RO C ZNIK I G L E B O Z N A W C Z E TO M LIV N R 1/2 W A R S Z A W A 2003: 4 3 - 4 9
EWA BEATA GÓRSKA*, KHALIFA OMAR EL-HAJ*,
DARIUSZ GOZDOWSKI**, STEFAN RUSSEL*
W P Ł Y W W IE L O L E T N IE G O N A W O Ż E N I A
N A W Y S T Ę P O W A N I E W G L E B IE
B A K T E R II C E L U L O L IT Y C Z N Y C H
Z R O D Z A J U C L O S T R I D I U M
EFFECT OF LONG-TERM FERTILIZATION
ON THE OCCURRENCE OF CELLULOLYTIC
CLOSTRIDIA IN THE SOIL
Zakład Mikrobiologii Rolniczej*, Katedra Nauk o Środowisku Glebowym;
Zakład Szczegółowej Uprawy Roślin**, Katedra Agronomii,
SGGW, Warszawa
Abstract: The studies were carried out on selected treatments of long-term fertilization experiment
at Lyczyn. The most probable number (MPN) of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria was analysed by tube dillution technique and calculated using the Me Credy’s method. At the same time the soil samples were analysed for pH and content of organic carbon, nitrogen, phosphorus and potassium. The occurrence of investigated bacteria was affected by fertilization. The highest number of cellulolytic bacteria was observed in pots emended both with mineral and organic fertilizers applied. The regression analysis showed clear relation between organic carbon, nitrogen, phosphorus, and potassium content in soil and occurrence of investigated cellulolytic bacteria. The occurrence of anaerobic bacteria was affected by pH of investigated soils.
Słowa kluczowe: bakterie celulolityczne, Bacillus, Clostridium, doświadczenia nawozowe. Key words', cellulolytic bacteria, Bacillus, Clostridium, fertilizer experiments.
WSTĘP
Przemysł rolno-spożywczy, drzewny, papierniczy oraz tekstylny generuje każde
go roku około 140 do 180 mld ton odpadów lignocelulozowych złożonych głównie z
celulozy, lignin, ksylanu i pektyn [Bujak i Targoński 1988, Coughlan 1992].
Proces rozkładu substratów lignocelulozowych w glebie zależy od wielu czynni
ków biologicznych, między innymi od składu mikroflory glebowej, jak również od
czynników abiotycznych, takich jak: odczyn gleby, temperatura, wilgotność, zawar
44
tość substancji organicznej, skład granulometryczny itp. W ekosystemach rolniczych
duży wpływ na rozkład celulozy mają zabiegi uprawowe oraz nawożenie mineralne i
organiczne [Gulays i wsp., 1984].
W warunkach naturalnych celuloza jest rozkładana i wykorzystywana jako źródło
węgla i substrat energetyczny, przede wszystkim przez zróżnicowaną morfologicznie
i fizjologicznie grupę drobnoustrojów celulolitycznych [Beguin, Aubert 1994; Coug-
hlan 1992]. Wśród glebowych bakterii celulolitycznych, które biorą udział w rozkła
dzie celulozy, występują zarówno tlenowe, jak i beztlenowe bakterie mezofilne
należące do rodzaju Bacillus [Paul, Varma 1993; Kim, Kim 1995] i Clostridium [Khan
i Patel 1991 ]. Organizmy te przeżywają niesprzyjające warunki środowiska w postaci
endospor. Mimo wieloletnich badań prowadzonych nad tymi bakteriami właściwości
celulolityczne mezofilnych bakterii glebowych z rodzaju Clostridium są mało pozna
ne, zwłaszcza że bakterie te izolowano głównie z kompostu, mułu rzecznego, drewna
i przewodu pokarmowego przeżuwaczy [Hethener i in. 1992]. Większość badań nad
przetrwalnikującymi bakteriami celulolitycznymi ogranicza się tylko do stwierdzenia
ich obecności w glebie i określenia aktywności enzymatycznej, bez uwzględniania
wpływu na ich występowanie czynników środowiska, w tym nawożenia mineralnego
i organicznego.
Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu wieloletniego nawożenia mineral
nego i organicznego obornikiem na dynamikę występowania w glebie beztlenowych,
mezofilnych bakterii z rodzaju Clostridium zdolnych do rozkładu celulozy.
MATERIAŁ I METODY
Materiałem do badań była gleba płowa wytworzona z pyłu pobrana z kombinacji
nawozowych wieloletniego, statycznego doświadczenia nawozowego w Łyczynie
(tab. 1). Opis doświadczenia zawarty jest w publikacjach Górskiej i in. [1999] oraz
Kuszelewskiego i Łabętowicza [ 1992]. Próbki gleby do badań pobierano 5-krotnie w
ciągu okresu wegetacji z warstwy ornej gleby, głębokości 0-20 cm. Właściwości
fizyko-chemiczne badanych próbek gleby przedstawia tabela 1.
Najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) beztlenowych, mezofilnych, celulolity
cznych bakterii przetrwalnikujących oznaczano metodą rozcieńczeń w atmosferze
azotu, w pożywce CM3 [Weimer, Zeikus 1991] z dodatkiem pasków bibuły filtracyj
nej jako źródła węgla (0,5 x 15 cm). NPL badanych drobnoustrojów obliczano stosując
tabele Mc Credy’ego dla trzech powtórzeń [Girard, Rougieux 1967].
Wpływ odczynu gleby oraz zawartości węgla organicznego, N-ogółem, dostę
pnych form P i К na liczebność bakterii celulolitycznych z rodzaju Clostridium badano
statystycznie metodą regresji prostoliniowej, wpływ nawożenia określono metodą
analizy wariancji, natomiast grupy jednorodne wyznaczano testem t-studenta. Obli
czenia statystyczne wykonano na średniej liczbie badanych bakterii z pięciu terminów.
Wpływ wieloletniego nawożenia na występowanie
w
glebie
celulolitycznych bakterii z rodzaju Clostridium
___________
45
TABELA 1. Właściwości fizyko-chemiczne próbek gleby pobranych z wieloletniego doświadcze nia nawozowego (*azot ogółem, **formy dostępne)
TABLE 1. Physico-chemical properties of soil depending on the long-term organic and mineral fertilization (*total N, **available forms)
Kombinacje nawozowe Fertilization pH С [g-kg"1] Zawartość - Content [g - k g “1] H20 KC1 N* p** К**
O - bez nawożenia - no fertilization 5,70 4,98 3,5 0,50 0,09 0,03 Ob. - obornik, FYM-farmyard manure 5,81 5,17 5,7 0,65 0,04 0,06
N 4,92 4,11 6,0 0,53 0,09 0,03 N+Ob, N+FYM 5,54 4,58 6,8 0,72 0,05 0,09 Ca 6,85 6,22 6,7 0,47 0,02 0,03 Ca+Ob, Ca+FYM 6,79 6,15 7,1 0,66 0,06 0,06 PK 5,24 4,15 6,1 0,51 0,08 0,11 PK+Ob, PK+FYM 6,45 5,87 6,8 0,66 0,14 0,13 NPK 5,84 4,67 6,7 0,52 0,08 0,05 NPK+Ob., NPK+FYM 5,68 4,67 7,7 0,78 0,10 0,12 CaN 6,00 5,24 6,3 0,53 0,02 0,03 CaN+Ob, CaN+FYM 6,71 6,28 7,8 0,74 0,07 0,09 CaPK 6,86 6,44 6,3 0,51 0,12 0,11 CaPK+Ob, CaPK+FYM 6,94 6,53 6,5 0,66 0,17 0,12 CaNPK 6,28 5,68 7,2 0,56 0,09 0,10 CaNPK+Ob, CaNPK+FYM 6,72 6,17 7,6 0,70 0,15 0,12
WYNIKI I DYSKUSJA
Występowanie przetrwalnikujących bakterii celulolitycznych w glebie jest przed
miotem licznych badań prowadzonych przez mikrobiologów w ciągu minionych lat
[Vardavakis 1989; Béguin, Aubert 1994].
Rola bakterii z rodzaju Bacillus i Clostridium w środowisku naturalnym, w tym w
glebie jest znacząca, z uwagi na ich udział w rozkładzie materii organicznej, np. białek,
pektyn, skrobi, kwasów nukleinowych, lignin, ksylanu, celulozy itp. [Fogarty i in.
1974a,b] oraz zdolności do syntezy nitrogenazy [Leschine i in. 1988; Górska i in.
2001], która odpowiedzialna jest za proces wiązania azotu cząsteczkowego.
W zależności od zastosowanego nawożenia badane próbki gleb różniły się odczy
nem i zawartością pierwiastków biogennych. Górska i inni [1999] wykazali, że
liczebność tlenowych i względnie beztlenowych bakterii celulolitycznych z rodzaju
Bacillus w glebie zależy od nawożenia mineralnego, organicznego obornikiem i
wapnowania. Podobne wyniki uzyskano w badaniach przeprowadzonych w ramach
niniejszej pracy, z których wynika, że występowanie bakterii z rodzaju Clostridium
zależy od nawożenia (rys. 1). Liczebność bakterii z rodzaju Clostridium w warstwie
ornej gleby jest znacznie mniejsza niż bakterii z rodzaju Bacillus [Górska i in. 1999].
Wskaźnik ten waha się w granicach od 32 komórek • g-1 s. m. gleby na obiekcie
nienawożonym do 322 komórek w glebie przy pełnym nawożeniu mineralnym i
organicznym. Najniższą liczebność bakterii celulolitycznych stwierdzono w
kombi-46
[ □ O B obornik-FY M D Ca В Ca-h)bom ik, Ca+F YM
N a w o żen ie, Fertilization
RYSUNEK 1. Wpływ nawożenia na występowanie beztlenowych, mezofilnych, celulolitycznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*różnymi literami oznaczono średnie różniące się istotnie) FIGURE 1. Effect of fertilization on the occurrence of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*mean significant differences are marked with different letters)
nacji nienawożonej i niewapnowanej, natomiast najwyższą na glebie zwapnowanej,
gdzie zastosowano obornik i nawożenie mineralne.
Występowanie beztlenowych, przetrwalnikujących bakterii celulolitycznych w
glebie zależy od terminu pobrania próbek do analiz (rys. 2), co jest związane między
innymi z warunkami klimatycznymi. Badane drobnoustroje występowały najliczniej
w próbkach gleby pobranych w sierpniu.
Obliczenia statystyczne wskazują na istotny wpływ odczynu gleby na NPL bakterii
z rodzaju Clostridium (rys. 3), czego nie stwierdzono w przypadku bakterii z rodzaju
Czerwiec. June lip iec . July Sierpień, Wrzesień, Październik A ugust September October
RYSUNEK 2. Wpływ terminu na występowanie beztlenowych, mezofilnych, celulolitycznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*różnymi literami oznaczono średnie różniące się istotnie) FIGURE 2. Effect of terms o f analysis on the occurrence of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*mean significant differences are marked with different letters)
Wpływ wieloletniego nawożenia na występowanie
w
glebie
celulolitycznych bakterii z rodzaju Clostridium
___________
47
RYSUNEK 3. Zależność między odczynem gleby a NPL beztlenowych, mezofilnych, celulolitycz- nych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*istotność współczynnika regresji przy cc=0,05) FIGURE 3. The effect of pH on the occurrence of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*significant regression coefficient at oc=0.05)
Bacillus [Górska i in. 1999]. Analiza regresji prostej wykazała istotną liniową zależ
ność pomiędzy zawartością węgla organicznego, azotu ogółem, dostępnych form
fosforu i potasu a liczebnością beztlenowych, mezofilnych, przetrwalnikujących
bakterii celulolitycznych w glebie (rys. 4, 5, 6, 7). Wzrost wartości wymienionych
wskaźników wpływa istotnie na wzrost liczebności badanej grupy drobnoustrojów.
Podobne istotne zależności statystyczne stwierdzono między występowaniem w
glebie celulolitycznych bakterii z rodzaju Bacillus a zawartością węgla organicznego,
azotu ogółem, dostępnych form fosforu i potasu [Górska i in. 1999].
RYSUNEK 4. Zależność między zawartością węgla a NPL beztlenowych, mezofilnych, celulolity- cznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*istotność współczynnika regresji przy a=0,05) FIGURE 4. Effect of С content on MPN of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (^significant regression coefficient at a=0.05)
48
,
RYSUNEK 5. Zależność między zawartością azotu ogólnego a NPL beztlenowych, mezofilnych, celulolitycznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*współczyn. regresji istotny przy oc=0,05) FIGURE 5. Effect of N-total content on MPN of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*significant regression coefficient at oc=0.05)
RYSUNEK 6. Zależność między zawartością dostępnego fosforu a NPL beztlenowych, mezofilnych, celulolitycznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*współczyn. regresji istotny przy a=0.05) FIGURE 6. Effect of P-available content on MPN of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*significant regression coefficient at a=0.05)
RYSUNEK 7. Zależność między zawartością dostępnego К a NPL beztlenowych, mezofilnych, celulolitycznych bakterii przetrwalnikujących w glebie (*współczyn.regresji istotny przy oc=0,05) FIGURE 7. Effect of К available content on MPN of anaerobic, mesophilic, spore-forming, cellulolytic bacteria in the soil (*significant regression coefficient at a=0.05)
Wpływ wieloletniego nawożenia na występowanie w glebie
celulolitycznych bakterii z rodzaju Clostridium
___________
49
WNIOSKI
1. Występowanie beztlenowych, mezofilnych, przetrwalnikujących bakterii celuloli
tycznych zależy od nawożenia i terminu pobrania próbek gleby.
2. Liczebność mezofilnych bakterii celulolitycznych z rodzaju Clostridium wzrasta
proporcjonalnie do wzrostu wartości pH oraz zawartości w glebie węgla organicz
nego, azotu ogółem, fosforu i potasu dostępnego.
LITERATURA
BEGUIN P., AUBERT J. P. 1994: The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiol. Rev., 13:25-58. BUJAK S., TARGOŃSKI Z., 1988: Mikrobiologiczna degradacja materiałów lignino-celulozo-
wych. Post. Mikrobiol. 27, 3: 211-241.
COUGHLAN M. P. 1992: Enzymie hydrolysis of cellulose: an overview. Biore.Technol. 39: 107-115. FOGARTY W. M., GRIFFIN P. J., JOYCE A. M. 1974a: Enzymes of Bacillus species - part 1.
Proc. Biochem., July/August: 11-24.
FOGARTY W. M., GRIFFIN P. J., JOYCE A. M. 1974b: Enzymes of Bacillus species - part 2.
Proc. Biochem., September: 27-35.
GIRARD H., ROUGIEUX R. 1967: Techniques de Microbiologie Agricole, Dunod. Paris. GÓRSKA E. В., RUSSEL S., ŁABĘTOWICZ J. 1999: Wpływ wieloletniego nawożenia na
występowanie tlenowych, mezofilnych, przetrwalnikujących bakterii celulolitycznych w gle bie. %esz. Probl. Post. Nauk. Roln. 465: 517-526.
GÓRSKA E. B., TUDEK B., RUSSEL S. 2001 : Degradation of cellulose by nitrogen-fixing strain o f Bacillus polymyxa. Acta Microbiol. Pol. 50, 2: 129-137.
GULAYS F., LASZTITY B., SZEGI J., KADAR I. 1984: Cellulose decomposition in chemosem soil as affected by intensive fertilization. [W] Soil Biology and Conservation of the Biospher II. J. Szegi (ed.), Akademiai Kiado. Budapest: 95.
HETHENER P., BRAUMAN A., GARCIA J. 1992: Clostridium thermitidis p. nov., a cellulolytic bacterium from the gut of the wood-feeding termite- Syst. Appl. Microbiol., 15: 52-58. KHAN A.W., PATEL G.B. 1991: Cellulose degrading by mesophilic anaerobic bacteria. In:Bio-
synthesis and Biodégradation of cellulose. Haigier C.H. and Weimer P. J. (red.), Marcel Dekker. New York: 355-375.
KIM C. H., KIM D. S. 1995: Purification and specificity of a specific endo-l,4-D -glucanase (Avicelase II) resembling exo-celobiohydrolase from Bacillus circulans. Enzym. Microb.
Technol. 17, 3: 248-254.
KUSZELEWSKI L., ŁABĘTOWICZ J. 1992: Trwałe doświadczenie nawozowe w Łyczynie (1960-1985). Roczn. Nauk Roln. ser. A: 81-106.
LOISEAU P., CHAUSSOD R., DELPY R., NEETESON J. J., HASSINK J., 1994: Soil microbial biomass and in situ nitrogen mineralization after 20 years of different nitrogen fertilization and forage cropping systems. Eur. J. Agronomy. 3, 4: 327-332.
LESCHINE S. B., HOLWELL K., CANALE-PAROLA E. 1988: Nitrogen-fixation by anaerobic cellulolytic bacteria. Science 242: 1157-1159.
PAUL J., VARMA A. K. 1993: Characterization of cellulose and hemicellulose degrading by
Bacillus from termite infested soil. Curr. Sei. 64. 4: 261-266.
VARDAVAKIS E. 1989: Seasonal fluctuations of aerobic, cellulolytic bacteria and cellulase and respiratory activities in a soil profile under a forest. Plant Soil 115: 145-150.
WEIMER P.J., ZEIKUS J. G. 1991: Fermentation of cellulose and cellobiose by Clostridium
thermocellum in the absence and presence of Methanobacterium thermoautotrophicum. Appl. Environ. Microbiol. 33: 289-297.
D r inż. Ew a Beata Górska
Z akład M ikrobiologii R olniczej,K atedra Nauk o Środowisku G lebow ym S G G W 02-528 W arszawa ul. Rakowiecka 26/30
