Analiza metagenomu

W celu oceny wpływu bioaugmentowanych mikroorganizmów na naturalną mikroflorę badanych układów wodnych, przeprowadzono analizy zmian puli genetycznej bakterii zamieszkujących badane habitaty. Wykorzystano do tego zaawansowane metody sekwencjonowania metagenomu próbek wodnych przed wprowadzeniem mikroorganizmów eksponowanych na węglowodory (E) lub nieeksponowanych (wzrastających na podłozu z glukozą – NE) oraz w wybranych odstępach czasu po bioaugmentacji.

Wyniki przedstawione na Rysunku III.21 wskazuj na dominujący udział bakterii w metagenomie ze wszystkich wyizolowanych próbek. Najmniejszą różnorodnością charakteryzowały się mikroorganizmy pobrane z próbek wody jeziornej W1 (po 1 dniu inkubacji z olejem napędowym), gdzie dominował typ Proteobacteria, klasa Gammaproteobacteria i mikroorganizmy z gatunku Pseudomonas (Pseudomonas moraviensis 57,11% oraz Pseudomonas miguale 20,68%) a pozostałe sklasyfikowane mikroorganizmy stanowiły łącznie 4,33%.

W wyniku bioaugmentacji próbek wody jeziornej mikroorganizmami nieeksponowanymi oraz eksponowanymi na węglowodory można zauważyć znaczący wzrost bioróżnorodności na wszystkich poziomach taksonomicznych. Należy również zwrócić uwagę, że różnorodność w wyziolowanych próbkach zmieniała się w czasie o czym śwaidczą badania przeprowadzane dla próbek pobieranych po 14 i 60 dniach prowadzenia procesu degradaji oleju napędowego przez układy zawierające wodę jeziorną i bioaugmentowane mikrooganizmy (Rysunki III. 21 oraz S1).

Rysunek III. 21. Względna liczebność mikroorganizmów określoanna podstawie analizy metgenomu próbek środowiskowych pobranych ze zbiornika słodkowodnego w Drawskim Parku Narodowym przed bioaugmentacją, 60 dni po bioiaugmentacji konsorcjum mikroorganizmów nieeksponowanych lub 60 dni po bioaugmentacji konsorcjum mikroorganizmów poddanych 12 miesięcznej ekspozycji na węglowodory aromatyczne, alifatyczne lub olej napędowy

Naturalne konsorcjum, woda W1

Naturalne konsorcjum wody W1 bioaugmentowane konsorcjum mikroorganizmów

nieeksponowanych na węglowodory

Naturalne konsorcjum wody W1 bioaugmentowane konsorcjum mikroorganizmów eksponowanych na węglowodory

Typ Klasa Rząd Rodzina Rodzaj

Mikroorganizmy z rodzaju P. moraviensis dominowały tylko w próbkach wody W1 biougmentowanych bakteriami nieeksponowanymi po 14 dniach (16,58%), lecz ich liczba była znacznie mniejsza niż w próbie kontrolnej. Poza nimi w próbkach W1+NE zidentyfikowano jeszcze bakterie Achromobacter insolitus (15,45%), Pseudomonas miguale (9,68%) i Pseudomonas pseudoalcaligenes (4,71%) (Rysunek S1). Liczebność wszystkich pozostałych sklasyfikowanych bakterii wynosiła 17,99% całego wyizolowanego genomu, natomiast 35,6% DNA wyizolowanych bakterii nie zostało sklasyfikowane na poziomie gatunkowym (Rysunek S1).

W próbkach pobranych z tych samych układów po 60 dniach prowadzenia procesu biodegradacji nastąpiło znaczące przebudowanie konsorcjum, gdyż znaczna część wyizolowanego DNA nie została przypisana do żadnego gatunku (43,94%), a spośród zidentyfikowanych szczepów dominowały mikrooganizmy z gatunków Caulobacter crescentus (8,63%), Azospirillum rugosum (5,67%), Phaeospirillum fulvum (5,44%) oraz Variovorax paradoxus (4,92%). Spośród prawie 500 pozostałych zidentyfikowanych bakterii, udział żadnego z nich nie przekroczył 5% (Rysunek III.21).

W przypadku bioaugmentacji wody W1 bakteriami poddanymi 12-miesięcznej ekspozycji na węglowodory największe zróżnicowanie mikrobiologiczne zaobserwowano również w próbkach pobranych z badanych układów po 60 dniach (Rysunek III. 21). Po tym czasie na poziomie gatunkowym zidentyfikowano bakterie należące do 476 gatunków, co stanowi istotny wzrost bioróżnorodności w porównaniu do 390 bakterii przyporządkowanych na tym poziomie taksonomicznym w próbkach pobranych po 14 dniach. Po 2 tygodniach prowadzenia procesu bioremediacji w próbakch W1+E dominowały bakterie z rodzaju Pseudomonas (P. plecoglossicida 22,82%), zauważalny był również udział szczepów P. moraviensis (4,98%), P. miguale (1,99%), dominujących w próbkach wody nie poddawanej bioaugmentacji (Rysunek S1). Skład konsorcjum został jednak znacząco przebudowany w czasie trwania procesu rozkładu zanieczyszczeń, gdyż w próbkach pobranych po 60 dniach bakterie P. plecoglossicida stanowiły już zaledwie 3,35% całego wyizolwanego metagenomu.

Dominowały zaśmikroorganizmy Hydrocarboniphaga effusa (10,8%), Sphingophyxis ginsengisoli (9,85%) oraz Prosthecobacter dejongeli (5,38%). Zwiększył się również udział procentowy mikrooganizmów, które nie zostały sklasyfikowane na poziomie gatunkowym z 28,51% po 14 dniach do 41,23% po 60 dniach, co również świadczy o dużej bioróżnorodności badanych próbek (Rysunek III. 21).

Próbki pobrane z Jeziora Kierskiego (W2) przed bioaugmentacją charakteryzowały się większą różnorodnością mikrobiologiczną niż próbki pobrane ze zbiornika w Drawieńskim Parku Narodowym po 1 dniu inkubacji z olejem napędowym (Rysunek III.22). W pobranych ze zbiormika W2 próbkach zdecydowanie dominowały mikroorganizmy z rodzaju Pseudomonas, stanowiąc ponad 70% całego wyizolowanego genomu (P. mendocina 23,24%, P. tremae 19,9%, P. putida 11,26%, P. alcaligenes 3,25%, P. xanthomarina 1,55% oraz P. lundensis 1,05%). Poza nimi zauważalny był również udział gatunku Stenotrophomonas retroflexus (11,26%).

Po bioaugmentacji wody W2 mikroorganizmami nieeksponowanymi udział bakterii z rodzaju Pseudomonas systematycznie się zmniejszał stanowiąc 53,62% bakterii po 14 dniach oraz 29,61% po 60 dniach procesu biodegradacji (Rysunek III.22 oraz S2). W obu próbkach pobranych po wskazanych odstępach czasu dominował gatunek P. aeruginosa (odpowiednio 34,34% po 14 dniach i 17,54% po 60 dniach). W próbkach pobranych po 60 dniach zmniejszał się także udział bakterii Stenotrophomonas retroflexus (z 13,53% do 1,91%) oraz P. ottidis (z 3,57% do 2,89%). Zaobserwowano również wzrost w czasie liczby bakterii niesklasyfikowanych na poziomie gatunkowym, z 28,58% do 41,50% oraz bakterii Azospirillum palatum (z 1,51% do 7,53%) (Rysunek III.22).

W porównaniu do próbek bioaugmentowanych mikroorganizmami nieeksponowanymi, w układach zawierających wodę W2 i bakterie poddane wcześniejszej ekspozycji na węglowodory (W2+E) w stosunkowo niewielkim stopniu zmienił się udział mikroorganizmów z rodzaju Pseudomonas (68,79% po 14 dniach i 70,65% po 60 dniach w porównaniu do 71,16% w wyjściowym mikrobiomie) (Rysunki III. 22 oraz S2). Niewielki jest też, w porównaniu do innych próbek pobieranych po 60 dniach udział bakterii, które nie zostały sklasyfikowane na poziomie gatunkowym (23%). Pomimo mniejszego zróżnicowania gatunkowego próbek, całkowita bioróżnorodność układów 14 i 60 dni po bioaugmentacji zmieniała się w stosunku do układu wyjściowego, na co wskazują wzrastające ilości wszystkich mikroorganizmów zidentyfikowanych na poziomie gatunku, które wynosiły, odpowiednio, 279 dla mikrobiomu wody W2 przez bioaugmantacją; 314 dla mikrobiomu 14 dni po bioaugmentacji oraz 397 dla próbek pobranych 60 dni po bioaugmentcji.

Rysunek III. 22. Względna liczebność mikroorganizmów określona na podstawie analizy metagenomu próbek środowiskowych z uwzględnieniem różnych poziomów taksonomicznych. Woda pobrana z Jeziora Kierskiego (W2) przed bioaugmentacją, 60 dni po bioaugmentacji konsorcjum mikroorganizmów poddanych 12-miesięcznej ekspozycji na węglowodory aromatyczne, alifatyczne lub olej napędowy

Naturalne konsorcjum, woda W2

Naturalne konsorcjum wody W2 bioaugmentowane konsorcjum mikroorganizmów

nieeksponowanych na węglowodory

Naturalne konsorcjum wody W2 bioaugmentowane konsorcjum mikroorganizmów eksponowanych na węglowodory

Typ Klasa Rząd Rodzina

Uzyskane dla wszystkich badanych metagenomów wyniki wskazują na znaczący, korzystny wpływ bioaugmentowanych mikroorganizmów na różnorodność biologiczną próbek wody jeziornej. Należy podkreślić, że wprowadzone mikroorganizmy nie zdominowały naturalnej flory mikrobiologicznej badanych środowisk, a jedynie wzbogaciły ją, a dzięki swoim zdolnościom degradacyjnym pozwoliły rozwinąć się również innym grupom mikroorganizmów, zdolnym do degradacji produktów procesów prowadzonych przez bioaugmentowane szczepy. Zaobserwowano również większą różnorodność biologiczną po 60 dniach w próbkach z dodatkiem mikroorganizmów eksponowanych wcześniej na zanieczyszczenia węglowodorowe, w porównaniu do próbek z dodatkiem bakterii wzrastających na podłożu z dodatkiem bursztynianu sodu. Może to wskazywać na bardziej kompleksowy rozkład substratów lub przeprowadzenie procesów degradacyjnych w krótszym czasie przez bakterie poddane wcześniejszej ekspozycji na zanieczyszczenia, co umożliwia szybszy i intensywniejszy rozwój pozostałych mikroorganizmów w danym habitacie.

5.3. Dyskusja wyników

Możliwość wykorzystania badanych mikroorganizmów jest jednym z ważnych elementów badań nad opracowywaniem nowych rozwiązań dla procesów bioremediacji środowiska. Przedstawione wyniki analiz efektywności biodegradacji oleju napędowego przez układy bioaugmentowane mikroorganizmami wskazują na korzystny wpływ tego zabiegu na usuwanie zanieczyszczeń węglowodorowych. Ponadto, odnotowana największa spośród badanych efektywność układów z dodatkiem mikroorganizmów poddanych 12-miesięcznej ekspozycji na węglowodory wskazuje na zasadność przeprowadzonego procesu ekspozycji mikroorganizmów. Jak wykazano w poprzednich sekcjach (Wyniki badań, rodziały 2-4), zarówno doniesienia literaturowe, jak i wyniki przedstawione w niniejszej pracy doktorskiej potwierdzają lepsze przystosowanie oraz większą aktywność metaboliczną komórek, które miały wcześniej kontakt z węglowodorami, co bezpośrednio wpływa na efektywność procesu degradacji zanieczyszczeń.

Opisywane w publikacjach przykłady wykorzystania bioaugmentacji do usuwania zanieczyszczeń węglowodorowych skupiają się głównie na aplikacji odpowiednio dobranych bakterii do próbek zanieczyszczonej gleby. Należy podkreślić, że najlepsze wyniki uzyskiwane są dla mikroorganizmów wyizolowanych z silnie zanieczyszczonych środowisk,

sugerując że ekspozycja komórek na wysokie stężenie węglowodorów pozwala komórkom wykształcić efektywne mechanizmy przystosowujące je do degradacji szkodliwych związków. Pacwa-Płociniczak i in. [48] wykorzystali bakterie Rhodococcus CD130 i CD167 wyizolowane z terenu byłej rafinerii w Czechowicach-Dziedzicach do usuwania węglowodorów z gleby pobranej z tego terenu, osiągając efektywność około 30% w ciągu 182 dni. Jeszcze wyższą, nawet 70% efektywność procesu bioremiediacji udało się uzyskać Roy

i in. [49], wykorzystującym do bioremediacji gleby z terenu rafinerii mikroorganizmy wyizolowane z oczyszczalni ścieków przy rafinerii. Również Poi i in. [50] wykorzystali osad czynny z oczyszczalni ścieków na terenie rafinerii jako źródło mikroorganizmów aplikowanych w bioaugmentacji gleby. Safdari i in. [54] oraz Innemanova i in. [52]

wyizolowali bakterie z gleby długotrwale skażonej węglowodorami i również wykorzystali je w bioaugmentacji tego terenu, natomiast Wu i in. [53] oraz Ramadass i in. [55] wykazali skuteczność bioaugmentacji zanieczyszczonej gleby mikroorganizmami wyizolwoanymi z terenów innych niż gleba poddawana bioremediacji. Należy jednak podkreślić, że zarówno szczep Acinetobacter SZ-1 zastosowany przez Wu i in. [53], jak i bakterie z gatunków P. aeruginosa TPHK-4 i P. putida TPHK-1 wykorzystane przez Ramdass i in. [55] pochodziły z terenów zanieczyszczonych węglowodorami i zostały wcześniej przeanalizowane pod kątem ich właściwości bioremediacyjnych.

Szkodliwe substancje występujące w środowisku, takie jak węglowodory, wymuszają przemiany strukturalne konsorcjów bakteryjnych, eliminując najsłabsze gatunki i promując powstawanie konsorcjów wyspecjalizowanych mikroorganizmów [203]. Obserwowane zmiany struktury profilu bakteryjnego podczas degradacji ksenobiotyków są wynikiem dostosowywania szlaków metabolicznych i ewolucji genetycznej bakterii mających na celu kompleksowe usuwanie zanieczyszczeń [204]. Analiza metagenomu populacji zajmującej dany habitat może dostarczyć ważnych informacji na temat filogenetycznych oraz taksonomicznych powiązań między poszczególnymi gatunkami i ułatwić ocenę ich zdolności do degradacji wybranych związków. Devpura i in. [205] przeprowadzili analizę genetyczną i taksonomiczną mikroorganizmów wyizolowanych z terenów industrialnych w Sachinie (Indie), stwierdzając dominację bakterii z rodzajów Streptomyces, Escherichia, Candidatus, Solibacter, Conexibacter, Planctomyces, Geobacter, Candidatus Koribacter, Sorangium,

Mycobacterium, Anaeromyxobacter, Burkholderia, Bradyrhizobium i innych, zaznaczając jednocześnie, że już na poziomie typu prawie 5% puli wyizolowanego DNA nie zostało sklasyfikowanego taksonomicznie. Również Lenchi i in. [206] zaobserwowali znaczący udział niesklasyfikowanych bakterii w materiale genetycznym wyizolowanym z próbek wody wpompowywanej do złóż ropy naftowej (ang. water injection). Ponadto, w badanych przez nich próbkach dominowały klasy α-, β- i γ- Proteobakterie [206]. Sutton i in. [207] po przebadaniu 26 próbek gleby z terenów zanieczyszczonych olejem napędowym stwierdzili znaczące zmiany struktury konsorcjum bakteryjnego, identyfikując we wszystkich badanych próbkach bakterie z typów Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria oraz Chloroflexi jako dominujące. Z kolei Wang i in. [208] zaobserwowali dominację domeny Archea w fazie wodnej oraz domeny Bacteria (głównie z rodzajów Pseudomonas oraz Sphingomonas) w fazie organicznej wody użytej do zalania miejsc po wydobyciu ropy naftowej. Jak wskazują Abbai i Pillay [209] dominacja β- Proteobakterii i obecność produktów genów odporności na stres metaboliczny są jednymi z markerów przystosowania danej populacji do degradacji węglowodorów. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki analiz puli DNA bakterii wyizolowanych ze zbiorników słodkowodnych sugerują duże zróżnicowanie możliwości dostosowawczych mikroorganizmów z różnych środowisk do degradacji oleju napędowego.

Niemniej jednak, należy podkreślić zaobserwowany korzystny wpływ bioaugmentacji na bioróżnorodność bakterii zajmujących dany habitat w przypadku zanieczyszczenia go węglowodorami ropopochodnymi.

PODSUMOWANIE

Przeprowadzone badania pozwoliły na zrealizowanie założonego celu pracy, jakim było określenie wpływu ekspozycji wybranych mikroorganizmów na węglowodory aromatyczne (butylobenzenu, propylobenzenu, tert-butylobenzenu, sec-butylobenzenu i ksylenu), alifatyczne (izooktanu, nonanu, dodekanu, tridekanu i heksadekanu) oraz olej napędowy, na zdolności bakterii do mikrobiologicznego rozkładu badanych zanieczyszczeń.

Zebrane w Tabeli IV. 1 wyniki przeprowadzonych badań wskazują na zróżnicowany wpływ długotrwałej ekspozycji komórek na węglowodory na efektywność przeprowadzanych przez nie procesów biodegradacji zanieczyszczeń. W przypadku każdego z testowanych szczepów zaobserwowano zarówno pozytywny, jak i negatywny wpływ wcześniejszego kontaktu z węglowodorami, a poszczególne szczepy w różny sposób reagowały na kontakt z poszczególnymi związkami.

W przypadku szczepu R. planticola M01 zaobserwowano pozytywny wpływ długotrwałej ekspozycji komórek zarówno na węglowodory aromatyczne, jak i alifatyczne.

Bakterie R. planticola M01 eksponowane na te związki były zdolne do usuwania średnio ponad 90% związków alifatycznych i aromatycznych w testach biodegradacyjnych. Komórki tego szczepu charakteryzowały się wzrostem hydrofobowości powierzchni oraz obniżeniem potencjału elektrokinetycznego. Zaobserwowano również wzrost przepuszczalności błon komórkowych oraz polidyspersyjności badanych układów. W przypadku komórek eksponowanych na węglowodory aromatyczne najistotniejszą zaobserwowaną zmianą jest duży wzrost aktywności 2,3-dioksygenazy katecholowej i równoczesny spadek aktywności transferazy glutationowej, co może wskazywać na zaangażowanie 2,3-DO w degradację związków aromatycznych przez bakterie szczepu R. planticola M01. Biorące pod uwagę podwyższoną aktywność tej oksygenazy oraz wysoką biodegradację węglowodorów aromatycznych można również przypuszczać, że efektywne metabolizowanie tych węglowodorów przez komórki wpływa na zmniejszenie ich toksyczności w stosunku do badanych mikroorganizmów, o czym może świadczyć spadek aktywności GST. Zmniejszenie aktywności tego enzymu można także zaobserwować w przypadku komórek R. planticola M01 eksponowanych na węglowodory alifatyczne, Ponadto, znacznie zwiększona całkowita przepuszczalność błony tych komórek wraz z innymi odnotowanymi modyfikacjami powierzchniowymi może sugerować zmiany w kierunku łatwiejszego przyłączania związków alifatycznych i transportowania ich do wnętrza komórek.

Tabela IV. 1. Główne właściwości komórek analizowanych szczepów oraz efektywność przeprowadzanych przez nie procesów biodegradacji węglowodorów

M01 – R. planticola Mo1; M03 – R. ornithinolytica M03; M1B – A. calcoaceticus M1B; AR – węglowoodry aromatyczne; AL. – węglowodory alifatyczne; ON – olej napędowy; ¹ zmierzone po 12 miesiącach ekspozycji; ² indeks polidyspersyjności; ³ całkowita przepuszczalność błony komórkowej; ⁴ przepuszczalność wewnętrznej błony komórkowej; ⁵ 1,2-dioksygenaza katecholowa; ² 2,3-dioksygenaza katecholowa, ⁷ transferaza glutationowa; ⁸ średnia biodegradacja dla poszczególnych węglowodorów z mieszaniny zmierzona po 14 dniach; ⁹ biodegradacja zmierzona po 14 dniach; kolorami oznaczono: zielonym – wzrost biodegradacji;

czerwonym - spadek biodegradacji; czarnym – brak istotnych zmian

Szczep R. ornithinolytica M03 eksponowany na węglowodory aromatyczne charakteryzował się również wysoką zdolnością do biodegradacji tej grupy związków, jednak w tym przypadku jedną z głównych ról w ich efektywnym metabolizowaniu odgrywają 1,2-dioksygenzay katecholowe, których aktywność wzrosła 3-krotnie w porównaniu do próby kontrolnej. Komórki szczepu R. ornithinolytica M03 poddane ekspozycji na węglowodory aromatyczne charakteryzowały się również najwyższymi spośród badanych wartościami bezwzględnymi hydrofobowości powierzchni komórek oraz potencjału elektrokinetycznego.

Wywołane w wyniku ekspozycji na węglowodory aromatyczne zmiany właściwości tych komórek skutkowały prawie 3-krotnym wzrostem efektywności biodegradacji związków aromatycznych przez te komórki w porównaniu do komórek nieeksponowanych.

Porównywalnie duże zmiany wartości CHS i potencjału elektrokinetycznego komórek eksponowanych na węglowodory alifatyczne nie przyniosły oczekiwanych efektów w przypadku biodegradacji tych związków, a komórki eksponowane na związki alifatyczne były mniej efektywne w ich metabolizowaniu niż komórki nieeksponowane. Uwagę zwraca również bardzo duży wzrost aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej, zarówno w komórkach szczepu R. ornithinolytica M03 eksponowanych na węglowodory alifatyczne, jak i olej napędowy. W przypadku biodegradacji węglowodorów alifatycznych zaobserwowano również wzrost aktywności transferazy glutationowej, odpowiedzialnej za ochronę komórek przed szkodliwym działaniem ksenobiotyków, co może wskazywać, że obecne w podłożu związki alifatyczne były dla nich szkodliwe. Bakterie R. ornithinolytica M03 poddane długotrwałej ekspozycji na olej napędowy charakteryzowały się największą spośród wszystkich badanych szczepów zdolnością do jego biodegradacji, co wskazuje na korzystny wpływ przeprowadzonego procesu ekspozycji na efektywność komórek w usuwaniu tego typu zanieczyszczeń. Przeprowadzone przez komórki eksponowane na olej napędowy modyfikacje właściwości powierzchniowych oraz wzrost aktywności enzymatycznej skutkowały również wzrostem biodegradacji węglowodorów aromatycznych oraz utrzymaniem na zbliżonym do próby kontrolnej poziomie degradacji związków alifatycznych. Należy tutaj podkreślić, że główną różnicą występującą między komórkami eksponowanymi na związki alifatyczne i olej napędowy jest zmiana potencjału elektrokientycznego komórek. Zaobserwowane znaczące różnice w zdolnościach degradacyjnych mogą wskazywać, że zmiana potencjału elektrokinetycznego jest jedną

z ważnych modyfikacji podejmowanych przez komórki podczas kontaktu ze związkami alifatycznymi, jednak zbyt duże obniżenie wartości tego parametru skutkuje spadkiem biodegradacji węglowodorów alifatycznych. Na podstawie przeprowadzonych analiz można wnioskować, że optymalne wartości potencjału elektrokinetycznego komórek efektywnie degradujących związki alifatyczne nie powinny przekraczać -21 mV.

Bakterie szczepu A. calcoaceticus M1B eksponowane na badane zanieczyszczenia węglowodorowe charakteryzowały się wzrostem efektywności usuwania węglowodorów aromatycznych, alifatycznych oraz oleju napędowego. Wyjątkiem są w tym przypadku układy zawierające komórki poddane ekspozycji na węglowodory aromatyczne, w których biodegradacja związków aromatycznych była o 30% niższa niż w hodowli z komórkami nieeksponowanymi. U mikroorganizmów szczepu A. calcoaceticus M1B poddanych ekspozycji na węglowodory aromatyczne zaobserwowano również spadek bezwzględnej wartości potencjału elektrokinetycznego komórek, ich aktywności enzymatycznej oraz wzrost przepuszczalności błon komórkowych. Ponadto, komórki wzrastające na podłożu z dodatkiem węglowodorów aromatycznych charakteryzowały się małą liczebnością, co może wskazywać na negatywne oddziaływanie długotrwałej ekspozycji na węglowodory aromatyczne na bakterie A. calcoaceticus M1B. Z kolei w komórkach tego szczepu eksponowanych na węglowodory alifatyczne odnotowano również modyfikacje właściwości powierzchniowych, wśród których uwagę zwraca niewielki spadek potencjału dzeta oraz znacznie obniżona aktywność dioksygenaz katecholowych. Obserwowany wzrost efektywności biodegradacji węglowodorów alifatycznych przez te komórki wskazuje, że enzymy te nie są zaangażowane z usuwanie zanieczyszczeń z tej grupy. Ponadto, znaczący wzrost całkowitej przepuszczalności błony komórkowej mógł być pozytywnie skorelowany z obserwowanym wzrostem biodegradacji węglowodorów alifatycznych. Mikroorganizmy A. calcoaceticus M1B poddane ekspozycji na olej napędowy charakteryzowały się również modyfikacjami właściwości powierzchniowych w kierunku cech bardziej hydrofobowych, wzrostem przepuszczalności błony komórkowej oraz zwiększonym usuwaniem badanych substancji.

Analizując wszystkie badane mikroorganizmy poddane ekspozycji na olej napędowy, a następnie degradujące ten substrat, nie można wyróżnić głównych właściwości predysponujących komórki do efektywnej degradacji ON. Różnice występujące pomiędzy

właściwościami poszczególnych szczepów nie pozwalają na jednoznaczne skorelowanie którejś z badanych cech ze zwiększoną lub zmniejszoną biodegradacją. Można zatem wnioskować, że metabolizm oleju napędowego wymaga zaangażowania wielu procesów w komórkach różnych szczepów, a złożoność tej mieszaniny wymusza ich indywidualne przystosowanie do prowadzenia procesów biodegradacji oleju napędowego. Cechą wspólną komórek predysponujących je do efektywnego usuwania oleju napędowego jest podwyższona polidyspersyjność badanych układów. Najlepsze wyniki biodegradacji uzyskano dla układów w których wartość tego parametru była w zakresie 0,3-0,5; a wyższa polidyspersyjność obniżała zdolności biodegradacyjne komórek.

Ponadto, przeprowadzone szczegółowe analizy właściwości komórek eksponowanych na węglowodory aromatyczne udowadniają duże znaczenie zmian płynności błony komórkowej w efektywnym transporcie i metabolizowaniu tych zanieczyszczeń oraz znaczące różnice w poziomach akumulacji białek oraz aktywności transkrypcyjnej genów pomiędzy komórkami. Należy zwrócić uwagę, że nawet szczepy R. planticola M01 oraz R. ornithinolytica M03 należące do tego samego rodzaju charakteryzowały się różnymi profilami proteomicznymi. Komórki analizowanych szczepów R. planticola M01, R. ornithinolytica M03 oraz A. calcoaceticus M1B poddane 12-miesięcznej ekspozycji na węglowodory aromatyczne charakteryzowały się znacząco podwyższonym poziomem akumulacji białek związanych z aktywnym transportem zanieczyszczeń do komórek.

Potwierdzono również niewielką trwałość modyfikacji profilu białkowego komórek wywołanego 12-miesięczną ekspozycją na węglowodory aromatyczne. Dowodem tego są zaobserwowan zmiany „powrotne” profilu białkowego mikroorganizmów przeniesionych po 12-miesięcznej ekspozycji na węglowodory do hodowli z glukozą jako źródłem węgla. Ze względu na duże zaangażowanie wielu procesów metabolicznych oraz ekspresję i akumulację znaczącej liczby białek w wyniku ekspozycji na zanieczyszczenia węglowodorowe, zmiany profilu białkowego w kierunku profilu komórek nieeksponowanych są przez bakterie predysponowane po ustaniu działania czynnika stresowego.

Aby podsumować wyniki przeprowadzonych analiz, poniżej zebrano najważniejsze obserwacje i wnioski sformułowane po ich przeanalizowaniu.

1) Z próbek gleb z różnych środowisk wyizolowano trzy szczepy zdolne do wzrostu na podłożu zawierającym olej napędowy jako jedyne źródło węgla i energii, a na podstawie analiz molekularnych zidentyfikowano je jako Raoultella platicola M01, Raoultella ornithinolytica M03 oraz Acinetobater calcoaceticus M1B.

2) Analizy zmian właściwości powierzchniowych komórek poddanych ekspozycji na węglowodory pozwoliły stwierdzić, że wrażliwość komórek na badane węglowodory uległa zmniejszeniu, poprzez wywołanie modyfikacji strukturalnych i metabolicznych.

3) Ze względu na znaczące różnice przeprowadzanych przez bakterie eksponowane na węglowodory modyfikacji właściwości nie można jednoznacznie wyróżnić ich najważniejszych cech predysponujących je do degradacji węglowodorów, jednak zaobserwowano istnienie wartości granicznych (potencjału elektrokinetycznego czy polidyspersyjności badanych układów) warunkujących zwiększenie efektywności biodegradacji ksenobiotyków przez mikroorganizmy.

4) Zmiany aktywności proteomu bakterii poddanych krótkotrwałej i długotrwałej ekspozycji na zanieczyszczenia węglowodorowe charakteryzują się różnym przebiegiem. Krótkotrwała ekspozycja wywoływała głównie modyfikacje struktury błony komórkowej, natomiast długotrwała powodowałą zmiany mające na celu przystosowanie metaboliczne bakterii.

5) Uzyskana w wyniku długotrwałej ekspozycji zmniejszona wrażliwość bakterii na badane węglowodory aromatyczne, alifatyczne i olej napędowy oraz ich

5) Uzyskana w wyniku długotrwałej ekspozycji zmniejszona wrażliwość bakterii na badane węglowodory aromatyczne, alifatyczne i olej napędowy oraz ich