ŻYWNOŚĆ 3(24) Supi, 2000
RA FA Ł W O Ł O SIA K
ZMIANY AKTYWNOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCEJ ALBUMIN GROCHU I FASOLI POD WPŁYWEM KWASU ASKORBINOWEGO
S t r e s z c z e n i e
W pracy badano w pływ kwasu askorbinowego na w łaściwości przeciwutleniające preparatów album i
nowych w em ulsjach i w obec roztworów kwasu linolowego, a także ich zdolność do zm iatania stabilnych rodników DPPH*. W ykazano dużą aktywność album in w w iększości stosowanych układów modelowych.
D odatek kw asu askorbinow ego pow odował najlepsze efekty w układach em ulsyjnych, spadek zawartości nadtlenków w roztw orach kwasu linolowego oraz największe zm iany aktyw ności przeciwrodnikowej w przypadku białek o najsłabszych właściwościach.
Wstęp
O d daw na znany je st niekorzystny w pływ reakcji utleniania na w łaściw ości zdrow otne i przechow alnicze żyw ności, stąd też podjęto w iele prac, w których poszu
kuje się przeciw utleniaczy o dużej aktyw ności. Substancje takie m og ą m ieć bardzo różny m echanizm działania i w zw iązku z tym są różnie klasyfikow ane. Jeden ze spo
sobów to podział na przeciw utleniacze pierw szorzędow e (zapobiegające pow staw aniu rodników tlenow ych - głów nie enzym y), drugorzędow e (zapobiegające rozw inięciu się rodnikow ych reakcji łańcuchow ych) i trzeciorzędow e (znoszące uszkodzenia spow o
dow ane utlenianiem ). Z punktu w idzenia technologii żyw ności najistotniejsze są sub
stancje należące do drugiej grupy [6], N ależą do nich m.in. a-tokoferol, kw as askorbi
now y i białka. Ich działanie było w ielokrotnie dow iedzione w różnych układach m o
delow ych. W iadom o ponadto, że łączenie przeciw utleniaczy często pow oduje efekt synergistyczny. Stw ierdzono m.in. w spółdziałanie białek z przeciw utleniaczam i feno
low ym i [4, 5, 9], W innych pracach dow iedziono zw iększenia stabilności katechin w obecności kw asu askorbinow ego [3], co m oże m ieć istotny w pływ na ich w łaściw ości antyoksydacyjne. Z nany je st także pozytyw ny w pływ dodatku kw asu askorbinow ego
Mgr inż. R. Wołosiak, Zakład Oceny Jakości Żywności, Katedra Technologii i Oceny Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Rakowiecka 26/30, 02-528 Warszawa.
Z M IA N Y A K TYW N O ŚC I PRZEC IW U TLEN IA JĄ C EJ A LB U M IN GRO CH U I F ASO LI PO D WPŁYWEM... 63
na zm niejszenie ilości w olnych rodników pow stających podczas interakcji białek z utleniającym i się lipidam i [8], B rak je st jed n ak doniesień na tem at w spółdziałania kw asu askorbinow ego i białek roślin strączkow ych w reakcjach antyoksydacyjnych.
D latego celem niniejszej pracy było zbadanie w łaściw ości przeciw utleniających album in w ybranych roślin strączkow ych (potencjalnych, naturalnych antyoksydantów drugorzędow ych) i w pływ u, jak i na nie w yw iera dodatek kw asu askorbinow ego.
Materiał i metody badań
M ateriałem badaw czym były liofilizow ane album iny z nasion fasoli białej (AFB), fasoli brązow ej (A FB r) i grochu (AG) uzyskane na drodze dializy w obec w ody dejoni- zowanej (72 h, zatrzym yw ane białka o m asie powyżej 12 kD a) alkalicznych ekstrak
tów m ąki z obłuszczonych nasion. Ponadto do badań zastosow ano kw as askorbinow y (Sigm a A -5960) i butylohydroksytoluen (Sigm a B -1378). O znaczenia próbek stosow a
nych w pracy jak o przeciw utleniacze przedstaw iono w tab. 1.
T a b e l a 1
O znaczenia próbek zastosow ane w pracy.
Sample codes used in the study.
Rodzaj próbki / Sample Oznaczenie / Code
A lbum iny z nasion fasoli białej (white bean albumins) AFB A lbum iny z nasion fasoli brązowej (brown bean albumins) A FBr
A lbum iny z nasion grochu (pea albumins) AG
Kwas askorbinow y (ascorbic acid) KA
A lbum iny z nasion fasoli białej połączone z kw asem askorbinowym A FB+KA A lbum iny z nasion fasoli brązowej połączone z kwasem askorbinowym AFBr+KA Album iny z nasion grochu połączone z kw asem askorbinowym AG+KA
B utylohydroksytoluen (butulohydroxytoluene) BHT
Próba odniesienia - bez dodatku przeciwutleniaczy (control sample) PO
O kreślenie w łaściw ości przeciw utleniających prow adzono w trzech różnych układach:
1) dodając preparaty ( 6 6 m g% ) w 0,1 M buforze fosforanow ym (pH 7,0) do roztw oru kw asu linolow ego, który poddaw ano procesow i utleniania w 60°C i w regularnych odstępach czasu oznaczano zaw artość nadtlenków spektrofotom etryczną m etod ą z tiocyjanianem żelaza przy λ = 500 nm [1];
2) stosując badane preparaty ( 1 0 0 m g% ) jak o antyoksydanty w em ulsjach złożonych z kw asu linolow ego, Tw een 20 i 0,1 M buforu fosforanow ego, w których oznaczano:
64 R afal Wolosiak
■ zaw artość nadtlenków (LO OH) pow stających podczas utleniania em ulsji (pH 7,0), w tem p. 37°C przez 10 min, przy zastosow aniu hem oglobiny jak o katali
zatora [7],
■ zaw artość produktów rozpadu nadtlenków kw asu linolow ego reagujących z kw asem tiobarbiturow ym (TBA RS), po 24. godzinnej inkubacji em ulsji (pH 7,4), w tem p. 37°C, przyspieszając proces przez dodatek jo n ó w żelaza (II) [10];
3) badając zm iatanie przez preparaty (100 m g% ) stabilnych rodników difenylo- pikrylo-hydrazylow ych (DPPH*), poprzez rejestrację absorbancji przy 517 nm w regularnych odstępach czasu do osiągnięcia stałej w artości [2],
U zyskane odczyty absorbancji posłużyły do obliczenia aktyw ności antyoksyda- cyjnej preparatów w edług wzoru:
A a = (1 - ApW/Ap0) x 100%,
gdzie: A pw i Apo - absorbancja odpow iednio dla próby właściw ej i odniesienia.
Wyniki i ich omówienie
B adając zm iatanie stabilnych rodników , rejestrow ano zm iany absorbancji DPPH*
po dodaniu preparatów do osiągnięcia fazy plateau. N ajw yższą aktyw ność w inakty- wacji rodników w ykazyw ał A FBr, przew yższając pod tym w zględem kw as askorbino
w y i niew iele tylko ustępując B H T (rys. 1.). Najsłabiej działały białka grochu. Połą
czenie A F B r z K A nie zm ieniło aktyw ności przeciw rodnikow ej tego preparatu, a w zrost zdolności do zm iatania DPPH* w przypadku AFB i A G był w yraźny, ale nie przekroczył w artości obserw ow anej dla kw asu askorbinow ego.
W szystkie trzy preparaty album in w ykazyw ały du żą aktyw ność w ham ow aniu re
akcji tw orzenia nadtlenków w roztw orach kw asu linolow ego, przez cały okres do
św iadczenia (rys. 2.): zaw artość nadtlenków w ahała się w okół w artości początkow ej w próbkach z dodatkiem album in z obu odm ian fasoli i nieznacznie w zrosła w przypadku album in uzyskanych z nasion grochu. N ajniższe zaw artości nadtlenków spośród wyżej w ym ienionych odnotow ano w próbce z dodatkiem AFBr. W artości te były porów ny
w alne z uzyskanym i po dodaniu B H T i niew iele w yższe od oznaczonych w próbce zaw ierającej kw as askorbinow y (rys. 3.).
Połączenie album in fasoli brązowej i grochu z kw asem askorbinow ym spow odo
w ało zbliżenie zaw artości nadtlenków do w artości odpow iadającej sam em u KA (w y
kazującem u przez praw ie cały okres dośw iadczenia stuprocentow ą inhibicję tw orzenia nadtlenków ), natom iast użycie w tym celu album in fasoli białej spow odow ało znaczne pogorszenie w łaściw ości przeciw utleniających (rys. 4.), co je st w ynikiem zaskakują-
ZMIANY AKTYWNOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCEJ ALBUMIN GROCHU I FASOLI POD WPŁYWEM... 65
cym w kontekście zw iększenia zdolności do zm iatania rodników D P P H ' przy takiej kom binacji antyoksydantów .
Rys. 1. Zm iatanie stabilnych rodników DPPH" przez preparaty.
Fig. 1. DPPH" stable radical scavenging activity o f the preparations.
Rys. 2. Zawartość nadtlenków w roztworach kwasu linolowego (próbki z dodatkiem preparatów albu
minowych).
Fig. 2. Peroxide contents in linoleic acid solutions (samples with album in preparations added).
66 R a fa ł W olosiak
Rys. 3. Zawartość nadtlenków w roztworach kw asu linolowego (próbki z dodatkiem kwasu askorbino
wego i BHT)
Fig. 3. Peroxide contents in linoleic acid solutions (samples w ith ascorbic acid and BHT added)
Rys. 4. Zawartość nadtlenków w roztworach kwasu linolowego (próbki z dodatkiem kwasu askorbino
wego i preparatów album inowych)
Fig. 4. Peroxide contents in linoleic acid solutions (samples w ith ascorbic acid and album in prepara
tions added)
ZMIANY AKTYWNOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCEJ ALBUMIN GROCHU I FASOLI POD WPŁYWEM... 67
K olejnym etapem pracy było zastosow anie badanych próbek jak o przeciw utlenia- czy w em ulsjach, w których stopień utlenienia kw asu linolow ego m ierzono rów nież zaw artością nadtlenków i produktów ich rozpadu (rys. 5.). A lbum iny w zależności od rodzaju nasion w ykazały bardzo różną aktyw ność ham ow ania reakcji tw orzenia nad
tlenków - od m inim alnie prooksydacyjnej (AFB) do w yraźnie anty oksydacyjnej (AG).
W tym dośw iadczeniu spośród album in najlepsze w łaściw ości posiadało białko grochu, były one jed n ak około dw ukrotnie gorsze od w ykazyw anych przez kw as askorbinow y.
Połączenie album in z K A m iało dodatni w pływ na ich aktyw ność w e w szystkich trzech kom binacjach, a w przypadku AFB i A G obserw ow ano efekt synergistyczny.
Rys. 5. Aktyw ność przeciw utleniająca preparatów zastosow anych w em ulsjach (LOOH = nadtlenki, TBARS = produkty rozpadu nadtlenków)
Fig. 5. A ntioxidant activity o f preparations in linoleic acid emulsions (LOOH = peroxides, TBARS = peroxides decom position products)
W yraźnie różniące się od pow yższych w yniki uzyskano przy pom iarze zaw artości produktów rozpadu nadtlenków . A ktyw ność preparatów album inow ych była bardzo w yrów nana, przy czym najlepsze w łaściw ości posiadało także i w tym przypadku b iał
ko grochu. U w agę zw raca w yjątkow o niska aktyw ność kw asu askorbinow ego, w iado
mo jednak, że w tym środow isku m oże on w ykazyw ać naw et tendencje prooksydacyj- ne [11], Z astosow anie układów łączących badane przeciw utleniacze spow odow ało pew ien w zrost efektyw ności ich działania ponad w ykazyw ane przez nie oddzielnie.
68 Rafał Wołosiak
Wnioski
1. Preparaty album inow e w ykazują w łaściw ości przeciw utleniające porów nyw alne z B H T, zależą one jed n ak od zastosow anego środow iska reakcji.
2. Pozytyw ny w pływ dodatku kw asu askorbinow ego na aktyw ność białek w ystępo
w ał w w iększości dośw iadczeń, przy czym jednoznaczny efekt synergistyczny za
obserw ow ano jed y n ie w układach em ulsyjnych.
LITERATURA
[1] Chen, Η -M., M uramoto, K., Yamauchi, F.: Structural analysis o f antioxydative peptides from soy
bean β-conglycinin. J. Agric. Food Chem., 43, 1995, 574.
[2] Chen, H.-M ., M uram oto, Κ., Yamauchi, F., Fujimoto, K., N okihara, Κ.: A ntioxidative properties o f histidine-contaning peptides designed from peptide fragments found in the digests o f a soybean pro
tein. J. Agric. Food Chem., 46, 1998, 49.
[3] Chen, Z-Y., Zhu, Q. Y., Wong, Y. F., Zhang, Z., Chung, Η. Y.: Stabilizing effect o f ascorbic acid on green tea catechins. J. Agric. Food Chem., 46, 1998, 2512.
[4] Hayes, R.E., Bookwalter, G.N., Bagley, E.B.: Antioxidant activity o f soybean flour and derivatives - a review. J. Food Sci., 42, 1977, 1527.
[5] Heinonen, M ., Rein, D., Satue-Gracia, M. T., Huang, S-W., German, J. B., Frankel, E. N.: Effect o f protein on the antioxidant activity o f phenolic compounds in a lecithin-liposom e oxidation system. J.
Agric. Food Chem., 46, 1998, 917.
[6] H orubała, A.: Pojem ność przeciwutleniająca i jej zmiany w procesach przetw arzania owoców i wa
rzyw. Przem. Ferm. i O woc.-W arz., 3, 1999, 30.
[7] Kuo, J-M ., Yeh, D-B., Pan, B. S.: Rapid photom etric assay evaluating antioxidative activity in edible plant material. J. Agric. Food Chem., 47, 1999, 3206.
[8] Saeed, S., Sawthorop, S. A., H owell, N. K.: Electron spin resonance (ESR) study on free radical transfer in fish lipid-protein interaction, J. Sci. Food Agric., 79, 1999, 1809.
[9] Yamamoto, Y., Kataoka, A., Kitora, M.: Enhancing effect o f β-lactoglobulin on the antioxidative activity o f a-tocopherol in an emulsion o f linoleic acid. Biosci. Biotechnol. Biochem ., 62, 1998, 1912.
[10] Yen, G-C., Chen, H-Y., Lee, C-E.: M easurem ent o f antioxidative activity in m etal ion-induced lipid peroxidation systems. J. Sci. Food Agric., 79, 1999, 1213.
CHANGES OF PEA AND BEAN ALBUMINS ANTIOXIDANT ACTIVITY INDUCED BY ASCORBIC ACID ADDITION
S u m m a r y
Influence o f ascorbic acid on antioxidant properties o f album in preparations against linoleic acid so
lutions and emulsions, as w ell as D PPH ' stable radical scavenging ability were evaluated. In m ost model systems high activity o f album ins was proved. Ascorbic acid addition had the best antioxidant effect in emulsions and resulted in decrease o f peroxides in linoleic acid solutions. The biggest changes o f antiradi
cal activity after ascorbic acid addition w ere observed for proteins exhibiting low er scavenging ability. § ]|
