Opracowane warunki analizy HPLC-UV w sprz eniu z detektorami DAD i MS zastosowano do identyfikacji zwi zków flawonoidowych w wyci gu metanolowym z nasion kozieradki pochodzenia krajowego. W procesie identyfikacji poszczególnych C-glikozyloflawonów uwzgl dniono warto ci czasu retencji (tR), przebieg widma UV i widma MS, otrzymanych odpowiednio z u yciem detektora DAD oraz detektora masowego. Jako technik jonizacji zastosowano rozpylanie w polu elektrycznym (ESI - Electrospray Ionisation). Analizowano widma ESI-MS, otrzymane w trybie jonów dodatnich i ujemnych oraz wykorzystano technik monitorowania wybranych jonów SIM (Selected Ion Monitoring) w trybie jonów dodatnich i ujemnych (ryc. 28).
Rozdzielenia metod HPLC-DAD-ESI-MS prowadzono wobec 11 zwi zków wzorcowych: witeksyny, izowiteksyny, orientyny, izoorientyny, wiceniny-1, wiceniny-2, wiceniny-3, szaftozydu, izoszaftozydu, 7-O-glukozydu izowiteksyny i 2"-O-ramnozydu witeksyny (ryc. 27). Otrzymane dane chromatograficzne i spektralne identyfikowanych zwi zków porównano z opisanymi w literaturze [66, 143, 353, 435, 456, 574].
Ryc.27. Chromatogram 1D HPLC-DAD mieszaniny wzorców C-glikozyloflawonów: 1 – wicenina-2, 2+2a – wicenina-1+7-O-glukozyd izowiteksyny, 3a+3b – izoorientyna+orientyna, 4a+4b – izoszaftozyd+szaftozyd, 6 – witeksyna, 7+7a – wicenina-3+2"-O-ramnozyd witeksyny, 8 – izowiteksyna. Kolumna Kinetex C-18 (100 mm x 2,1 mm x 2,6 µm), elucja gradientowa według programu I, UV −330 nm.
Ryc.28. Chromatogram 1D HPLC-DAD-ESI-MS wyci gu metanolowego z nasion kozieradki pospolitej pochodzenia krajowego:
A − chromatogram HPLC-DAD; detekcja UV −330 nm
B − chromatogram całkowitego pr du jonowego (TIC), otrzymany w trybie jonów dodatnich (TIC (+))
C-H − chromatogramy jonów przy m/z 433, m/z 449 m/z, m/z 565, m/z 535, m/z 579 i m/z 595.
Tab.7. Dane spektralne i chromatograficzne C-glikozyloflawonów zidentyfikowanych w nasieniu kozieradki pospolitej metod HPLC-DAD-ESI-MS.
Zwi zek/
Pik HPLC
UVmax [M+H]+/ [M-H]- / [M-H+TFA]- tR (min) Zwi zek zidentyfikowany
1 269,333 595 / 593 / 707 22,67 wicenina-2
2 269, 333 565 / 563 / 677 28,98 wicenina-1
3a/3b 254sh, 269, 346 449 / 447 / 561 31,07 izoorientyna / orientyna 4a/4b 270, 334 565 / 563 / 677 31,45 izoszaftozyd / szaftozyd
5 270, 335 565 / 563 / 677 32,32 di-C-(6/8)-heksozylo-pentozyd apigeniny
6 267, 336 433 / 431 / 545 36,96 witeksyna
7 269, 333 565 / 563 / 677 38,76 wicenina-3
8 268, 335 433 / 431 / 545 40,48 izowiteksyna
9 270, 335 535 / 533 / 647 40,85 di-C-(6/8)-pentozyd apigeniny 10 270, 335 535 / 533 / 647 43,74 di-C-(6/8)-pentozyd apigeniny 11 271, 335 535 / 533 / 647 47,50 di-C-(6/8)-pentozyd apigeniny 12 269, 333 535 / 533 / 647 48,67 di-C-(6/8)-pentozyd apigeniny 13 269, 333 535 / 533 / 647 51,30 di-C-(6/8)-pentozyd apigeniny 14 255sh, 269, 315 595 / 593 / 707 59,41 ester p-kumarowy orientyny / izoorientyny 15 269, 315 579 / 577 / 691 61,79 ester p-kumarowy witeksyny / izowiteksyny
Na podstawie otrzymanych widm UV 13 spo ród 15 rozdzielonych zwi zków zidentyfikowano wst pnie jako pochodne apigeniny (zwi zki 1, 2, 4, 5-13 oraz 15), uwzgl dniaj c obecno dwóch maksimów absorpcji przy długo ciach fali max 270 nm (I maksimum) oraz max 330 nm (II maksimum) (zwi zki 1, 2, 4, 5-13) lub max 270 nm (I maksimum) oraz max 315 nm (zwi zek 15) [353].
Kolejne dwa zwi zki (3 i 14) rozpoznano jako pochodne luteoliny, charakteryzuj ce si wyst powaniem w widmach UV przegi cia (tzw. shoulder) przy długo ci fali sh-254-255 nm, obok dwóch maksimów absorpcji przy długo ci fali max
269 nm (I maksimum) i max 346 nm (II maksimum) (zwi zek 3) lub max 269 nm (I maksimum) i max 315 nm (II maksimum) (zwi zek 14), [298].
Uwzgl dniaj c obecno przesuni cia hipsochromowego II maksimum absorpcji w widmach zwi zków 14 i 15 o warto ci max 32 nm, wskazuj cego na obecno wi zania estrowego C-glikozyloflawonu z reszt kwasu fenolowego [297], zwi zki te rozpoznano jako estry C-glikozyloflawonów, odpowiednio: apigeniny (zwi zek 15) oraz luteoliny (zwi zek 14).
Na chromatogramie jonu pseudomolekularnego przy m/z 595 [M+H]+ (w trybie jonów dodatnich) i deprotonowanego jonu molekularnego przy m/z 593 [M-H]- (w trybie jonów ujemnych) obserwowano obecno dwóch pików o tR 22,67 min. (zwi zek 1) oraz tR 59,41 min. (zwi zek 14). Dodatkowo na widmach ESI-MS, otrzymanych w trybie jonów ujemnych odnotowano obecno adduktu z kwasem trifluorooctowym (TFA) przy m/z 707 [M-H+114]-. Warto tR zwi zku 1 była zgodna z warto ci tR
wzorcowej wiceniny-2 (6,8-di-C-glukozydu apigeniny). Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych i spektralnych zwi zek 1 zidentyfikowano jako wicenin -2, natomiast zwi zek 14 jako ester p-kumarowy orientyny lub izoorientyny [456, 574].
W widmach ESI-MS zwi zku 15 (tR 61,79 min) w zastosowanych warunkach jonizacji obserwowano obok sygnału jonu pseudomolekularnego przy m/z 595 [M+H]+ w trybie jonów dodatnich oraz w trybie jonów ujemnych deprotonowanego jonu molekularnego przy m/z 593 [M-H]- i sygnał jonu przy m/z 707, odpowiadaj cy adduktowi z TFA [M-H+114]-. Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych i spektralnych zwi zek 15 zidentyfikowano jako ester p-kumarowy witeksyny/izowiteksyny [456, 511, 574].
W widmach masowych zwi zków 6 (tR 69,96 min) i 8 (tR 40,48 min) obserwowano sygnał jonu pseudomolekularnego przy m/z 433 [M+H]+ (w trybie jonów dodatnich) i deprotonowanego jonu molekularnego przy m/z 431 [M-H]- (w trybie jonów ujemnych), odpowiadaj cego masie cz steczkowej mono-C-glukozydów apigeniny oraz jonu przy m/z 545, odpowiadaj cy adduktowi z TFA [M-H+114]- (w trybie jonów ujemnych). Warto ci tR zwi zków 6 i 8 były zgodne z warto ciami tR wzorcowych
witeksyny i izowiteksyny, odpowiednio. Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych i spektralnych zwi zki 6 i 8 zidentyfikowano jako odpowiednio:
witeksyn (8-C-glukozyd apigeniny) oraz i izowiteksyn (6-C-glukozyd apigeniny).
W widmie ESI-MS zwi zku 12 obserwowano sygnały jonu pseudomolekularnego przy m/z 535 [M+H]+ w trybie jonów dodatnich oraz w trybie jonów ujemnych deprotonowanego jonu molekularnego przy m/z 533 [M-H]- obok sygnału przy m/z 647, odpowiadaj cego adduktowi z TFA [M-H+114]-. Identyfikacj zwi zków 9,10,11,12 i 13 (tR 40,85 min, tR 43,74 min, tR 47,50 min, tR 48,67 min i tR
51,30 min, odpowiednio) oparto o technik SIM (Selected Ion Monitoring), monitoruj c jony m/z 535 [M+H]+ (w trybie jonów dodatnich), m/z 533 [M-H]- (w trybie jonów ujemnych) oraz m/z 647 [M-H+114]- (w trybie jonów ujemnych). Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych (warto ci tR) i spektralnych (warto ci m/z, widmo UV), zwi zki 9-13 zidentyfikowano jako di-C-(6/8)-glikozydowe pochodne apigeniny, zawieraj ce w cz steczce dwie pentozy (tab. 7).
Na otrzymanym technik SIM chromatogramie jonu molekularnego m/z 565 wykazano obecno czterech pików o czasach retencji: tR 28,98 min (zwi zek 2), tR
31,45 min (zwi zek 4), tR 32,32 min (zwi zek 5) oraz tR 38,76 min (zwi zek 7). W widmach ESI-MS otrzymanych w trybie jonów dodatnich zwi zków 2, 4, 5 i 7 obserwowano sygnały jonów pseudomolekularnych przy m/z 565 [M+H]+. Natomiast w widmach ESI-MS otrzymanych w trybie jonów ujemnych obserwowano sygnały deprotonowanych jonów molekularnych przy m/z 563 [M-H]- oraz sygnały przy m/z 677 [M-H+114]-, odpowiadaj ce adduktom z TFA. Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych i spektralnych zwi zki 2, 4, 5 i 7 wst pnie identyfikowano jako di-C-heksozylopentozydy apigeniny. Ponadto warto ci tR zwi zków 2 i 7 były zgodne z warto ciami tR wzorcowych wiceniny-1 (6-C-ksylofuranozylo-8-C-galaktozyd apigeniny) oraz wiceniny-3 (6-C-glukopiranozylo-8-C-ksylofuranozyd apigeniny). Na podstawie uzyskanych danych chromatograficznych i spektralnych (warto ci m/z, tR, widmo UV) zwi zek 2 zidentyfikowano jako wicenin -1, zwi zek 7 jako wicenin -3, zwi zek 5 jako di-C-heksozylo-pentozyd apigeniny. Identyfikacja zwi zku 4 w warunkach opracowanej metody nie była mo liwa ze wzgl du na identyczne: warto ci tR, widmo UV i warto ci m/z jonów molekularnych nierozdzielonych substancji wzorcowych - szaftozydu (4b) i izoszaftozydu (4a).
W widmie masowym zwi zku 3 obserwowano jon pseudomolekularny przy m/z 449 [M+H]+ w trybie jonów dodatnich i deprotonowany jon molekularny przy m/z 447 [M-H]- oraz addukt z TFA przy m/z 561 [M-H+114]- w trybie jonów ujemnych. Podobnie, jak w przypadku zwi zku 4, równie identyfikacja zwi zku 3 nie była mo liwa ze
wzgl du na identyczne: warto
nierozdzielonych zwi zków wzorcowych: orientyny (3b) i izoorientyny (3a) Na otrzymanym chromatogramie HPLC obserwowano koelu 3a+3b oraz 4a+4b (tab
wyci gach z nasion koziera
Kolejne próby separacji zwi rozdzielenia pozostałych zwi
Dlatego postanowiono w dalszej cz
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (2D HPLC).
orientyny i izoorientyny w badanej matrycy analizie tych zwi zków w matrycach ro DAD-ESI-MS.
Ryc.29. Chromatogram
izoorientyny oraz ich widma ESI
(100 mm x 2,1 mm x 2,6 µm), faza ruchoma 32% miesza rozdzielenia pozostałych zwi zków flawonoidowych obecnych w nasionach kozieradki Dlatego postanowiono w dalszej cz ci pracy zastosowa techniki dwuwymiarowej
hromatografii cieczowej (2D HPLC).
W otrzymanych w trybie jonów ujemnych widmach ESI orientyny i izoorientyny (ryc. 29), obserwowano ró nice w intensywno
deprotonowanych jonów molekularnych przy m/z 447 [M-H]−oraz ich adduktów z +114]-, mianowicie: 20% i 100% odpowiednio dla orientyny izoorientyny oraz 100% i 60% odpowiednio dla orientyny i izoorientyny. Odnotowane
nice w charakterystyce widm ESI-MS w trybie jonów ujemnych ułatwiły identyfikacj y i izoorientyny w badanej matrycy ro linnej i mog by
zków w matrycach ro linnych ró nego pochodzenia metod
1D HPLC-DAD mieszaniny zwi zków wzorcowych: orientyny i oraz ich widma ESI-MS, otrzymane w trybie jonów ujemnych. K
(100 mm x 2,1 mm x 2,6 µm), faza ruchoma 32% mieszaniny ACN:woda:TFA (50:50:0,1, 330 nm.
jonów molekularnych zków wzorcowych: orientyny (3b) i izoorientyny (3a).
cj pików zwi zków yny i izoorientyny. Odnotowane MS w trybie jonów ujemnych ułatwiły identyfikacj
by wykorzystane w nego pochodzenia metod
HPLC-zków wzorcowych: orientyny i rzymane w trybie jonów ujemnych. Kolumna Kinetex niny ACN:woda:TFA (50:50:0,1, v/v/v)