Małe RNA Małe RNA
Monika
Monika Zakrzewska Zakrzewska- -Płaczek Płaczek
monika.z@ibb.waw.pl
monika.z@ibb.waw.pl
2
Małe RNA (small RNAs, sRNAs) Małe RNA (small RNAs, sRNAs)
sRNA – 21-30 nt
wyciszanie ekspresji genów:
(gene silencing, RNA silencing)
• post-transkrypcyjne wyciszanie genów
(post-transcriptional gene silencing, PTGS)
degradacja mRNA, inhibicja translacji
• transkrypcyjne wyciszanie genów
(transcriptional gene silencing, TGS)
epigenetyczne modyfikacje chromatyny
AAAAA
RNA Pol modyfikacja
modyfikacja histon histonó ów w, , metylacja metylacja DNA DNA
3
mirtrony – pochodzące z intronów prekursorów mRNA genów kodujących białka; występują u zwierząt; niezależne od Drosha
Regulacja post- transkrypcyjna TAS RNA cięte przez
miRNA DCL4
21nt rośliny
tasiRNA
(trans-acting siRNA)
Regulacja genów odpowiedzi na stres Transkrypcja
dwukierunkowa indukowana stresem DCL2
DCL1 24nt
rośliny 21nt natsiRNA
(natural antisense transcripts-derived siRNA)
siRNA
(small interferring RNA) – większość działa in cis, za wyjątkiem tasiRNA
Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów Transkrypcja
dwukierunkowa lub
zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami
pseudogenów o przeciwnej orientacji Dicer
~21nt rośliny,
grzyby, zwierzęta, Protista endo-siRNA
(pochodzenia endogennego)
Post-transkrypcyjna
regulacja ekspresji genów, obrona przeciwwirusowa Transgeniczny, wirusowy
lub inny egzogenny RNA Dicer
21-24nt rośliny,
grzyby, zwierzęta, Protista exo-siRNA
(pochodzenia egzogennego)
Regulacja stabilności mRNA (cięcie mRNA), inhibicja translacji
Transkrypcja przez Pol II/Pol III Drosha
(u zwierząt)
+ Dicer 20–25nt
rośliny, zwierzęta, wirusy, Protista
miRNA
(microRNA)
PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów
Klasy ma
Klasy mał łych RNA: ych RNA:
4
Modyfikacja chromatyny Transpozony, powtórzenia
DCL3 24-26nt
rośliny, S. pombe hc-siRNA
(heterochromatic siRNA)
siRNA
(small interferring RNA)
Regulacja aktywności transpozonów, inne nieznane funkcje Długie pierwotne
transkrypty (?) niezależne
od Dicer 24–30nt
Drosophila, C. elegans, ssaki, Danio rerio
piRNA
(Piwi-interacting RNA)
Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów Transkrypcja
dwukierunkowa lub
zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami
pseudogenów o przeciwnej orientacji Dicer
~21nt rośliny,
grzyby, zwierzęta, Protista endo-siRNA
(pochodzenia endogennego)
TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów
Klasy ma
Klasy mał łych RNA: ych RNA:
5
Bia Bia łka ł ka Dicer Dicer i i Argonaute Argonaute (AGO): (AGO):
g g łó ł ówne elementy szlaku wyciszania RNA wne elementy szlaku wyciszania RNA
Dwuniciowy
Dwuniciowy RNA RNA
(double ( double- -stranded RNA stranded RNA, , dsRNA dsRNA) )
jest ci
jest ci ę ę ty przez ty przez Dicer Dicer na kr
na kr ó ó tkie tkie dwuniciowe dwuniciowe cz cz ą ą steczki RNA, steczki RNA,
kt kt ó ó re s re s ą ą wi wi ą ą zane zane przez jedno z bia
przez jedno z bia ł ł ek ek rodziny
rodziny ARGONAUTE ARGONAUTE . .
DICER
AGO
wyciszenie
6
Wyciszanie ekspresji gen
Wyciszanie ekspresji gen ów ó w
DCL
MIR gene
RNA Pol
AGO AAAn AAAn
RNA Pol
miRNA -
inhibicja translacji, cięcie mRNA
AAAn
mRNA
AGO
DCL
AGO AAAn
AGO
RNA Pol
siRNA -post-
AGOtranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów
AGO
AAAn
7
PAZ
RIII
RIII
MacRae
MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., , I.J., Zhou, K., Li, F., RepicRepic, A., Brooks, A.N., , A., Brooks, A.N., CandeCande, W.., Adams, P.D., and , W.., Adams, P.D., and DoudnaDoudna, J.A. (2006) Science, J.A. (2006) Science
Podczas biogenezy siRNA i miRNA,
białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o strukturze spinki
(hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.
Podczas biogenezy siRNA i miRNA,
białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o strukturze spinki
(hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.
Struktura bia
Struktura biał łka ka Dicer Dicer umo umoż żliwia r liwia ró ównomierne rozcinanie wnomierne rozcinanie RNA RNA na fragmenty o takiej samej d
na fragmenty o takiej samej dł ługo ugoś ści. ci.
Dicer
Dicer i i Dicer Dicer - - like like
8
PAZ
RIII
RIII
Dicer
Dicer i i Dicer Dicer - - like like
2 domeny typu 2 domeny typu
RNazy RNazy III III
aktywno
aktywność ść endonukleolityczna endonukleolityczna 5’ 5 ’P / 3 P / 3’ ’OH OH
PAZ PAZ
konserw
konserw owana owana domena domena wiążą wi ążą ca dsRNA ca dsRNA
(
(dsRBD dsRBD- - dsRNA dsRNA- -binding binding domain) domain ) oddzia
oddzia łuje z ko ł uje z koń ń cem 3’ cem 3 ’ dsRNA dsRNA
MacRae
MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., , I.J., Zhou, K., Li, F., RepicRepic, A., Brooks, A.N., , A., Brooks, A.N., CandeCande, W.., Adams, P.D., and , W.., Adams, P.D., and DoudnaDoudna, J.A. (2006) Science, J.A. (2006) Science
9
Argonaute Argonaute
Bohmert
Bohmert, K., , K., CamusCamus, I., , I., BelliniBellini, C., , C., BouchezBouchez, D., , D., CabocheCaboche, M., and , M., and BenningBenning, C. (1998) EMBO , C. (1998) EMBO J. Song, J.
J. Song, J.--J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and JoshuaJ., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua--TorTor, L. (2004) Science, L. (2004) Science
Białka ARGONAUTE wiążą sRNA i mRNA
A
A. . thaliana thaliana ago1 ago1
Nazwa ARGONAUTE pochodzi od mutanta
argonaute1 A. thaliana; który swoim kształtem przypomina ośmiornicę żeglarka
(Argonauta).
Argonauta Argonauta argo argo
PAZ
PIWI
N -te rm MID
10
Argonaute Argonaute
Białka ARGONAUTE wiążą sRNA i mRNA
PAZ
PIWI N -te rm MID
PAZ PAZ
oddzia
oddzia łuje z ko ł uje z koń ń cem 3’ cem 3 ’ sRNA sRNA
MID MID ( (middle middle) )
oddzia
oddzia ł ł uje z nukleotydem uje z nukleotydem na ko
na koń ń cu 5’ cu 5 ’ sRNA sRNA
PIWI PIWI
struktura podobna do
struktura podobna do RNazyH RNazyH
w niekt
w niektó órych bia rych biał łkach Ago: kach Ago:
ci ci ęcie RNA ę cie RNA zwiazanego zwiazanego z sRNA z sRNA
(slicer ( slicer activity) activity )
11 -
2 (Dicer + Drosha) 4
4 Homo sapiens
- 2 (Dicer + Drosha)
4 4
Danio rerio
- 3 (2 Dicers + Drosha) 3
2 Drosophila melanogaster
4 2 (Dicer + Drosha)
3 5
Caenorhabditis elegans Metazoa
Metazoa
2 1
- 1
Aspergillus nidulans
3 1
- 1
Neurospora crassa
1 1
- 1
Schizosaccharomyces pombe
- -
- -
Saccharomyces cerevisiae Fungi
Fungi
5 5
- 18
Oryza sativa
6 4 (DCL 1-4)
- 10 (AGO1-10) Arabidopsis thaliana
Plantae
PIWI PIWI Argonaute
Argonaute Dicer- Dicer -like like RdRP RdRP Argonaute
Argonaute- -PIWI PIWI -like - like Species
Species
Dicer
Dicer i i Argonaute Argonaute
u r u r ó ó ż ż nych organizm nych organizm ów ó w
12
U ro U ro ś ś lin w biogenezie miRNA lin w biogenezie miRNA i i siRNA siRNA uczestnicz
uczestniczą ą r r óż ó ż ne bia ne bia ł ł ka ka DCL DCL
Margis
Margis, R., , R., FusaroFusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J.,, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J.,and Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lettand Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lett. .
Ro
Roś śliny maj liny mają ą 4 (i wię 4 (i wi ęcej) bia cej) biał łek DCL: wi ek DCL: wię ększa ni ksza niż ż u innych u innych organizm
organizmó ów liczba bia w liczba biał łek DCL ek DCL umo u moż żliwia ro liwia roś ślinom bardziej linom bardziej precyzyjn
precyzyjną ą i i skuteczną skuteczn ą obronę obron ę przed patogenami przed patogenami. .
AtDCL1
AtDCL1 miRNA miRNA
AtDCL2
AtDCL2 - - 4 siRNA 4 siRNA
DCL4
DCL1
13
U ro U ro ś ś lin w biogenezie miRNA lin w biogenezie miRNA i i siRNA siRNA uczestnicz
uczestniczą ą r r óż ó ż ne bia ne bia ł ł ka ka DCL DCL
AtDCL1
AtDCL1 miRNA miRNA
AtDCL2
AtDCL2 - - 4 siRNA 4 siRNA
DCL4 DCL1
Arabidopsis
Arabidopsis thaliana thaliana: :
•
•
DCL1 → DCL1 → 21nt miRNA 21nt miRNA → → AGO1/7/10 AGO1/7/10
•
•
DCL2 → DCL2 → 22nt siRNA 22nt siRNA
••
DCL3 → DCL3 → 24nt siRNA 24nt siRNA → → AGO4/6 AGO4/6
••
DCL4 → DCL4 → 21nt siRNA 21nt siRNA ( (tasiRNA tasiRNA) ) → → AGO1 AGO1
Bologna
BolognaN.G., VoinnetN.G., VoinnetO.O.(20(201414) ) AnnuAnnu. . RevRev. Plant . Plant BiolBiol. .
14
siRNA
siRNA – – stra stra ż ż nicy nicy genomu genomu
ochrona
ochrona genomu genomu przed „ przed „obcym obcym” ” materiał materia łem em genetycznym (
genetycznym (exo exo- -siRNA siRNA): ):
transgenicznym transgenicznym wirusowym
wirusowym (VIGS ( VIGS – – viral viral induced induced gene gene silencing silencing) )
endo- endo -siRNA siRNA: : wyciszanie
wyciszanie transpozon transpozonó ów w i sekwencji i sekwencji powt powt órzonych ó rzonych
utrzymywanie niekt
utrzymywanie niektó órych gen rych gen ów ó w
w stanie epigenetycznie nieaktywnym w stanie epigenetycznie nieaktywnym
Lam, E., Kato
Lam, E., Kato,, N., and Lawton, M. (2001N., and Lawton, M. (2001)). . NatureNature
15
Exo-siRNA: wyciszanie transgenów Exo-siRNA: wyciszanie transgenów
Transgeny
Transgeny wprowadzane sztucznie s wprowadzane sztucznie są ą czę cz ęsto wyciszane przez sto wyciszane przez siRNA siRNA
Wyciszenie mo
Wyciszenie moż ż e być e by ć wywoł wywo łane: ane:
• • bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu
• • dwuniciowym dwuniciowym RNA RNA pochodzą pochodz ą cym z ekspresji transgenu cym z ekspresji transgenu
• • nieprawidł nieprawid łowymi RNA pochodz owymi RNA pochodzą ą cymi z ekspresji transgenu cymi z ekspresji transgenu
Transgeny
Transgeny s są ą wyciszane wyciszane post- post -trans transkrypcyjnie krypcyjnie i i transkrypcyjnie trans krypcyjnie
DCL
AGO AAAn
AGO
RNA Pol
siRNA -post-
AGOtranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów
RISC
RISC (RNA ( RNA- -induced induced silencing silencing complex) complex )
16
Post Post - - transkrypcyjne transkrypcyjne wyciszanie gen wyciszanie gen ó ó w u roś w u ro ś lin lin
t
transgene ransgene -induced post - induced post- -transcriptional silencing transcriptional silencing
Eksperymenty modyfikacji koloru kwiatów petunii (Petunia hybrida)
- odkrycie mechanizmu wyciszania genów
Martha Hawes, University of Arizona Martha Hawes, University of Arizona
kom komó órka ro rka roś ślinna linna
jądro komórkowe
DNA
Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens tumefaciens na powierzchni na powierzchni kom
komó órki ro rki roś ślinnej linnej
17
Manipulacja ekspresj
Manipulacja ekspresj ą ą genu genu syntazy syntazy chalkonowej chalkonowej : :
zmiana pigmentacji kwiat
zmiana pigmentacji kwiat ów petunii ó w petunii
Dzikie kwiaty petunii Dzikie kwiaty petunii zawieraj
zawieraj ą ą antocyjaniny antocyjaniny nadaj
nadaj ące purpurow ą ce purpurową ą barw barw ę ę
syntaza chalkonowa (CHS)
enzym szlaku biosyntezy antocyjanin
syntaza chalkonowa (CHS)
enzym szlaku biosyntezy antocyjanin
Aksamit
Aksamit--StachurskaStachurskaet al. BMC Biotechnology 2008et al. BMC Biotechnology 2008 Foto:
Foto: RichardRichardJorgensenJorgensen
antocyjaniny antocyjaniny
CHS CHS
18
Oczekiwanie
Oczekiwanie – – synteza RNA o prawid synteza RNA o prawid ł ł owej owej orientacji pog
orientacji pogłę łę bi barwę bi barw ę kwiat kwiat ów ó w... ...
PRO ORF
gen
mRNA
transgen
mRNA translacja
mRNA mRNA
dodatkowa translacja mRNA
konstrukt o orientacji „sens”
19
… … a synteza RNA o odwr a synteza RNA o odwr ó ó conej orientacji conej orientacji zablokuje syntez
zablokuje syntez ę ę barwnika barwnika
RNA RNA antysensowny antysensowny
transgen tworzenie dupleksó tworzenie dupleks ów RNA w RNA
„sens „ sens - - antysens antysens ” ” → → inhibicja inhibicja translacji
translacji
konstrukt o orientacji „sens”
PRO ORF
gen
mRNA
transgen
mRNA translacja translacja
mRNA mRNA
dodatkowa translacja dodatkowa translacja mRNA
konstrukt o orientacji „antysens”
20
Nieoczekiwanie, wprowadzenie zar
Nieoczekiwanie, wprowadzenie zar ó ó wno wno konstrukt
konstrukt ów ó w sens sens jak i jak i antysens antysens prowadzi prowadzi do inhibicji syntezy barwnika
do inhibicji syntezy barwnika
Foto:
Foto: RichardRichardJorgensenJorgensen
roś ro ś liny zawierają liny zawieraj ą ce ce transgen transgen CH CH S S
CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : S CH sens sens antysens antysens
lub lub
21
W modyfikowanych ro
W modyfikowanych roś ś linach nie dochodzi linach nie dochodzi do syntezy ani endogennej ani
do syntezy ani endogennej ani transgenicznej transgenicznej CHS CHS
Napoli
Napoli, C., , C., LemieuxLemieux, C., and Jorgensen, R, C., and Jorgensen, R..(1990) Plant Cell(1990) Plant Cell
transgeniczny RNA
endogenny RNA
purpurowe kwiaty
białe
kwiaty Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego
odpowiednika nazywamy
kosupresją
Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego
odpowiednika nazywamy
kosupresją
RNase
RNase protection protection
22
Kosupresja
Kosupresja jest wynikiem produkcji jest wynikiem produkcji siRNA siRNA
De Paoli, E., Dorantes
De Paoli, E., Dorantes--Acosta, A., Zhai, J., Acosta, A., Zhai, J., AccerbiAccerbi, M., , M., JeongJeong, D., D.--H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (20H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). RNA09). RNA
PRO ORF
typ dziki typ dziki
mRNA
mRNA
translacja translacja
gen gen
mRNA
konstrukt
konstrukt „sens „ sens” ”
roś ro ś lina lina transgeniczna transgeniczna kosupresja kosupresja
PRO ORF
gen gen mRNA
AGO AAAA AGO AAAA AGO
produkcja produkcja
siRNA
siRNA
23
VIGS
VIGS - - viral viral induced induced gene gene silencing silencing
AGO1
Większość roślinnych wirusów to wirusy
RNA, których replikacja odbywa się
poprzez dsRNA
wirusowy ssRNA wirusowy dsRNA
DCL4wirusowa polimeraza RNA
zależna od RNA
AGO1
dsRNA jest cięty przez DCL4 DCL 4 → powstają siRNA które wiążą się z AGO AGO1 1 → wyciszenie
replikacji wirusa
24
Waterhouse, P.M. and
Waterhouse, P.M. and FusaroFusaro, A.F. (2006) Science., A.F. (2006) Science.
Mutanty biogenezy
Mutanty biogenezy siRNAsiRNAsą mniej odporne na choroby wirusowesą mniej odporne na choroby wirusowe WT
WT Arabidopsis Arabidopsis inokulowany inokulowany TRVTRV
Podwójny
Podwójnymutant dcl2mutant dcl2--dcl4dcl4 inokulowany
inokulowanyTRVTRV Wyciszanie wirusa TRV
Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega
objawom choroby.
Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji.
Deleris
Deleris, A., , A., GallegoGallego--BartolomeBartolome, J., , J., BaoBao, J., , J., KasschauKasschau, K., Carrington, J.C., and , K., Carrington, J.C., and VoinnetVoinnet, O. (2006) Science, O. (2006) Science
VIGS
VIGS - - viral viral induced induced gene gene silencing silencing
Obrona przeciwwirusowa u roślin: głównie na poziomie wyciszania RNA
TRV: 21-nt (DCL4), 24-nt siRNA (DCL3) TCV (Turnip Crinkle Virus): 22-nt siRNA (DCL2) degradacja wirusowego RNA: 21-nt i 24-nt siRNA
25
Ma Ma ł ł e RNA komplementarne do wirusowego RNA e RNA komplementarne do wirusowego RNA są s ą obecne zaró obecne zar ó wno w liś wno w li ś ciach inokulowanych ciach inokulowanych, , jak i w m
jak i w mł łodszych odszych dystalnych dystalnych liś li ś ciach ciach
(ale nie w li
(ale nie w liś ściach kontrolnych) ciach kontrolnych)
liść li ść inokulowany inokulowany
Infekcja wirusowa powoduje akumulacj
Infekcja wirusowa powoduje akumulacj ę ę siRNA siRNA
dni po inokulacji
Northern Northernblotblot Hamilton, A.J., and
Hamilton, A.J., and BaulcombeBaulcombe, D.C. (1999), D.C. (1999)ScienceScience li
liśćść
inokulowany inokulowany
li liśćść dystalny dystalny
26
Infekcja wirusowa powoduje akumulacj
Infekcja wirusowa powoduje akumulacj ę ę siRNA siRNA
DCL
liść inokulowany
AGO
Sarkies
27
SarkiesP., Miska E.A. (2014) P., Miska E.A. (2014) NatNat. . RevRev. MCB. MCB
Sygna
Sygna ł ł wyciszaj wyciszaj ą ą cy mo cy mo ż ż e rozprzestrzenia e rozprzestrzenia ć ć si si ę ę w cał w ca łej ro ej roś ś linie poprzez floem linie poprzez floem
• • egzogenne siRNA egzogenne siRNA 21 i 24nt
21 i 24nt (PTGS) (PTGS) – – wyciszanie
wyciszanie transgenu transgenu GFP GFP
• • endogenne 24nt endogenne 24nt siRNA siRNA
(TGS poprzez
(TGS poprzez remodelowanie remodelowanie chromatyny, pochodz
chromatyny, pochodzą ą z z transpozon
transpozonó ów w i innych i innych zmetylowanych
zmetylowanych rejonó rejon ów w genomu
genomu) )
• • miRNA m iRNA (PTGS) (PTGS) inokulowany liść wyciszenie
Voinnet
Voinnet, O., and , O., and BaulcombeBaulcombe, D. (1997) Nature, D. (1997) Nature
28
Mutanty biogenezy
Mutanty biogenezy siRNA siRNA s s ą ą mniej odporne mniej odporne na choroby wirusowe i
na choroby wirusowe i patogeny patogeny bakteryjne bakteryjne
Deleris
Deleris, A., , A., GallegoGallego--BartolomeBartolome, J., , J., BaoBao, J., , J., KasschauKasschau, K., Carrington, J.C., and , K., Carrington, J.C., and VoinnetVoinnet, O. (2006) Science, O. (2006) Science
WT WT Arabidopsis Arabidopsis inokulowany
inokulowany TRV TRV
Podw Podwó ójny jny mutant mutant
dcl2 dcl2- -dcl4 dcl4 inokulowany inokulowany TRV TRV
Wyciszanie wirusa TRV Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu)
w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby. Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji.
A. thaliana dzikiego typu (La-er) i mutanty biogenezy sRNA (dcl1-9 i hen1-1) inokulowane bakteriami Pseudomonas.
Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and
Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and VoinnetVoinnet, O. (2008) Science, O. (2008) Science
29
VIGS - podsumowanie
Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem
Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem siRNA siRNA jest ważnym jest ważnym mechanizmem obrony roślin przed
mechanizmem obrony roślin przed patogenami patogenami – – wirusami i bakteriami wirusami i bakteriami siRNA
siRNA hamują replikację hamują replikację wirusową wirusową u roślin u roślin (również u zwierząt (również u zwierząt - - Drosophila Drosophila melanogaster
melanogaster) )
siRNA
siRNA działają ogólnoustrojowo – działają ogólnoustrojowo – u roślin mogą się przemieszczać u roślin mogą się przemieszczać poprzez wiązki przewodzące
poprzez wiązki przewodzące
Większość wirusów wytwarza białka
Większość wirusów wytwarza białka supresorowe supresorowe, hamujące szlak , hamujące szlak wyciszania
wyciszania
30
dsRNA
dsRNA – – najsilniejszy inicjator wyciszania najsilniejszy inicjator wyciszania
modyfikacje genetyczne nicienia
modyfikacje genetyczne nicienia C. C. elegans elegans: :
Fire, A. et al., (1998) Nature Fire, A. et al., (1998) Nature
RNA RNA sens sens
RNA RNA antysens
antysens ds dsRNA RNA
bez zmian bez zmian fenotypowych fenotypowych
fenotyp fenotyp twitching twitching Wprowadzanie do
organizmów nicieni Caenorhabditis elegans
RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA,
odpowiadających sekwencji genu unc-22,
kodującego
miofilamentowe białko komórek mięśniowych.
Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching)
Wprowadzanie do organizmów nicieni Caenorhabditis elegans
RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA,
odpowiadających sekwencji genu unc-22,
kodującego
miofilamentowe białko komórek mięśniowych.
Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching)
bez zmian bez zmian fenotypowych fenotypowych
Exo Exo - - siRNA siRNA u zwierz u zwierz ą ą t: t:
31
Exo Exo - - siRNA siRNA u zwierz u zwierz ą ą t: t:
U ssak
U ssakó ów i w i C. C. elegans elegans – – tylko jedno bia tylko jedno biał łko ko Dicer Dicer, odpowiada za biogenez , odpowiada za biogenezę ę zaró zar ó wno wno siRNA
siRNA, jak i , jak i miRNA miRNA
Drosophila
Drosophila melanogaster: melanogaster : Dcr1 Dcr1 – – miRNA miRNA
Dcr2 Dcr2 – – siRNA siRNA, ,
wią wi ązane przez zane przez AGO2 AGO2 obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa
egzogenny
egzogenny dsRNA dsRNA wirusowy
wirusowy dsRNA dsRNA
cię ci ę cie mRNA cie mRNA
obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa
Okamura
OkamuraK. & K. & LaiLaiE.C.E.C.(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol
32
Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany
przez amplifikacj
przez amplifikacj ę ę siRNA siRNA
DC L
2-rzędowy siRNA RdRP
DC L
1-rzędowy siRNA
Wyciszenie może się
rozprzestrzeniać poza miejsce infekcji wirusowej dzięki aktywności RdRP
(RNA-dependent RNA polymerase)
i biogenezie 2-rzędowych siRNA.
RdRP RdRP – – polimeraza polimeraza RNA zależ RNA zale żna od RNA na od RNA ( (RNA RNA- -dependent dependent RNA Polymerase RNA Polymerase) )
33
Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany
przez amplifikacj
przez amplifikacj ę ę siRNA siRNA
1° 1 ° siRNA siRNA 1° 1 ° siRNA siRNA
2° 2 ° siRNA siRNA
2
2° ° siRNA siRNA
Ghildiyal
Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet
‘‘primaryprimaryArgonauteArgonaute’’
34
Endo Endo - - siRNA siRNA : :
Ghildiyal
Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet
35
Większość endogennych siRNA powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA
Większość endogennych siRNA powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA
Kasschau
Kasschau, K.D., , K.D., FahlgrenFahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., , N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., CumbieCumbie, J.S., , J.S., GivanGivan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) , S.A., and Carrington, J.C. (2007) PLoSPLoSBiolBiol
Większość siRNA w komórce pochodzi z sekwencji transpozonowych
i powtórzonych. U Arabidopsis thaliana duże zagęszczenie tego typu sekwencji występuje w rejonach centromerowych chromosomów.
ma
mał łe e RNA RNA
t transpo ranspoz zon ony y retrotranspo retrotranspozony zony
Chromosom Chromosom
Centromer Centromer
Wysoko
Wysoko--przepustowe przepustowe sekwencjonowaniesekwencjonowaniemamałłych RNAych RNA
36
Endo Endo - - siRNA siRNA u roślin u roślin : :
Ghildiyal
Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet
cis
cis- -acting acting siRNA siRNA
(
(casiRNAcasiRNA, , hchc--siRNAsiRNA))
trans
trans- -acting acting siRNA siRNA
(
(tasiRNAtasiRNA))
natural
natural antisense antisense siRNA siRNA
(
(natsiRNAnatsiRNA))
37
tasiRNA
tasiRNA : roś : ro ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA
gen TAS
RNA Pol II
AGO
RDR6
transkrypcja locus TAS przez polimerazę RNA II
wiązanie przez miRNA i cięcie
synteza drugiej nici RNA
przez RDR6 (RNA-dependent RNA polymerase)
tasiRNA
tasiRNA – – trans trans - - acting acting siRNA siRNA
• • specyficzne dla roś specyficzne dla ro ś lin lin
• • kodowane przez geny kodowane przez geny TAS TAS
• • obró obr óbka pierwotnego bka pierwotnego transkryptu transkryptu jest inicjowana przez jest inicjowana przez miRNA miRNA
rekrutacja RDR6
38
biogeneza
biogeneza tasiRNA tasiRNA – – c.d. c.d.
dsRNA jest cięty przez DCL4 na serię krótszych dsRNA,
uwalniając wiele cząsteczek
tasiRNA z jednego genu TAS.
39
Z jednego genu
Z jednego genu TAS TAS powstaje wiele cz
powstaje wiele czą ą steczek steczek tasiRNA tasiRNA
Allen, E.,
Allen, E., XieXie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell
↑ ↑
miejsce cięcia pierwotnego transkryptu przy
udziale miRNA
kluczowe dla zapewnienia
specyficzności tasiRNA;
DCL4 zaczyna ciąć prekursor dokładnie w tym miejscu i tnie
w odstępach 21nt
tasiRNA mogą powstawać z obu nici RNA
DCL4
DCL4 przesuwa przesuwa si si ę ę wzdł wzd łu u ż ż
dsRNA dsRNA, , odmierzaj odmierzają ąc c
i tną i tn ąc c
40
Mutacje rdr6 i zip, Mutacje rdr6 i zip,
podobnie jak
podobnie jak dcl4 dcl4 i i tas3, tas3,
przyspieszaj
przyspieszają ą zmiany zmiany rozwojowe rozwojowe
przyspieszone przej
przyspieszone przejśście z fazy juwenilnej cie z fazy juwenilnej do doros
do dorosłłej: wydej: wydłłuużżone lione liśście, wywinicie, wywinięęte te pod sp
pod spóód brzegi blaszek lid brzegi blaszek liśściowychciowych
Zaburzenia biogenezy
Zaburzenia biogenezy tasiRNA tasiRNA
→ → zaburzenia rozwoju zaburzenia rozwoju
Fahlgren
Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., A, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) lexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) CurrCurr. Biol. . Biol.
mutacja rdr6-15:
brak tasiRNA
zip-1 (AGO7):
brak TAS3 tasiRNA
Northern Northern
Arabidopsis
Arabidopsis – – 4 rodziny genó 4 rodziny gen ów w TAS TAS
•TAS1 • TAS1 i i TAS2 TAS2 tasiRNA tasiRNA – – PPR PPR
•TAS3 • TAS3 tasiRNA tasiRNA – – czynniki transkrypcyjne czynniki transkrypcyjne ARF ARF
•TAS4 • TAS4 tasiRNAs tasiRNAs – – czynniki czynniki transkrypcyjne transkrypcyjne MYB MYB
41
natsiRNA
natsiRNA : ro : ro ś ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA
Wg Wg KatiyarKatiyar--AgarwalAgarwal, S., Morgan, R., , S., Morgan, R., DahlbeckDahlbeck, D., , D., BorsaniBorsani, O., Villegas , O., Villegas JrJr. A., Zhu, J.. A., Zhu, J.--K., K., StaskawiczStaskawicz, B.J., and Jin, H. (2006), B.J., and Jin, H. (2006)Proc. Proc. NatlNatl. Acad. . Acad. SciSci. USA. USA
natsiRNA n atsiRNA – – natural n atural antisense antisense -transcript - transcript derived derived siRNA siRNA cis- cis - acting acting
pochodz
pochodzą ą z zachodzą z zachodz ą cych na siebie transkrypt cych na siebie transkryptó ów w genó gen ów zwi w zwią ą zanych ze stresem zanych ze stresem
AGO AGO
zachodz
zachodzą ące na siebie sekwencje ce na siebie sekwencje są s ąsiaduj siadują ą cych genó cych gen ów w
komplementarne wzgl
komplementarne wzglę ę dem dem siebie
siebie transkrypty transkrypty NAT NAT
(natural ( natural antisense) antisense )
tworz
tworzą ą dsRNA dsRNA
wyciszenie
wyciszenie
42
natsiRNA
natsiRNA : ro : ro ś ś linne endogenne linne endogenne siRNA siRNA
syntetyzowane w odpowiedzi na stres syntetyzowane w odpowiedzi na stres np. wysokie zasolenie gleby
np. wysokie zasolenie gleby
biogeneza:
biogeneza:
DCL2 i/lub DCL1, DCL2 i/lub DCL1, RDR6 (
RDR6 ( polimeraza polimeraza RNA zależ RNA zale żna od RNA na od RNA ), ), SGS3 (
SGS3 ( bia biał łko wi ko wiążą ążące RNA ce RNA ) ) i polimeraza i polimeraza RNA IV RNA IV
24 nt 24 nt natsiRNA natsiRNA – – cię ci ęcie jednej z cie jednej z cząsteczek
cząsteczek mRNA mRNA, druga s , druga sł łu u ż ży jako y jako matryca do syntezy 2
matryca do syntezy 2- -rz rz ędowych 21nt ę dowych 21nt natsiRNA
natsiRNA przez RDR6 przez RDR6 i DCL1 i DCL1
A.
A. thaliana thaliana: : lsiRNA lsiRNA (long ( long siRNA) siRNA ) 30- 30 -40nt 40nt
ró r ównie wnież ż powstają powstaj ą z transkrypt z transkryptó ów w NAT NAT inne bia
inne biał łka uczestnicz ka uczestniczą ą w biogenezie w biogenezie
Ghildiyal
Ghildiyal& & ZamoreZamore(200(20099) ) NatNatRevRevGenetGenet
43
Ro Ro ś ś linne linne polimerazy polimerazy RNA RNA
enzym występowanie funkcja
Polimeraza RNA I wszystkie Eucaryota synteza rRNA
Polimeraza RNA II wszystkie Eucaryota synteza mRNA, microRNA Polimeraza RNA III wszystkie Eucaryota synteza tRNA, 5S rRNA
Polimeraza RNA IV rośliny biogeneza siRNA
Polimeraza RNA V rośliny rekrutacja białek AGO do DNA
DNA RNA
polimeraza RNA
44
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS):
hc-siRNA
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS):
hc-siRNA
mał ma łe e RNA RNA mogą mog ą hamować hamowa ć transkrypcję transkrypcj ę okreś okre ś lonych lonych genó gen ó w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub biał bia ł ek histonowych ek histonowych
transkrypcja transkrypcja
Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając
rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach.
Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając
rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach.
DNA DNA bia
biał łka ka histonowe histonowe
wyciszenie
wyciszenie
45
Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.
CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG
TGS u roślin odkryto podczas doświadczeń
mających na celu wprowadzenie więcej niż
jednej modyfikacji genetycznej poprzez
krzyżowanie roślin ekspresja genu oporności
na kanamycynę
ekspresja genu oporności na higromycynę
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)
46
CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG
x
oczekiwane wyniki:
selekcja na kanamycynie: 50% Kan R
selekcja na higromycynie: 50% Hyg R
selekcja na Kan + Hyg: 25% Kan R and Hyg R
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)
Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.
47
CaMV 35S pro : HYG
W niektórych przypadkach jeden z
wprowadzonych genów był wyciszany
w roślinach potomnych mających
obie modyfikacje
obserwowane wyniki:
selekcja na kanamycynie: 50% Kan R
selekcja na higromycynie: 0% Hyg R
selekcja na Kan + Hyg: 0% Kan R and Hyg R CaMV 35S pro : KAN
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)
Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.
48
CaMV 35S pro : HYG
CaMV 35S pro : HYG
DNA w rejonie promotora wyciszonego genu jest metylowane
CaMV 35S pro : HYG
metylacja metylacja DNA DNA
CaMV 35S pro : KAN
W niektórych przypadkach jeden z
wprowadzonych genów był wyciszany
w roślinach potomnych mających
obie modyfikacje
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS) Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)
Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) EMBO J.
49
siRNA
siRNA mogą mog ą wyciszać wycisza ć DNA za po DNA za po ś ś rednictwem rednictwem enzym
enzymó ów w metyluj metylują ących cych cytozyny cytozyny lub modyfikuj
lub modyfikują ą cych bia cych bia ł ł ka ka histonowe histonowe
O N
NH
2N
~
O N
N NH
2~
CH3
cytozyna 5-metylocytozyna
m et ylo tra ns fe ra za
DNA może być kowalencyjnie modyfikowany w reakcji
metylacji cytozyny
metylacja metylacja
DNA DNA
W mechanizm
W mechanizm transkrypcyjnego transkrypcyjnego wyciszania wyciszania DNA przez
DNA przez siRNA siRNA zaangaż zaanga ż owane są owane s ą dwie dwie specyficzne dla ro
specyficzne dla roś ś lin lin polimerazy polimerazy RNA: RNA:
Pol Pol IV IV i Pol i Pol V V
AGO
metylotransferaza
DNA
modyfikacja modyfikacja
histon
histonó ów w
50
Polimerazy
Polimerazy RNA IV i V uczestnicz RNA IV i V uczestnicz ą ą
w w transkrypcyjnym transkrypcyjnym wyciszaniu gen wyciszaniu gen ó ó w w
Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie siRNA.
Niekodujące transkrypty
polimerazy RNA V nakierowują
maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA.
RNA Pol IV
RNA Pol V
modyfikacja modyfikacja
histon histonó ów w
metylacja metylacja
DNA DNA
51
Polimerazy
Polimerazy RNA IV i V uczestnicz RNA IV i V uczestnicz ą ą
w w transkrypcyjnym transkrypcyjnym wyciszaniu gen wyciszaniu gen ó ó w w
Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie siRNA.
Niekodujące transkrypty
polimerazy RNA V nakierowują
maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA.
HaagHaagJ.R., J.R., PikaardPikaardC.S.,C.S.,(20(201111) ) NatNatRevRevMol Mol CellCellBiolBiol
52
siRNA - podsumowanie
Szlak
Szlak siRNA siRNA wycisza egzogenny, „obcy” DNA, wycisza egzogenny, „obcy” DNA, transpozony transpozony oraz oraz sekwencje powtórzone
sekwencje powtórzone siRNA
siRNA powstają dzięki aktywności białek typu Dicer powstają dzięki aktywności białek typu Dicer, które tną , które tną dsRNA dsRNA siRNA
siRNA są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy wyciszające (RISC)
wyciszające (RISC)
Kompleksy wyciszające mogą działać
Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie, poprzez cięcie potranskrypcyjnie , poprzez cięcie mRNA mRNA lub inhibicję translacji lub inhibicję translacji
Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez
metylację
metylację DNA lub modyfikację białek histonowych DNA lub modyfikację białek histonowych
53
microRNA - miRNA microRNA - miRNA
• • uważa się, że miRNA uważa się, że miRNA wyewoluowały z wyewoluowały z siRNA siRNA – – powstają i dojrzewają powstają i dojrzewają w podobny (do pewnego stopnia) sposób
w podobny (do pewnego stopnia) sposób
• • miRNA miRNA są kodowane przez specyficzne geny są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale wpływają na MIR , ale wpływają na ekspresję innych genów
ekspresję innych genów – – są cząsteczkami regulatorowymi są cząsteczkami regulatorowymi działającymi
działającymi in in trans trans
• • miRNA miRNA u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe i fizjologiczne
i fizjologiczne
54
AAAn
RNA Pol II
microRNA działaja poprzez cięcie mRNA lub inhibicję translacji
DCL
gen gen MIR MIR
RNA Pol II
mRNA
AAAn
AGO
AGO
AAAnAGO
AAAnInhibicja Inhibicja translacji translacji
ci cię ęcie cie mRNA mRNA
microRNA - miRNA
microRNA - miRNA
55
microRNA - miRNA microRNA - miRNA
aktywna aktywna translacja translacja
inhibicja inhibicja inicjacji inicjacji translacji translacji
inhibicja inhibicja translacji translacji
degradacja degradacja
mRNA mRNA
Stefani
StefaniG., G., SlackSlackF. J.,F. J.,(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol
56
microRNA - miRNA microRNA - miRNA
aktywna aktywna translacja translacja
degradacja degradacja
mRNA mRNA
Stefani
StefaniG., G., SlackSlackF. J.,F. J.,(200(20088) ) Mol Mol CellCellBiolBiol
57 Step 1.
Step 1. Initial effect of miRNAs Initial effect of miRNAs: inhibition of translation at the initiation step without mRNA : inhibition of translation at the initiation step without mRNA decay.
decay.
Step 2.
Step 2. mRNA deadenylation mRNA deadenylation by PAN2– by PAN2 – PAN3 and CCR4– PAN3 and CCR4 – NOT complexes recruited by NOT complexes recruited by miRISC
miRISC as a consequence of translation inhibition that makes as a consequence of translation inhibition that makes poly(A poly(A) tail more accessible. ) tail more accessible.
Step3.
Step3. Stimulated deadenylation Stimulated deadenylation potentiates potentiates the effect on translational inhibition and lead the effect on translational inhibition and leads s to decay of target mRNAs through the recruitment of the
to decay of target mRNAs through the recruitment of the decapping decapping machinery machinery. .
Destabilization of target Destabilization of target mRNA is the predominant mRNA is the predominant reason for reduced protein reason for reduced protein output.
output.
58
Geny Geny MIR MIR : transkrypcja dł : transkrypcja d ł ugich cz ugich cz ą ą steczek steczek pri pri - - mi mi RNA RNA z kt z kt ó ó rych powstaj rych powstaj ą ą miRNA miRNA
• miRNA są kodowane przez geny MIR
• pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są
rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)
• nić miRNA* jest degradowana
• miRNA są kodowane przez geny MIR
• pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są
rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)
• nić miRNA* jest degradowana
3'5'
miRNA
miRNA*
3'
5'