Analiza wpływu substancji wzorcowych na poziom transkryptu CYP3A1

Deksametazon w dawce 50 mg/kg i.p. stosowany przez 3 dni wywołał indukcję CYP3A1 na poziomie 5,4-krotnym (p < 0,001) w porównaniu do grupy kontrolnej (Rycina 30). Efekt ten utrzymał się i po 4 dniach podawania poziom transkryptu dla tego genu osiągnął wartość blisko 4-krotnie (p < 0,001) wyższą względem grupy niepoddanej procedurze doświadczalnej. W przypadku wydłużenia eksperymentu do 10 dni, deksametazon w dawce 50 mg/kg i.p. wywoływał efekt śmiertelny wśród zwierząt, w wyniku wystąpienia silnej hepatotoksyczności wątroby.

Rycina 30. Analiza wpływu syntetycznego induktora CYP3A (deksametazon) na poziom transkryptu badanego genu CYP3A1 z wykorzystaniem reakcji rt-PCR w komórkach wątroby szczurów rasy Wistar po 3 i 4 dniach podawania preparatu. Mierzone zmiany poziomu cDNA odpowiadają zmianom w ilości mRNA CYP3A1 w komórkach. Wartość ilorazu cDNA CYP3A1 do GAPDH w próbie kontrolnej przyjęto jako 1. Na wykresie przedstawiono średnie wartości dla poszczególnych grup z zaznaczoną wartością SEM. * p < 0,05 (jednoczynnikowa ANOVA).

*

*

82 * 0 20 40 60 80 100 120 Kontrola Ketokonazol % ^{3 dni} 10 dni

Rycina 31. Analiza wpływu ketokonazolu na poziom transkryptu genu CYP3A1 z wykorzystaniem reakcji rt-PCR w komórkach wątroby szczurów rasy Wistar po 3 i 10 dniach podawania. Poziom cDNA odpowiada ilości mRNA CYP3A1 w komórkach. Wartość ilorazu cDNA CYP3A1 do GAPDH w próbie kontrolnej przyjęto jako 1. Na wykresie przedstawiono średnie wartości dla poszczególnych grup z zaznaczoną wartością SEM. * p < 0,05 (jednoczynnikowa ANOVA).

Ketokonazol w dawce 10 mg/kg i.p. podawany przez 3 dni nie wywołał znaczących zmian w poziomie ekspresji CYP3A1 w porównaniu do grupy kontrolnej (Rycina 31). Po 10 dniach podawania ketokonazolu zaobserwowano natomiast tendencję hamowania ekspresji badanego genu na poziomie nie przekraczającym 18% (p = 0,013).

4.4.3. Analiza wpływu preparatów roślinnych na poziom ekspresji

genu CYP3A1

Zastosowanie dziurawca zwyczajnego w postaci wyciągu w dawce 300 mg/kg p.o. przez okres 3 dni nie wpłynęło znacząco na ilość transkryptu badanego genu względem grupy niepoddanej procedurze eksperymentalnej (Rycina 32). Efekt obniżenia poziomu cDNA genu CYP3A1 zaobserwowano po 10 dniach podawania ekstraktu i względem grupy kontrolnej osiągnął on wartość 26% (p = 0,009). Wyciąg kozłka lekarskiego w dawce 300 mg/kg p.o. podawany przez okres 3 dni obniżył również istotnie statystycznie ilość transkryptu genu CYP3A1 o 27% (p = 0,248) względem grupy karmionej standardową dietą. Spadek ten zwiększył się po 10 dniach hodowli i wyniósł 50% w stosunku do grupy kontrolnej (p < 0,001). Podobny efekt zaobserwowano u szczurów otrzymujących przez okres 3 dni wyciąg soi zwyczajnej podawany w dawce 100 mg/kg p.o., gdzie zanotowano znamienną statystycznie redukcję stężenia cDNA o 35% (p = 0,021) w stosunku do grupy kontrolnej.

83 Efekt ten utrzymywał się po wydłużeniu doświadczenia do 10 dni, a spadek ilości transkryptu tego genu wyniósł odpowiednio 36% (p < 0,001).

* * * * * * ^* * ^{* *} 0 20 40 60 80 100 120 140 160 K^on tr^ol a H^.p er^fo ra^tu m V^.o ff^ic in^al is G^{. m} ax P^{. g} in^se ng A^{. s} at^iv um E^{. p} ur^pu re^a G^.b ilo^ba C^.s in^en si^s % 3 dni 10 dni

Rycina 32. Analiza wpływu preparatów roślinnych na poziom transkryptu CYP3A1 z wykorzystaniem reakcji rt-PCR w komórkach wątroby szczurów rasy Wistar po 3 i 10 dniach podawania. Mierzony poziom cDNA odpowiada ilości mRNA CYP3A1 w komórkach. Wartość ilorazu cDNA CYP3A1 do GAPDH w próbie kontrolnej przyjęto jako 1. Na wykresie przedstawiono średnie wartości dla poszczególnych grup z zaznaczoną wartością SEM. * p < 0,05 (jednoczynnikowa ANOVA).

W przypadku zastosowania wyciągu z żeń-szenia przez okres zarówno 3 dni jak i 10 dni w dawce 30 mg/kg p.o. zaobserwowano istotne statystycznie obniżenie poziomu mRNA dla badanego genu odpowiednio o blisko 50% (p < 0,001) i 30% (p < 0,001) względem grupy kontrolnej karmionej standardową dietą. Granulat czosnku pospolitego podawany przez okres 3 dni w dawce 250 mg/kg p.o. redukował poziom ekspresji genu CYP3A1 w komórkach wątroby u szczurów o 30% (p = 0,064). Konsekwencją przedłużenia okresu podawania czosnku w podanej dawce do 10 dni zanotowano istotny statystycznie spadek poziomu transkrypcji CYP3A1 o 42% (p < 0,001) względem próby niepoddanej procedurze eksperymentalnej. Wyciąg jeżówki purpurowej podawany przez okres 3 dni w dawce 50 mg/kg p.o. nie wpływał na poziom ekspresji genu CYP3A1 w komórkach wątroby u szczurów, przy czym przedłużenie okresu podawania ekstraktu w podanej dawce do 10 dni wywołało istotny statystycznie spadek poziomu transkrypcji CYP3A1 o 43% (p < 0,001) względem grupy kontrolnej. W przypadku zwierząt laboratoryjnych (szczur), których dieta wzbogacona została wyciągiem z G. biloba w dawce 200 mg/kg p.o., po 3 dniach w komórkach wątroby zaobserwowano nieznaczny wzrost ilości cDNA dla genu CYP3A1

84 o wartość 26% (p < 0,001) względem grupy odniesienia. Wyniki analiz tkanki wątrobowej zwierząt po 10 dniach stosowania preparatu z miłorzębu wskazywały brak wpływu na poziom transkryptu tego genu, ponieważ zanotowano nieznaczny wzrost ilości mRNA o 10% (p = 0,685). Ponadto badania wykazały, że w przypadku podawania wyciągu zielonej herbaty w dawce 300 mg/kg p.o. przez okres 3 dni zanotowano niewielkie, nieistotne statystycznie obniżenie poziomu ekspresji genu CYP3A1 w komórkach wątroby o 13% (p = 0,567). Konsekwencją przedłużenia okresu podawania tego preparatu w danej dawce do 10 dni zaobserwowano istotny statystycznie spadek poziomu transkrypcji CYP3A1 o wartość 38% (p < 0,001) względem grupy kontrolnej.

4.5. Analiza poziomu transkryptu PXR w modelu in vivo

4.5.1. Ocena ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie

rzeczywistym dla produktu amplifikacji cDNA czynnika PXR

Na podstawie krzywej topnienia zidentyfikowano występowanie pojedynczego piku, co wskazuje na obecność produktu amplifikacji o Tm równej 89,20°C i pozwala na określenie specyficzności reakcji. Przykładowy wykres przedstawiający wyznaczanie temperatury topnienia produktu, przebieg reakcji amplifikacji i krzywą wzorcową pozwalającą oszacować ilości transkryptu analizowanego czynnika PXR zamieszczono odpowiednio na Rycinie 33 i 34.

Rycina 33. Wyznaczanie temperatury topnienia produktu PXR w reakcji rt-PCR. Temperatura topnienia produktu amplifikacji wyniosła 89,20ºC.

85 Rycina 34. Przebieg reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla transkryptu PXR przy różnych jego rozcieńczeniachcDNA. Krzywa wzorcowa dla PXR.

4.5.2. Analiza wpływu substancji wzorcowych dla CYP3A1 na poziom