiązanie przez miRNA i cięcie

synteza drugiej nici RNA

przez RDR6 (RNA-dependent RNA polymerase)

tasiRNA

tasiRNA trans trans - - acting acting siRNA siRNA

• • specyficzne dla roś specyficzne dla ro ś lin lin

• • kodowane przez geny kodowane przez geny TAS TAS

• • obró obr óbka pierwotnego bka pierwotnego transkryptu transkryptu jest inicjowana przez jest inicjowana przez miRNA miRNA

rekrutacja RDR6

(38)

38

biogeneza

biogeneza tasiRNA tasiRNA c.d. c.d.

dsRNA jest cięty przez DCL4 na serię krótszych dsRNA,

uwalniając wiele cząsteczek

tasiRNA z jednego genu TAS.

(39)

39

Z jednego genu

Z jednego genu TAS TAS powstaje wiele cz

powstaje wiele czą ą steczek steczek tasiRNA tasiRNA

Allen, E.,

Allen, E., XieXie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell

↑ ↑

miejsce cięcia pierwotnego transkryptu przy

udziale miRNA

kluczowe dla zapewnienia

specyficzności tasiRNA;

DCL4 zaczyna ciąć prekursor dokładnie w tym miejscu i tnie

w odstępach 21nt

tasiRNA mogą powstawać z obu nici RNA

DCL4

DCL4 przesuwa przesuwa si si ę ę wzdł wzd łu u ż ż

dsRNA dsRNA, , odmierzaj odmierzają ąc c

i tną i tn ąc c

(40)

40

Mutacje rdr6 i zip, Mutacje rdr6 i zip,

podobnie jak

podobnie jak dcl4 dcl4 i i tas3, tas3,

przyspieszaj

przyspieszają ą zmiany zmiany rozwojowe rozwojowe

przyspieszone przej

przyspieszone przejśście z fazy juwenilnej cie z fazy juwenilnej do doros

do dorosłłej: wydej: wydłłużone lione liśście, wywinicie, wywinięęte te pod sp

pod spóód brzegi blaszek lid brzegi blaszek liśściowychciowych

Zaburzenia biogenezy

Zaburzenia biogenezy tasiRNA tasiRNA

→ → zaburzenia rozwoju zaburzenia rozwoju

Fahlgren

Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., A, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) lexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) CurrCurr. Biol. . Biol.

mutacja rdr6-15:

brak tasiRNA

zip-1 (AGO7):

brak TAS3 tasiRNA

Northern Northern

Arabidopsis

Arabidopsis 4 rodziny genó 4 rodziny gen ów w TAS TAS

•TAS1 • TAS1 i i TAS2 TAS2 tasiRNA tasiRNA – – PPR PPR

•TAS3 • TAS3 tasiRNA tasiRNA – – czynniki transkrypcyjne czynniki transkrypcyjne ARF ARF

•TAS4 • TAS4 tasiRNAs tasiRNAs – – czynniki czynniki transkrypcyjne transkrypcyjne MYB MYB

(41)

41

natsiRNA

natsiRNA : ro : ro ś ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA

Wg Wg KatiyarKatiyar--AgarwalAgarwal, S., Morgan, R., , S., Morgan, R., DahlbeckDahlbeck, D., , D., BorsaniBorsani, O., Villegas , O., Villegas JrJr. A., Zhu, J.. A., Zhu, J.--K., K., StaskawiczStaskawicz, B.J., and Jin, H. (2006), B.J., and Jin, H. (2006)Proc. Proc. NatlNatl. Acad. . Acad. SciSci. USA. USA

natsiRNA n atsiRNA natural n atural antisense antisense -transcript - transcript derived derived siRNA siRNA cis- cis - acting acting

pochodz

pochodzą ą z zachodzą z zachodz ą cych na siebie transkrypt cych na siebie transkryptó ów w genó gen ów zwi w zwią ą zanych ze stresem zanych ze stresem

AGO AGO

zachodz

zachodzą ące na siebie sekwencje ce na siebie sekwencje s ąsiaduj siadują ą cych genó cych gen ów w

komplementarne wzgl

komplementarne wzglę ę dem dem siebie

siebie transkrypty transkrypty NAT NAT

(natural ( natural antisense) antisense )

tworz

tworzą ą dsRNA dsRNA

wyciszenie

wyciszenie

(42)

42

natsiRNA

natsiRNA : ro : ro ś ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA

syntetyzowane w odpowiedzi na stres syntetyzowane w odpowiedzi na stres np. wysokie zasolenie gleby

np. wysokie zasolenie gleby

biogeneza:

biogeneza:

DCL2 i/lub DCL1, DCL2 i/lub DCL1, RDR6 (

RDR6 ( polimeraza polimeraza RNA zależ RNA zale żna od RNA na od RNA ), ), SGS3 (

SGS3 ( bia biał łko wi ko wiążą ążące RNA ce RNA ) ) i polimeraza i polimeraza RNA IV RNA IV

24 nt 24 nt natsiRNA natsiRNA cię ci ęcie jednej z cie jednej z cząsteczek

cząsteczek mRNA mRNA, druga s , druga sł łu u ż ży jako y jako matryca do syntezy 2

matryca do syntezy 2- -rz rz ędowych 21nt ę dowych 21nt natsiRNA

natsiRNA przez RDR6 przez RDR6 i DCL1 i DCL1

A.

A. thaliana thaliana: : lsiRNA lsiRNA (long ( long siRNA) siRNA ) 30- 30 -40nt 40nt

r ównie wnież ż powstają powstaj ą z transkrypt z transkryptó ów w NAT NAT inne bia

inne biał łka uczestnicz ka uczestniczą ą w biogenezie w biogenezie

Ghildiyal

Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet

(43)

43

Ro Ro ś ś linne linne polimerazy polimerazy RNA RNA

enzym występowanie funkcja

Polimeraza RNA I wszystkie Eucaryota synteza rRNA

Polimeraza RNA II wszystkie Eucaryota synteza mRNA, microRNA Polimeraza RNA III wszystkie Eucaryota synteza tRNA, 5S rRNA

Polimeraza RNA IV rośliny biogeneza siRNA

Polimeraza RNA V rośliny rekrutacja białek AGO do DNA

DNA RNA

polimeraza RNA

(44)

44

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS):

hc-siRNA

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS):

hc-siRNA

mał ma łe e RNA RNA mogą mog ą hamować hamowa ć transkrypcję transkrypcj ę okreś okre ś lonych lonych genó gen ó w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub biał bia ł ek histonowych ek histonowych

transkrypcja transkrypcja

Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając

rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach.

Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając

rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach.

DNA DNA bia

biał łka ka histonowe histonowe

wyciszenie

wyciszenie

(45)

45

Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.

CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG

TGS u roślin odkryto podczas doświadczeń

mających na celu wprowadzenie więcej niż

jednej modyfikacji genetycznej poprzez

krzyżowanie roślin ekspresja genu oporności

na kanamycynę

ekspresja genu oporności na higromycynę

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

(46)

46

CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG

x

oczekiwane wyniki:

selekcja na kanamycynie: 50% Kan R

selekcja na higromycynie: 50% Hyg R

selekcja na Kan + Hyg: 25% Kan R and Hyg R

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.

(47)

47

CaMV 35S pro : HYG

W niektórych przypadkach jeden z

wprowadzonych genów był wyciszany

w roślinach potomnych mających

obie modyfikacje

obserwowane wyniki:

selekcja na kanamycynie: 50% Kan R

selekcja na higromycynie: 0% Hyg R

selekcja na Kan + Hyg: 0% Kan R and Hyg R CaMV 35S pro : KAN

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.

(48)

48

CaMV 35S pro : HYG

CaMV 35S pro : HYG

DNA w rejonie promotora wyciszonego genu jest metylowane

CaMV 35S pro : HYG

metylacja metylacja DNA DNA

CaMV 35S pro : KAN

W niektórych przypadkach jeden z

wprowadzonych genów był wyciszany

w roślinach potomnych mających

obie modyfikacje

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.

(49)

49

siRNA

siRNA mogą mog ą wyciszać wycisza ć DNA za po DNA za po ś ś rednictwem rednictwem enzym

enzymó ów w metyluj metylują ących cych cytozyny cytozyny lub modyfikuj

lub modyfikują ą cych bia cych bia ł ł ka ka histonowe histonowe

O N

NH

2

N

~

O N

N NH

2

~

CH3

cytozyna 5-metylocytozyna

m et ylo tra ns fe ra za

DNA może być kowalencyjnie modyfikowany w reakcji

metylacji cytozyny

metylacja metylacja

DNA DNA

W mechanizm

W mechanizm transkrypcyjnego transkrypcyjnego wyciszania wyciszania DNA przez

DNA przez siRNA siRNA zaangaż zaanga ż owane są owane s ą dwie dwie specyficzne dla ro

specyficzne dla roś ś lin lin polimerazy polimerazy RNA: RNA:

Pol Pol IV IV i Pol i Pol V V

AGO

metylotransferaza

DNA

modyfikacja modyfikacja

histon

histonó ów w

(50)

50

Polimerazy

Polimerazy RNA IV i V uczestnicz RNA IV i V uczestnicz ą ą

w w transkrypcyjnym transkrypcyjnym wyciszaniu gen wyciszaniu gen ó ó w w

Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie siRNA.

Niekodujące transkrypty

polimerazy RNA V nakierowują

maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA.

RNA Pol IV

RNA Pol V

modyfikacja modyfikacja

histon histonó ów w

metylacja metylacja

DNA DNA

(51)

51

Polimerazy

Polimerazy RNA IV i V uczestnicz RNA IV i V uczestnicz ą ą

w w transkrypcyjnym transkrypcyjnym wyciszaniu gen wyciszaniu gen ó ó w w

Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie siRNA.

Niekodujące transkrypty

polimerazy RNA V nakierowują

maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA.

HaagHaagJ.R., J.R., PikaardPikaardC.S.,C.S.,(20(201111) ) NatNatRevRevMol Mol CellCellBiolBiol

(52)

52

siRNA - podsumowanie

Szlak

Szlak siRNA siRNA wycisza egzogenny, „obcy” DNA, wycisza egzogenny, „obcy” DNA, transpozony transpozony oraz oraz sekwencje powtórzone

sekwencje powtórzone siRNA

siRNA powstają dzięki aktywności białek typu Dicer powstają dzięki aktywności białek typu Dicer, które tną , które tną dsRNA dsRNA siRNA

siRNA są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy wyciszające (RISC)

wyciszające (RISC)

Kompleksy wyciszające mogą działać

Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie, poprzez cięcie potranskrypcyjnie , poprzez cięcie mRNA mRNA lub inhibicję translacji lub inhibicję translacji

Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez

metylację

metylację DNA lub modyfikację białek histonowych DNA lub modyfikację białek histonowych

(53)

53

microRNA - miRNA microRNA - miRNA

• • uważa się, że miRNA uważa się, że miRNA wyewoluowały z wyewoluowały z siRNA siRNA powstają i dojrzewają powstają i dojrzewają w podobny (do pewnego stopnia) sposób

w podobny (do pewnego stopnia) sposób

• • miRNA miRNA są kodowane przez specyficzne geny są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale wpływają na MIR , ale wpływają na ekspresję innych genów

ekspresję innych genów są cząsteczkami regulatorowymi są cząsteczkami regulatorowymi działającymi

działającymi in in trans trans

• • miRNA miRNA u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe i fizjologiczne

i fizjologiczne

(54)

54

AAAn

RNA Pol II

microRNA działaja poprzez cięcie mRNA lub inhibicję translacji

DCL

gen gen MIR MIR

RNA Pol II

mRNA

AAAn

AGO

AGO

AAAn

AGO

AAAn

Inhibicja Inhibicja translacji translacji

ci cię ęcie cie mRNA mRNA

microRNA - miRNA

microRNA - miRNA

(55)

55

microRNA - miRNA microRNA - miRNA

aktywna aktywna translacja translacja

inhibicja inhibicja inicjacji inicjacji translacji translacji

inhibicja inhibicja translacji translacji

degradacja degradacja

mRNA mRNA

Stefani

StefaniG., G., SlackSlackF. J.,F. J.,(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol

(56)

56

microRNA - miRNA microRNA - miRNA

aktywna aktywna translacja translacja

degradacja degradacja

mRNA mRNA

Stefani

StefaniG., G., SlackSlackF. J.,F. J.,(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol

(57)

57 Step 1.

Step 1. Initial effect of miRNAs Initial effect of miRNAs: inhibition of translation at the initiation step without mRNA : inhibition of translation at the initiation step without mRNA decay.

decay.

Step 2.

Step 2. mRNA deadenylation mRNA deadenylation by PAN2– by PAN2 PAN3 and CCR4– PAN3 and CCR4 NOT complexes recruited by NOT complexes recruited by miRISC

miRISC as a consequence of translation inhibition that makes as a consequence of translation inhibition that makes poly(A poly(A) tail more accessible. ) tail more accessible.

Step3.

Step3. Stimulated deadenylation Stimulated deadenylation potentiates potentiates the effect on translational inhibition and lead the effect on translational inhibition and leads s to decay of target mRNAs through the recruitment of the

to decay of target mRNAs through the recruitment of the decapping decapping machinery machinery. .

Destabilization of target Destabilization of target mRNA is the predominant mRNA is the predominant reason for reduced protein reason for reduced protein output.

output.

(58)

58

Geny Geny MIR MIR : transkrypcja dł : transkrypcja d ł ugich cz ugich cz ą ą steczek steczek pri pri - - mi mi RNA RNA z kt z kt ó ó rych powstaj rych powstaj ą ą miRNA miRNA

miRNA są kodowane przez geny MIR

pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są

rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)

nić miRNA* jest degradowana

miRNA są kodowane przez geny MIR

pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są

rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)

nić miRNA* jest degradowana

3'

5'

miRNA

miRNA*

3'

5'

pri-miRNA

miRNA

MIR gene

mRNA target

DCL1

Cytaty

Powiązane dokumenty

Modulacja ilości mRNA VEGFA przez miR-429 nie wynikała z bezpośredniego wiązania tego miRNA i była kon- sekwencją jego wpływu na poziom HIF-1.. Potencjalne sekwencje docelowe dla

Dodatkowe wyposażenie z możliwością dostarczenia do każdej z sal: monitor interaktywny dotykowy 65'' Newline 4K, z soundbarem z wbudowaną kamerą 4K

PSN1 Tworzenie strategii rozwoju społeczno- gospodarczego Sala Konferencyjna Parku Wodnego w Suchym Lesie mgr

UAM

Atopic dermatitis patients with an increased expression of miR-203 in serum showed a de- creased expression of miR-203 in urine, which also was associated with a higher level of

We wrześniu ubie- głego roku IUCN po raz pierwszy opublikowała listę zagrożonych europejskich gatunków drzew i krze- wów (European Red List of Trees) [24], w której eks-

„rozluźnienia” naturalnych więzi Pana Jezusa z Jego własnym narodem, w tym również z cielesną rodziną. Ale stwarza też Jego uczniom możliwość wstąpienia z Nim w

To determine the relationship between the serum concentrations of selected miRNAs (miRNA-21, miR- NA-10b and miRNA-200c) and the ER, PR and HER2 status of the breast cancer