Amplifikacja DNA genów lub ich fragmentów koduj cych poszczególne bia ka

We wszystkich przeprowadzonych standardowych reakcjach PCR wykorzystano:

• polimeraz DNA Pwo lub polimeraz DNA WALK [Materia y 4.5];

• bufor do reakcji (10x st ony) dla odpowiedniej polimerazy [Materia y 4.6];

• trifosforany deoksynukleozydów (dNTP) [Materia y 4.6];

• roztwór 15 mM MgCl2[Materia y 4.6];

• odpowiednie startery.

Zastosowany profil temperaturowo-czasowy we wszystkich przeprowadzonych reakcjach PCR by podobny. Ró ni si temperatur przy czania starterów do miejsca komplementarnego matrycy oraz czasem wyd ania startera, który by uzale niony do d ugo ci amplifikowanego

produktu. Przyk adowy profil temperaturowo-czasowy przedstawiono w tabeli poni ej (kolorem niebieskim oznaczono temperatur i czas, które zmieniano w zale no ci od amplifikowanego produktu):

Temperatura

Temperatury przy czania starterów i czasy wyd ania dla poszczególnych amplifikowanych genów lub ich fragmentów zebrano w poni szej tabeli:

sag4 68 30 BglII i HindIII

Antygeny

powierzchniowe bsr4 66 45 BglII i HindIII

gra2ex1 62 30 BglII

gra2ex2 62 30 HindIII

gra2ex1ex2 62 45 BglII i HindIII

gra4 64 30 BglII i HindIII

gra5 66 30 BglII i HindIII

gra9ex1 65 30 BglII

gra9ex2 65 30 HindIII

Antygeny granul o du ej g sto ci

gra9ex1ex2 62 45 BglII i HindIII

mic1ex2 62 45 BglII i EcoRV

mic1ex3 64 30 EcoRV

mic1ex4 64 45 HindIII

mic1ex3ex4 64 45 EcoRV i HindIII

Antygeny mikronem

mic3 62 60 BglII i HindIII

Antygen roptrii rop1 60 60 BglII i HindIII

bag1ex1ex2 66 30 BglII

bag1ex3 66 30

-bag1ex4 66 30 HindIII

bag1ex3ex4 64 45 BglII i HindIII

Inne antygeny

mag1 64 35 BglII i HindIII

5.2.1. Antygeny powierzchniowe

• Amplifikacja DNA fragmentu genu sag4 - sk ad mieszaniny reakcyjnej:

Sk adniki Obj to [ l]

Matryca DNA T. gondii szczepu RH 1

Redestylowana woda ja owa 31,5

Bufor dla polimerazy DNA Pwo (10x st ony) 5

dNTP 5

Starter 1 - SAG4BglII 2

Starter 2 - SAG4HindIII 2

MgCl2 2,5

Polimeraza DNA Pwo 1

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50 l.

• Amplifikacja DNA fragmentu genu bsr4 - sk ad mieszaniny reakcyjnej:

Sk adniki Obj to [ l]

Matryca DNA T. gondii szczepu RH 1

Redestylowana woda ja owa 34

Bufor dla polimerazy DNA WALK (10x st ony) 5

dNTP 5

Starter 1 - BSR4BglII 2

Starter 2 - BSR4HindIII 2

Polimeraza DNA WALK 1

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50 l.

5.2.2. Antygeny granul o du ej g sto ci

• Amplifikacja DNA genu gra2:

§ amplifikacja DNA eksonu 1 genu gra2 (reakcja PCR1) - sk ad mieszaniny reakcyjnej taki sam jak w przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych starterów:

GRA2ex1BglII i GRA2ex1ex2);

§ amplifikacja DNA eksonu 2 genu gra2 (reakcja PCR2) - sk ad mieszaniny reakcyjnej taki sam jak w przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych starterów:

GRA2ex2 i GRA2ex2HindIII);

§ amplifikacja DNA gra2 (ekson 1 + ekson 2 / reakcja PCR3), zosta a przeprowadzono dwuetapowo:

1) otrzymanie matrycy do reakcji PCR – tzw. wyd anie wst pne zastosowany profil temperaturowo-czasowy

Temperatura [^oC] Czas [sekundy] Liczba cykli

94 300

64 40

72 300

1

sk ad mieszaniny reakcyjnej

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50µl.

2) reakcja PCR3 (po czenie eksonu 1 i eksonu 2 genu gra2) zastosowany profil temperaturowo-czasowy

Temperatura [^oC] Czas [sekundy] Liczba cykli

94 300

Matryca DNA uzyskana w wyniku wyd ania wst pnego

1

Redestylowana woda ja owa 31,5

Bufor dla polimerazy DNA Pwo (10x st ony) 5

dNTP 5

Starter 1 - GRA2ex1BglII 2

Starter 2 - GRA2HindIII 2

MgCl2 2,5

Polimeraza DNA Pwo 1

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50µl.

• Amplifikacja DNA fragmentu genu gra4 i gra5 - sk ad mieszanin reakcyjnych taki sam jak przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem par zastosowanych starterów: GRA4BglII i GRA4HindIII oraz GRA5BglII i GRA5HindIII).

• Amplifikacja DNA genu gra9:

§ amplifikacja DNA eksonu 1 (reakcja PCR1) oraz DNA eksonu 2 (reakcja PCR2) genu gra9 – sk ad mieszanin reakcyjnych by taki sam jak w przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem par zastosowanych starterów: GRA9BglII i GRA9exI oraz GRA9ex2 i GRA9HindIII);

Sk adniki Obj to [ l]

Produkt PCR 1 1

Produkt PCR 2 1

Bufor dla polimerazy DNA Pwo (10x st ony) 5

dNTP 5

MgCl2 2,5

Redestylowana woda ja owa 34,5

Polimeraza DNA Pwo 1

§ amplifikacja DNA gra9 (po czenie eksonów 1 i 2 - reakcja PCR3) zosta a wykonana dwuetapowo w analogiczny sposób jak po czenie eksonu 1 i 2 genu gra2 (z wyj tkiem zastosowanych starterów: GRA9BglII i GRA9HindIII).

5.2.3. Antygen roptrii

• Amplifikacja DNA fragmentu genu rop1 - sk ad mieszaniny reakcyjnej by taki sam jak w przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych starterów: ROP1BglII i ROP1HindIII).

5.2.4. Antygeny mikronem

• Amplifikacja DNA genu mic1

§ amplifikacja DNA eksonu 2 (reakcja PCR1), DNA eksonu 3 (reakcja PCR2), DNA eksonu 4 (reakcja PCR3) genu mic1 -sk ady mieszanin reakcyjnych takie same jak w przypadku amplifikacji genu bsr4 (z wyj tkiem zastosowanych par starterów:

MIC1ex2BglII i MIC1ex2EcoRV, MIC1ex3EcoRV i MIC1ex3ex4 oraz MIC1ex4 i MIC1ex4HindIII);

§ amplifikacja DNA fragmentu genu mic1 (po czenie eksonu 3 i 4 -reakcja PCR4) zosta a wykonana dwuetapowo w analogiczny sposób jak po czenie eksonu 1 i 2 genu gra2 (z wyj tkiem zastosowanych starterów: MIC1ex3EcoRV i MIC1ex4HindIII).

• Amplifikacja DNA genu mic3 - sk ad mieszaniny reakcyjnej taki sam jak przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych starterów: MIC3BglII i MIC3HindIII).

5.2.5. Inne antygeny

• Amplifikacja DNA genu mag1 - sk ad mieszaniny reakcyjnej taki sam jak przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych starterów: MAG1BglII i MAG1HindIII).

• Amplifikacja DNA genu bag1:

§ amplifikacja DNA eksonu 1 i 2 (reakcja PCR1), eksonu 3 (reakcja PCR2) oraz eksonu 4 (reakcja PCR3) genu bag1 - sk ad

mieszanin reakcyjnych taki sam jak przypadku amplifikacji fragmentu genu sag4 (z wyj tkiem zastosowanych par starterów:

BAG1BglII i BAG1ex1ex2, BAG1ex3I i BAG1ex3II, BAG1ex4I i BAG1HindIII);

§ amplifikacja DNA fragmetnu genu bag1 (po czenie eksonów 3 i 4 - reakcja PCR4) zosta a przeprowadzona dwuetapowo (zastosowane profile temperaturowo czasowe by y analogiczne jak w przypadku czenia eksonu 1 i 2 genu gra2, natomiast ró ne by y sk ady mieszanin reakcyjnych):

1) otrzymanie matrycy do reakcji PCR – tzw. wyd anie wst pne sk ad mieszaniny reakcyjnej

Sk adniki Obj to [ l]

Produkt PCR 2 (DNA – ekson 3 bag1) 7

Produkt PCR 3 (DNA – eskon 4 bag1) 7

Bufor dla polimerazy DNA WALK (10x st ony) 5

dNTP 5

Redestylowana woda ja owa 25

Polimeraza DNA WALK 1

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50 l.

2) reakcja PCR4 (po czenie eksonu 3 i eksonu 4 genu bag1) sk ad mieszaniny reakcyjnej

Sk adniki Obj to [ l]

Matryca DNA uzyskana w wyniku wyd ania wst pnego

2

Redestylowana woda ja owa 33

Bufor dla polimerazy DNA WALK (10x st ony) 5

dNTP 5

Starter 1 - BAG1ex3I 2

Starter 2 - BAG1HindIII 2

Polimeraza DNA WALK 1

Obj to ca kowita mieszaniny reakcyjnej – 50 l.

5.3. Techniki wykorzystywane przy klonowaniu fragmentów DNA