Struktura a funkcja RNA ------------- Wysokoprzepustowe metody badania transkrypcji

(1)

Wysokoprzepustowe metody badania transkrypcji

---

Struktura a funkcja RNA

Michał Koper, IGiB UW

Molekularne techniki analizy RNA 2013

(2)

Mikromaczierze

(„chip” not „ChIP”)

(3)

Podstawa techniki - hybrydyzacja

Za: Wikipedia

(4)

Historia

• Lata 80-te XX w. – wczesne próby z

nanoszeniem DNA na filtry (rozwijanie techniki Southerna)

• 1995: pierwszy nowoczesny,

skomputeryzowany, wysokorozdzielczy „chip”

z zastosowaniem skanowania laserowego

(Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO, "Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray". Science 270)

• 1997: pierwszy cały genom na jednym układzie, S. cerevisiae

(Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C, Hwang SY,

Brown PO, Davis RW, "Yeast microarrays for genome wide parallel genetic

and gene expression analysis". Proc Natl Acad Sci USA 94)

(5)

Mikromacierze DNA

(ang. „DNA Microarrays”, „DNA-chip”)

• Układy pozwalające na wysokoprzepustowe badania ekspresji… ale nie tylko.

• Układy z naniesionymi sondami

molekularnymi, od kilkuset tys. do ponad 2 mln. (obecnie, ale gęstość rośnie)

• Najczęściej na podłożu szklanym, plastikowym lub krzemowym, ewentualnie „na kulkach”

• Sondy DNA: oligonukleotydy (krótkie lub długie) lub cDNA

• Sondy reprezentujące fragment locus

• Sondy dla odcinków międzygenowych

• Mikromacierze „tillingowe” („na zakładkę”)

(6)

Przygotowanie mikromacierzy

www-microarrays.u-strasbg.fr/images/spotted

(7)

Przygotowanie mikromacierzy Affymetrix

(8)

Znakowanie prób

1. Bezpośrednio

- inkorporacja modyfikowanych dNTP (Cy3, Cy5) podczas syntezy cDNA

2. Pośrednio

- inkorporacja modyfikowanych dNTP (amino-allyl dGTP) podczas syntezy cDNA;

- przyłączenie barwnika fluorescencyjnego (Cy3, Cy5)

3. Dendrymery

- dołączanie dodatkowych sekwencji na 3’

podczas syntezy cDNA;

- drugi etap hybrydyzacji w obecności

wyznakowanych (Cy3, Cy5) dendrymerów (3DNA)

4. Biotyna i streptavidyna

- cRNA wyznakowane biotyną (uracyl – biotyna);

- dodanie wyznakowanej fluorescencyjnie

streptavidyny

(9)

Doświadczenia wymagające technicznie

Bardzo istotne:

• Jakość slajdu

• Jakość i ilość oligonukleotydów nadrukowanych na slajdzie

• Jakość próbek RNA

• Metoda znakowania próbki

• Metoda hybrydyzacji

• Procedura skanowania

(10)

MAUI MIXER (Agilent)

(11)

Znakowanie i hybrydyzacja

(12)

Wykorzystanie znakowanego cRNA

(13)

Otrzymywanie i analiza danych

1. Skanowanie

2. Obróbka obrazu:

- identyfikacja właściwych sygnałów - określenie tła

- określenie intensywności sygnału 3. Standaryzacja danych

4. Ostateczna analiza

"Minimum Information About a Microarray Experiment" (MIAME)

Skaner Axon GenePix

TECAN PowerScanner

(14)

Analiza statystyczna danych

(15)

Zastosowania i warianty mikromacierzy DNA

• Macierze ekspresyjne

• Macierze cytogenetyczne

• Macierze tkankowo specyficzne (TMAS):

Progression Tissue Microarrays; Prognosis Tissue Microarrays

• Macierze CGH: Comparative Genomic Hybridization - różnice ilości kopii DNA pomiędzy genomami

• Macierze CGS: Comparative Genome Sequencing, dla małych genomów

• Macierze wykrywające metylację CpG, sprzęgnięte z technikami wzbogcania próby w DNA metylowany,

np. MeDIP (Methylated DNA immunoprecipitation)

• Mikromacierze stosowane do wzbogacania frakcji przed sekwencjonowaniem

(np. technologia NimbleGen SeqCap EZ Exome)

(16)

Mikromacierze białkowe

Białka immobilizowane na podłożu stałym:

• Przeciwciała – „przepłukiwanie ekstraktem”

• Białka – „przepłukiwanie przciwciałami”

• Badanie oddziaływań białka - białka

Za: http://www.eye-research.org/joomla/index.php?option=com_content&task=view&id=24&Itemid=37

(17)

Sekwencjonowanie DNA nowej generacji - NGS

(„wysokoprzepustowe”)

(18)

Sekwencjonowania nowej generacji

• Pirosekwencjonowanie:

sekwencjonowanie przez syntezę (Roche, 454)

• SOLID (Life Technologies, d. ABI):

sekwencjonowanie z ligacją

• Illlumina (SOLEXA):

„sekwencjonowanie mostkowe”

• ION Torrent (Life Technologies, d.

ABI): sekwencjonowanie na „chipie”

półprzewodnikowym

• Nowe pomysły: sekwencjonowanie via spektrometria

mas, sekwencjonowanie w nanoporach i inne…

(19)

Pirosekwencjonowanie (454, Roche)

Sekwencjonowanie przez syntezę

• Opracowane przez: Pål Nyrén i Mostafa Ronaghi

(Analytical Biochemistry 1996, Science 1998), patent obecnie w posiadaniu Roche

• Pirosekwencjonowanie I-generacji (1996): odczyty 100 bp, łącznie 30-60 Mb/przebieg (GS 20)

• Pirosekwencjonowanie II-generacji (2006): odczyty 250 bp, łącznie do 150 Mb/przebieg (FLX/GS FLX Standard)

• Pirosekwencjonowanie III-generacji (2008): odczyty do 400 bp, łącznie do 400-650 Mb/przebieg (XLR/GS FLX Titanium/FLX+)

• Reakcja złożona: wykorzystuje 4 różne enzymy

• Detekcja światła emitowanego po przyłączeniu nukleotydu

• Wynik to „pirogram”

(20)

Pirosekwencjonowanie (454, Roche)

(21)

Pyrosekwencjonowanie (454, Roche)

Emulsyjny PCR

http://www.my454.com/

(22)

SOLID (ABI): sekwencjonowanie z ligacją

http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applic

ations-technologies/solid/solid-5500.html

(23)

Illlumina (SOLEXA): „sekwencjonowanie mostkowe”

z odwracalną terminacją syntezy

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=4 5vNetkGspo

http://www.illumina.com/documents/products/techspotlights/tec

hspotlight_sequencing.pdf

(24)

Sekwencjonowania nowej generacji: zastosowania

• Sekwencjonowanie de novo

• Resekwencjonowanie

• Analizy ekspresyjne RNA-seq

• Metagenomika

• ChIP-seq, RIP-seq itp.

• Szybkie i masowe geneotypowania

(25)

Wydajności różnych aparatów NGS (2012)

Instrument Run time^a Millions of

Reads/run Bases / read^b Yield MB/run 3730xl (capillary) 2 hrs. 0.000096 650 0.06

PacBio RS 2 hrs. 0.01 860 – 1,500 5-10

454 GS Jr.

Titanium 10 hrs. 0.1 400 50

Oxford Nanopore

minion * 6 hrs.^c [0.1] [9,000] 1000

Ion Torrent –

‘314’ chip 2.5 hrs. 0.25 200 50

454 FLX Titanium 10 hrs. 1 400 400

454 FLX+ 20 hrs. 1 650 650

Ion Torrent –

‘316’ chip * 3 hrs. 1.6 200 320

Illumina MiSeq * 26 hrs. 4 150+150 1200

Ion Torrent –

‘318’ chip * 4.5 hrs. 4 200 800

Oxford Nanopore

GridION 2000 * [? hrs.]^c [4] [10,000] [40,000]

Oxford Nanopore

GridION 8000 * [5 hrs.]^c [10] [10,000] [100,000]

Ion Torrent –

Proton I * 4 hrs. [50] [200] [40,000]

Ion Torrent –

Proton II * 4 hrs. [250] [400] [100,000]

Illumina GAIIx 14 days 300 150+150 96,000

Illumina HiSeq

2500 – rapid * 40 hrs. 600 150+150 180,000

Illumina iScanSQ 8.5 days 700 100+100 140,000

SOLiD – 5500xl * 8 days >1,410^d 75+35 155,100 Illumina HiSeq

1000 8.5 days ≤1500 100+100 ≤300,000

Illumina HiSeq

2000 11.5 days ≤3000 100+100 ≤600,000

Glenn, TC (2011) Field Guide to Next Generation DNA Sequencers.

Molecular Ecology Resources. 2012 Update.

http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/

(26)

Koszt użycia różnych platform NGS (2012)

Glenn, TC (2011) Field Guide to Next Generation DNA Sequencers.

Molecular Ecology Resources. 2012 Update.

http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/

Instrument Reagent Cost/run^a Reagent Cost/MB Minimum Unit Cost (% run)^b

3730xl (capillary) $144 $2308 $6 (1%)

PacBio RS $300-1700^c $7-38 $500 (100%)

454 GS Jr. Titanium $1100 $22 $1500 (100%)

454 FLX Titanium $6,200 $12 $2000 (12%)

454 FLX+^d $6,200 $7 $2000 (12%)

Ion Torrent – ‘314’ chip $350 $7 ~$750 (100%)

Ion Torrent – ‘316’ chip $550 $2 ~$1000 (100%)

Oxford Nanopore minion

* ≤$900 $1 ~$1100 (10%)

Illumina MiSeq $1160 $1 ~$1400 (100%)

Ion Torrent – ‘318’ chip $750 $1 ~$1200 (100%)

Illumina GAIIx $17,575 $0.19 $3000 (14%)

Illumina iScanSQ $12,750 $0.09 $3000 (14%)

Ion Torrent – Proton I * $1000 $0.09 ? (100%)

SOLiD – 5500xl $10,503^d <$0.07 $2000 (12%)

Illumina HiSeq 2500 –

miniFC * ? ? ?

Illumina HiSeq 1000 $10,220 $0.04 $3000 (12%)

Illumina HiSeq 2000 $23,470^d ≥$0.04 $3000 (6%)

Oxford Nanopore

GridION 2000 * varies $0.03-0.04 ? (≤1%)

Oxford Nanopore

GridION 8000 * varies $0.01-0.02 ? (≤1%)

Ion Torrent – Proton II * [$1000] [$0.01] ? (100%)

(27)

ChIP-chip („ChIP on chip”) i ChiP-seq

• Immunoprecypitacja chromatyny

• Detekcja immunoprecypitowanego DNA na

mikromacierzach lub via sekwencjonowanie nowej generacji

• Pozwala na badanie oddziaływań białka-DNA na

skalę genomową : dystrybucja wiązania czynników

transkrypcyjnych czy dystrybucję polimerazy RNA II

(28)

ChIP-chip („ChIP on chip”) i ChIP-seq

Gilchrist i wsp, 2009

(29)

ChIP-chip („ChIP on chip”) i ChIP-seq

Gilchrist i wsp, 2009

(30)

ChIP-chip („ChIP on chip”) i ChIP-seq

(31)

ChIP-chip („ChIP on chip”) i ChIP-seq

(32)

RIP-Chip i RIP-seq

• Immunoprecypitacja RNA i jego fragmentacja

• Odwrotna transkrypcja immunoprecypitowanego RNA

• Detekcja otrzymanego cDNA na mikromacierzach lub via sekwencjonowanie nowej generacji

• Pozwala na badanie oddziaływań białka-RNA na

skalę genomową : dystrybucję wiązania czynników

transkrypcyjnych czy dystrybucję polimerazy RNA II

(33)

DIP – immunoprecypitacja DNA

• Izolacja „nagiego” DNA genomowego

• Inkubacja z ekstraktami lub oczyszczonymi in vitro białkami

• Immunoprecypitacja DNA

• Detekcja otrzymanego DNA: qPCR, mikromacierze, sekw.

nowej gen.

• Pozwala na badanie oddziaływań białka-DNA, w

szczególności określanie specyficzności wiązania DNA przez czynniki transkrypcyjne

• Technika „wolna” od efektów in vivo (poziom ekspresji białka, zależność od systemów regulacji), które mogą uniemożliwiać detekcję lub maskować faktyczną

specyficzność

• Umożliwia sterowanie warunkami wiązania, np. zmiany stężeń kofaktorów

• Różne warianty: DIP-Chip, DIP-Seq, Me-DIP

Patrz m. in. Liu X. i wsp, Genome Res 2005 i Liu X. i wsp, Genome Res 2006

(34)

Struktura a funkcja RNA

(35)

RNA capacity - CATALYTIC RNAs

Escherichia coli RNaseP RNA Tetrahymena group I

self-splicing intron

Nobel 1989

Thomas Cech Sidney Altman

RNA enzymes – RIBOZYMES

-1981/82 Tom Cech - self-splicing in Tetrahymena rRNA -1982 Sidney Altman - bacterial RNaseP RNA subunit

Za J. Kufel (Wykład 1)

(36)

mRNA SPLICING Nobels 1993

Phil Sharp

Richard Roberts

RNAi Nobels 2006

Andrew Fire Craig Mello

Za J. Kufel (Wykład 1)

(37)

RNAs – STRUCTURE AND FUNCTION

Nobels 2009

Elizabeth Blackburn Jack Szostak

Carol Greider

Telomerase -

maintaing chromosome ends

Venkatraman Ramakrishnan Ada Yonath

Thomas Steitz

Crystal structure of the ribosome

Za J. Kufel (Wykład 1)

(38)

Library of randomized RNA sequences (10

¹⁵

)

SELEX cycles

1. binding

2. washing

3. elution 4. Amplification

RT-PCR

5. in vitro transcription

final molecules:

cloning, analysis

last cycle

Enriched library

discard -

molecules that do not bind

molecules that bind Enrichment

Target

tests

SELEX ⁼ Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment

Szostak Gold

1990 Method of selecting RNA/DNA molecules with

desired properties (aptamers, ribozymes) based on cycles of amplification

Selected RNAs:

- cleave DNA i RNA - ligate RNAs

- self-replicate

- create peptide bonds

Za J. Kufel (Wykład 1)

(39)

Zwijanie się RNA

(40)

Organizacja struktury RNA: 3 poziomy

• Struktura I-rzędowa: sekwencja nukleotydowa

• Strukura II-rzędowa: parowania nukleotydów wg zasad Watsona- Cricka

• Struktura III-rzędowa:

oddziaływania pomiędzy odległymi strukturami II-rzędowymi w

cząsteczce

(41)

Struktura I-rzędowa: sekwencja nukleotydowa

• Sekwencja zależna od DNA ale…

• wyciananie intronów, insercje, delecje oraz…

• modyfikacje potranskrypcyjne (Ψ - pseudouracyl, D - dihydrourydyna)…

• więc dokładne jej określenie jest możliwe

dzięki sekwencjonowaniu cDNA, czasem

koniecznie w połączeniu ze spektrometrią

mas

(42)

Krawędzie zasad uczestniczące w parowaniu nukleotydów

Geometric nomenclature and classification of RNA base pairs. NB Leontis and E Westhof. RNA 2001. 7: 499-512

Puryny (G lub A) Pirymidyny (T, C lub U)

(43)

Struktura II-rzędowa: parowania nukleotydów kanoniczne i niekanoniczne

• Parowanie kanoniczne: parowania nukleotydów wg reguł Watsona- Cricka (G:C, A:T, A:U)

• Parowania niekanoniczne: typu wobble (G:U) oraz wynikające z odziaływań pomiędzy atomami pozostałych krawędzi cząsteczek zasad – wiele możliwości.

• Parowania tworzą odcinki dwuniciowe: oraz odcinki

jednoniciowe je rozdzielające

(44)

Figure 8. (Previous page and above) Two H‐bond base pairing types found in HR‐RNA‐SET.

Lemieux S , Major F Nucl. Acids Res. 2002;30:4250-4263

RNA canonical and non-canonical base pairing

types: a recognition method and complete repertoire

(45)

Figure 8. (Previous page and above) Two H‐bond base pairing types found in HR‐RNA‐SET.

Lemieux S , Major F Nucl. Acids Res. 2002;30:4250-4263

RNA canonical and non-canonical base pairing

types: a recognition method and complete repertoire

(46)

Najczęściej występujące elementy struktury II- rzędowej z parowaniami Watsona-Cricka

Robert T. Batey, Robert P. Rambo, and Jennifer A. Doudna Angew.

Chem. Int. Ed. 1999

(47)

Przykładowa struktura: tRNA ^Phe

Robert T. Batey, Robert P. Rambo, and Jennifer A. Doudna Angew. Chem. Int. Ed. 1999

Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed., 2000

Stałe (niezmienne) pozycje nukleotydowe dla klasy I tRNA wytłuszczono. Biorą one udział w funkcjach biologicznych lub są odpowiedzialne za

organizowanie architektury cząsteczki

Str. II-rz.

Str. III-rz.

(48)

Struktura III-rzędowa: oddziaływania 3D pomiędzy odległymi elementami struktury

Oddziaływania pomiędzy motywami helikalnymi

• Upakowanie współosiowe

• Platforma adenozynowa

• Oddziaływania helikalne poprzez grupę 2’- hydroksylową

Odziaływania pomiędzy helikalnymi i nie sparowanymi motywami

• Triplety i Tripleksy zasad

• Motyw „tetraloop”

• Motyw z rdzeniowym metalem

• Suwak rybozowy

Trzeciorzędowe oddziaływania pomiędzy odcinkami niesparowanymi

• Oddziaływania pętla-pętla

• pseudowęzły

(49)

Oddziaływania pomiędzy motywami helikalnymi

Model domen P4-P6 intronu Tetrachymena

(PDB accession number 1gid)

Platforma adenozynowa intronu Tetrachymena

Robert T. Batey, Robert P.

Rambo, and Jennifer A. Doudna Angew. Chem. Int. Ed. 1999

(50)

Potrójne parowania zasad w RNA

Robert T. Batey, Robert P. Rambo, and Jennifer A. Doudna Angew. Chem. Int. Ed. 1999

(51)

Pseudowęzły

Robert T. Batey, Robert P. Rambo, and Jennifer A. Doudna Angew. Chem. Int. Ed. 1999 TYMV pseudoknot (PDB accession number 1a60)

(52)

Modelowanie struktury RNA

Przewidywanie struktury RNA:

•Przewidywanie struktury II-rzędowej: algorytmy obliczające mapę parowań dla struktur o najniższej energii swobodnej, np.

algorytm Zuckera (mfold) – podejście fizyczne.

•Przyrównanie z homologiczną sekwencją o znanej strukturze – podejście ewolucyjne.

Badanie faktycznej struktury RNA:

•Analiza biochemiczna mapy parowań: cięcie nukleazami odcinków jednoniciowych

•Badania krystalograficzne, np. NMR

Integracja danych daje najlepsze rezultaty

(53)

Mapowanie struktury RNA przy pomocy RNaz

• Czynniki przecinające RNA w obrębie odcinków jednoniciowych, dwuniciowe protegowane

• Enzymatyczne lub chemiczne RNazy:

- nukleazy U2, T1, V1, RnI, ChSI - jony metali ciężkich: Pb ²⁺

- degradacja alkaiczna

• Specyficzność względem sekwencji (wiązań

pomiędzy konkretnymi zasadami)

(54)

• Doświadczenia in vitro

- wada: niefizjologiczne stężenia RNA, nie zawsze fizjologiczne stężęnia soli w buforach

-zaleta: proste w wykonaniu, możliwe mapowanie dużych cząsteczek, łatwe dodawanie niskocząsteczkowych

ligandów

• Schemat doświadczenia:

1. Transkrypcja in vitro w obecności np. ³² P-UTP, lub

znakowanie zimnych transkryptów poprzez kinazowanie (5’koniec) lub ligację (ligaza RNA T4)

2. Czyszczenie piętnowanego RNA 3. Inkubacja w buforze z RNazami

4. Rozdział w żelu poliakrylamidowym i autoradiogrfia 5. Analiza wyników, sprzęgnięta z algorytmami

modelowania struktur RNA (mfold)

Mapowanie struktury RNA przy pomocy RNaz

(55)

• 5’UTR mRNA agaA posiada złożoną potencjalnią strukturę 2-rzędową.

• L-arginina wiąże się z 5’UTR mRNA arginazy.

• L-arginina specyficznie zmienia strukturę 5’UTR mRNA arginazy in vitro, D-arginina nie

• W 5’UTR znajduje się intron, którego położenie sugeruje możliwość jego alternatywnego wycinania: 19 nt za poznanym doświadczalnie 3’

miejscem składania znajduje się druga konserwowana sekwencja sygnałowa dla 3’ miejsca składania intronów.

Mapowanie struktury 5’UTR mRNA arginazy A. nidulans

(56)

Mapowanie struktury 5’UTR mRNA arginazy A. nidulans

Borsuk i wsp., 2007

(57)

5’UTR arginazy zmienia strukturę pod wpływem L-argininy

Molekularne techniki analizy RNA 2013 Borsuk i wsp., 2007

(58)

Mapowanie struktury RNA przy pomocy RNaz

(59)

Ryboprzełączniki i aptamery RNA

(60)

Aptamery RNA:

elemnty strukturalne wiążące

niskocząsteczkowe ligandy lub białka

(61)

Ryboprzełączniki (ang. „riboswitch”)

RNA sensorowe, zdolne do wiązania niskocząsteczkowych ligandów

• Wiązanie niskocząsteczkowego ligandu zmienia strukturę RNA

• Elemnty wiążące (aptamery) znajdują się najczęściej w UTRach

• Regulacja transkrypcji

• Regulacja translacji

• Odpowiedź na bodźce środowiskowe

• Pierwotnie wykryte u Procaryota i traktowane jako pozostałość „Świata RNA”

• Obecnie znane przykłady u Eucaryota

(62)

AML1

Crucial transcription factor for blood cell differentiation

AML1-MTG8 fusion by chromosomal translocation in acute leukemia → dominant repression

ON transcription

normal

leukemia

OFF transcription

AML1 aptamer

・ 37mer

・ stabilized by 2’-F

・ bind to the RUNT domain of AML1

AML1 aptamer 9.2×10 ^-9 AML1-binding DNA 7.3×10 ^-8

K _d (M)

Stronger affinity

RNA Aptamer to transcription factor AML1

(Nakamura in collaboration with Kozu group)

(63)

MFOLD predicted

NMR

determined

NMR tertiary

structure Base triple CACG Loop

NMR Structure

(Nakamura in collaboration with Sakamoto group)

(64)

Przykłady ryboprzełączników

D. A. Lafontaine et al, Riboswitches as Promising Regulator, ChemBioChem 2009, 10, 400 – 41

„termometr RNA”

(65)

Przykłady aptamerów wiążących niskocząsteczkowe ligandy

D. A. Lafontaine et al, Riboswitches as Promising Regulator, ChemBioChem 2009, 10, 400 – 41

(66)

Przykłady ryboprzełączników u eukariontów –

pozytywna pętla zwrotna w składaniu mRNA TNF-α

Raymond Kaempfer, RNA sensors: novel regulators of gene expression EMBO reports VOL 4 | NO 11 | 2003

• PKR – RNA zależna kinaza białkowa, mediator odpowiedzi immunologicznej

• Samoaktywacja PRK po związaniu dsRNA np.

wirusowego

• PRK fosforyluje eIF2 – blokada translacji

• Splicing mRNA TNF-α czuły na 2-aminopurynę, inhibitor PKR

• Struktura 2-APRE w mRNA TNF-α aktywuje PRK

• TNF-α aktywuje transkrypcję genu PRK

(67)

Przykłady ryboprzełączników u eukariontów –

negatywna pętla zwrotna w translacji mRNA IFN-γ

Raymond Kaempfer, RNA sensors: novel regulators of gene expression, EMBO reports VOL 4 | NO 11 | 2003

• Pseudowęzęł typu H w 5’UTR mRNA IFN-γ aktywuje PRK

• PRK poprzez fosforylację eIF2 hamuje translację mRNA IFN-γ

• IFN-γ wzmaga ekspresję

PRK

(68)