Analiza jakościowa flawonoli, flawan-3-oli oraz kwasów fenolowych

We frakcjach octanu etylu wszystkich badanych owoców zidentyfikowano szereg związków z grup flawonoli (piki 21-24, 26, 30-32), flawan-3-oli (piki 5, 6, 8, 9, 10) oraz kwasów fenolowych (piki 1, 3, 7).

W widmach ESI-MS, w trybie jonów dodatnich, obserwowano obecność jonów pseudomolekularnych kwasów fenolowych (galusowego, protokatechowego i kawowego), flawonoidów (hiperozydu, rutyny, izokwercetyny, 3-O-glukuronidu kwercetyny, 3-O-glukuronidu kemferolu, kwercetyny, tilirozydu i kemferolu) oraz flawan-3-oli (katechiny, epikatechiny, procyjanidyny B₁ i B₂). Natomiast w trybie jonów ujemnych zarejestrowano jony deprotonowane elagotanin (izomerów sangwiny H-10, galloilo-bis-HHDP-glukozy, izomeru sangwiny H-6, lambertianiny C, sangwiny H-2, sangwiny H-6), epigalokatechiny, kwasu elagowego oraz jego pentozydów i acetylopentozydów (Tab. 13).

Analiza LC-DAD/ESI-MS wobec związków wzorcowych, ujawniła obecność kwasu galusowego (pik 1), protokatechowego (pik 3), kawowego (pik 7), izokwercetyny (pik 23), 3-O-glukuronidu kwercetyny (pik 24), 3-O-3-O-glukuronidu kemferolu (pik 26) oraz kemferolu (pik 32) we wszystkich badanych owocach. Kwercetyna (pik 30) była obecna we wszystkich analizowanych odmianach z wyjątkiem owoców R. idaeus ‘Polka’. Wszystkie odmiany charakteryzowały się również obecnością szeregu pentozydów (piki 18, 20, 25) oraz acetylopentozydów kwasu elagowego (piki 27-29). Hiperozyd (pik 21) i rutyna (pik 22) były obecne w śladowych ilościach, podczas gdy obecność tilirozydu (pik 31) wykazano tylko w odmianach ‘Laszka’, ‘Polana’ oraz ‘Litacz’ (Tab. 13, Ryc. 18 B).

Izokwercetyna oraz 3-O-glukuronid kwercetyny koeluowały w czasie t_R 28.9 min, co jest znanym problemem w rozdzieleniach LC obydwu związków [26], i zostały zidentyfikowane przy

86 użyciu techniki SIM. Z dwóch flawonoli, 3-O-glukuronid kwercetyny był związkiem dominującym w większości badanych odmian, co jest zgodne z danymi literaturowymi [26, 82, 233, 235]. Owoce odmian R. idaeus ‘Pokusa’, ‘Polana’, ‘Polesie’, ‘Polka’, ‘Poranna Rosa’ i R. occidentalis ‘Litacz’ wyróżniały się wyższą intensywnością pików obydwu związków, natomiast w pozostałych odmianach były one znacznie niższe (Tab.

13, Ryc. 18 B).

W owocach sześciu analizowanych odmian (R. idaeus ‘Benefis’, ‘Beskid’, ‘Heritage’, ‘Laszka’,

‘Willamette’, R. occidentalias ‘Litacz’) potwierdzono obecność katechiny (pik 6) oraz epikatechiny (pik 9), przy czym dominującym związkiem była epikatechina (wyższa intensywność piku). Pozostałe pięć odmian (R. idaeus ‘Glen Ample’, ‘Polka’, ‘Pokusa’, ‘Polana’, ‘Polesie’) charakteryzowało się obecnością epikatechiny oraz brakiem bądź śladowymi ilościami katechiny, podczas gdy w owocach R. idaeus

‘Poranna Rosa’ nie zidentyfikowano żadnego z dwóch wymienionych flawan-3-oli (Tab. 13, Ryc. 18 B).

Dane literaturowe o ilościowym stosunku katechiny do epikatechiny w owocach malin są sprzeczne, przy czym niektóre są zgodne z przedstawionymi powyżej wynikami [235], podczas gdy inne donoszą o zbliżonych poziomach zawartości obydwu związków [236].

W owocach R. idaeus ‘Benefis’, ‘Beskid’, ‘Glen Ample’, ‘Poranna Rosa’, ‘Polana’ oraz ‘Polesie’

wykryto obecność procyjanidyny B2 (pik 8), jakkolwiek w odmianach ‘Poranna Rosa’ oraz ‘Polana’ była ona obecna tylko w śladowych ilościach. W owocach R. occidentalis ‘Litacz’ zidentyfikowano zarówno procyjanidynę B₂ (pik 5) jak i B₁, co jest pierwszą informacją o występowaniu obydwu dimerycznych pochodnych flawan-3-oli w owocach maliny czarnej (Tab. 13, Ryc. 18 B).

Pik odpowiadający epigalokatechinie (pik 10) zidentyfikowano przy t_R 17.6 min w owocach wszystkich badanych odmian maliny czerwonej. Dane widm UV oraz ESI-MS sugerują, że pik 10, obok epigalokatechiny, prawdopodobnie zawiera jeszcze dwa koeluujące związki (pik 11 i 12). Związek odpowiadający pikowi 11 zidentyfikowano jako pochodną procyjanidyny, na podstawie widma UV (λmax – 279 nm) oraz jonu pseudomolekularnego w widmie ESI-MS (m/z 579 [M+H]⁺) charakterystycznych dla procyjanidyn. Pik 12 zidentyfikowano jako galoilo-bis-HHDP-glukozę na podstawie charakterystycznego dla związku jonu molekularnego w widmie ESI-MS (m/z 934 [M-H]^-) oraz charakterystycznych dla elagotanin maksimów absorpcji w widmie UV (λ_max – 250, 270 nm) (Tab.

13). Obserwowano również wyraźne różnice w intensywności piku odpowiadającego koeluującym związkom 10-12 pomiędzy badanymi ekstraktami z owoców. Była ona wyższa w owocach R. idaeus

‘Pokusa’ oraz ‘Polesie’, niewiele niższa w przypadku R. idaeus ‘Heritage’, ‘Laszka’ oraz ‘Willamete’

natomiast znacznie niższa w pozostałych odmianach. W przeciwieństwie do koeluujących izokwercetyny i 3-O-glukuronidu kwercetyny, określenie które ze związków dominowały w piku 10-12 nie było możliwe przy użyciu techniki SIM, ponieważ dla związku 11 odnotowano jony

87 pseudomolekularne tylko w jonizacji dodatniej, natomiast dla pozostałych tylko w jonizacji ujemnej.

Jednocześnie na chromatogramie HPLC R. occidentalis ‘Litacz’, związek o wartości tR 17.7 min zidentyfikowano wstępnie jako pochodną procyjanidyny (Tab. 13, Ryc. 18 B).

Dla wszystkich badanych odmian odnotowano zbliżone poziomy 3-O-glukuronidu kemferolu (pik 26), z wyjątkiem R. idaeus ‘Beskid’ oraz ‘Heritage’, w których były one znacznie niższe.

Na chromatogramie HPLC wyciągu z owoców R. occidentalis ‘Litacz’, w czasie t_R 19.9 min, obserwowano pik o wysokiej intensywności (pik 13). Jego widmo UV było zbliżone do widma UV katechiny, co może sugerować że jest on pochodną flawan-3-olu, natomiast w widmie MS nie odnotowano obecności sygnałów jonów molekularnych i fragmentacyjnych które pozwoliłyby na wstępną identyfikację związku (Tab. 13, Ryc. 18 B).

W przeciwieństwie do powyższych wyników, Jakobek i wsp. [236] wykryli obecność kwasu ferulowego oraz p-kumarowego w owocach maliny właściwej, a nie zidentyfikowali rutyny oraz kemferolu. Natomiast w zgodzie z powyższymi wynikami Mullen i wsp. [82] oraz Mazur i wsp. [26]

odnotowali obecność rutyny, 3-O-glukuronidu kwercetyny, izokwercetyny, 3-O-glukuronidu kemferolu oraz glikozydowych pochodnych kwasu elagowego jako składników owoców R. idaeus odmian ‘Glen Ample’, ‘Octavia’, ‘Glen Magna’ i ‘Malling Hestia’. Na wykazane rozbieżności w składzie chemicznym badanych owoców maliny mogły wpływać takie czynniki jak odmiana, warunki uprawy czy też okres owocowania, szczególnie w przypadku odmian powtarzających owocowanie [26, 28, 239, 245, 246].

Podsumowując wyniki analiz HPLC, przeprowadzone badania dostarczają istotnych informacji o składzie chemicznym owoców R. idaeus i R. occidentalis w zakresie rzadziej identyfikowanych związków fenolowych. Wszystkie związki rozpoznane w owocach R. idaeus były wcześniej identyfikowane jako ich składniki. W zgodzie z danymi literaturowymi w owocach R. occidentalis oznaczono sangwinę H-6 i kwas elagowy, ale również izomer sangwiny H-6 i galoilo-bis-HHDP-glukozę, wcześniej identyfikowane jedynie w ekstraktach z pestek maliny czarnej [244]. Wyniki analizy są pierwszymi doniesieniami o obecności szeregu związków w owocach R. occidentalis, włączając izomery sangwiny H-10, pentozyd i acetylopentozydy kwasu elagowego, kwas protokatechowy, epikatechinę, epigaloaktechinę, procyjanidynę B1 i B₂, izokwercetynę, 3-O-glukuronid kwercetyny, kemferol oraz 3-O-glukuronid kemferolu.

Porównując otrzymane wyniki z wcześniej opublikowanymi [19], można stwierdzić że owoce malin charakteryzuje większe zróżnicowanie składu chemicznego w zakresie kompozycji związków antocyjanowych, natomiast kompozycje pozostałych związków należących do polifenoli i prostych fenoli są prawie identyczne w zakresie jakościowym, i można przypuszczać że również w zakresie ilościowym. Konsekwencją tego twierdzenia może być wniosek, że wymienione grupy związków

88 pozostają bez wpływu na wykazywane wcześniej różnice w aktywności biologicznej (szczególnie aktywności przeciwzapalnej) [19], i jedyny wyjątek mogą stanowić odmiany bogate w izomer sangwiny H-6 (pik 14).