Antybiotyki - molekularne sody w analizie funkcjonalnej procesu translacji

Przedstawione analizy, czy to analizy ilościowe wydajności translacji, czy też profile polisomów wykazały, że funkcjonowanie maszynerii translacyjnej w badanych mutantach drożdżowych nie jest znacząco zaburzone, na żadnym z poszczególnych etapów w cyklu translacyjnym, tj. w inicjacji, elongacji czy terminacji. Należy jednak podkreślić, że ogólna wydajność procesu translacji zwłaszcza dla mutanta uL10Δh1h2 jest znacząco obniżona. W konsekwencji, do dalszych analiz funkcjonalnych wykorzystano tzw. molekularne narzędzia, antybiotyki działające na rybosom, które można zaklasyfikować jako molekularne sondy w analizie funkcjonalnej rybosomu. Do analiz wykorzystano szeroki wachlarz antybiotyków. Zastosowano antybiotyki wpływające na poszczególne etapy procesu translacji. I tak, do analizy inicjacji wykorzystano harringtoninę (blokującą łączenie się podjednostek 40S i 60S) i laktinomycynę (blokującą tworzenie się pierwszego wiązania peptydowego); natomiast do badania elongacji: paromomycyne, higromycynę B, genetycynę (G418) (działającą na proces dekodowania procesu translacji) oraz sordarin i cykloheksymid (działające na etap translokacji w cyklu elongacyjnym). Ponadto, zastosowano diazaborynę blokującą proces biogenezy podjednostki 60S oraz aktynomycynę D hamującą syntezę rRNA. Pierwszy etap badań, to tzw. krążkowe testy wzrostowe. Mianowicie, na podłoże stałe YPD naniesiono zawiesinę komórek drożdżowych, a następnie umieszczano krążki z bibuły nasączone odpowiednim antybiotykiem. Płytki hodowano przez 72 godziny, temperaturze 30 °C i analizowano wrażliwość na antybiotyki mutantów drożdżowych, w formie analiz stref zahamowania wzrostu, w porównaniu do komórek kontrolnych (Fig. 30 i 31).

Wyniki

70

Fig. 30. Wpływ antybiotyków na wzrost komórek badanych mutantów drożdżowych. Na podłoże stałe YPD naniesiono zawiesinę komórek drożdżowych (o gęstości optycznej OD600 = 0,5) a następnie umieszczano krążek bibuły 3MM nasączony poszczególnymi antybiotykami: laktimidomycyna (0,2 mg/ml), aktynomycyną D (1 mg/ml), harringtoniną (10 mg/ml), diazaboryną (12,4 µg.ml). Płytkę z podłożem stałym YPD inkubowano 72 godziny w temperaturze 30 °C.

Najistotniejsze zaburzenia we wzroście poszczególnych szczepów drożdżowych, a przede wszystkim uL10Δh1h2, zaobserwowano dla antybiotyków z grupy aminoglikozydów, do których należą paromomycyna (Par), genetycyna (G418) i higromycyna B (HigB). Aminoglikozydy to antybiotyki działające na wczesny etap elongacji w cyklu translacyjnym tj. proces dekodowania informacji genetycznej.

Antybiotyki tej grupy łączą się z rybosomu w centrum dekodującym, co upośledza działanie rybosomu w ten sposób, że obniża precyzję dekodowania informacji genetycznej. Ponadto, zaobserwowano, że szczep drożdżowy uL10Δh1h2 wykazuje zmniejszoną wrażliwość na cykloheksymid (CHX) oraz sordarin (Sor). Uważa się, że antybiotyki te blokują proces translacji na etapie elongacji, a przede wszystkim hamują translokację rybosomu na mRNA.

Wyniki

71

Fig. 31. Wpływ antybiotyków na wzrost komórek badanych mutantów drożdżowych. Na podłoże stałe YPD naniesiono zawiesinę komórek drożdżowych (o gęstości optycznej OD600 = 0,5) a następnie umieszczano krążek bibuły 3MM nasączony poszczególnymi antybiotykami: sordarinem (1mg/ml), paromomycyną (250 mg/ml), higromycyną B (15 mg/ml), genetycyną (G418) (50 mg/ml), cykloheksymidem (100 µg/ml). Płytkę z podłożem stałym YPD inkubowano 3 dni w temperaturze 30 °C.

W celu szczegółowej analizy wpływu antybiotyków, a w szczególności z grupy aminoglikozydów oraz sordarinu czy cykloheksymidu na wzrost komórek badanych szczepów drożdżowych, wykonano dodatkowe testy wzrostowe.

Mianowicie, podłoże stałe YPD suplementowano odpowiednim antybiotykiem, a komórki drożdżowe nanoszono w formie kolejnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny o gęstości optycznej OD600=0,1. Drożdże hodowano przez trzy dni w temperaturze 30 °C. Wykonane analizy wzrostowe potwierdziły negatywny wpływ tych antybiotyków na wzrost komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 (Fig. 32A, górny panel). Wyniki te sugerują, że brak białek P może mieć wpływ na etap dekodowania informacji genetycznej. Na uwagę także zasługują testy wzrostowe wykonane w obecności sordarinu. Zaobserwowano zahamowanie wzrostu komórek

Wyniki

72 szczepu kontrolnego, zaś mutanty drożdżowe wykazywały znaczącą oporność na ten antybiotyk (Fig. 32A, dolny panel). Sordarin jest uważany za inhibitor działający na translokację rybosomu, na etapie elongacji, procesu zależnego od czynnika translacyjnego eEF2, który ulega bezpośredniej interakcji z białkami P [63], jednakże jego działanie nie jest precyzyjnie określone. Ponadto, zmutowane szczepy uL10Δh2 i uL10Δh1h2 wykazywały podwyższoną oporność na cykloheksymid, także inhibitor translokacji, ale o dobrze zdefiniowanym działaniu (Fig. 32A, dolny panel).

Fig. 32. Test wzrostowe w obecności antybiotyków aminoglikozydowych oraz sordarinu i cykloheksymidu. Testy wzrostowe wykonano na pożywce YP suplementowanej różnymi źródłami węgla oraz dodatkowo odpowiednim antybiotykiem. A: Zawiesinę komórek drożdżowych o gęstości optycznej OD600=0,1 naniesiono w formie kolejnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń na podłoże stałe YP uzupełnione glukozą oraz 100 µg/ml G418, 100 µg/ml Hyg B, 250 µg/ml Par, 0,1 µg/ml CHX i 2 µg/ml Sor, B: testy wzrostowe, j. w. na podłożu stałym YP suplementowanym glukozą ,etanolem lub glicerolem oraz dodatkowo 100 µg/ml G418. Poszczególne rozcieńczenia to: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, jak pokazano na rysunku.

Wyniki

73 Wyniki te mogą sugerować, że białka P mogą odgrywać istotną rolę w procesie elongacji przede wszystkim na etapie nie tylko dekodowania informacji genetycznej, lecz również na etapie translokacji.

Analizy wzrostowe w obecności antybiotyków aminoglikozydowych rozszerzono o analizy wzrostu komórek drożdżowych na tzw. niefermentowalnych źródłach węgla, jak etanol czy glicerol. Związki te są efektywnie wykorzystywane przez komórki drożdżowe jako źródło energii, ale ich wykorzystanie wymaga przeprogramowania metabolizmu, w stosunku do glukozy, która jest preferowanym źródłem węgla dla drożdży. Analizę wykonano w obecności antybiotyku G418, który w stężeniu 100 µg/ml nie jest letalny dla komórek kontrolnych. Jak pokazały wcześniejsze analizy fenotypowe, komórki kontrolne w przeciwieństwie do mutantów, wykorzystują takie źródła węgla jak etanol czy glicerol (Fig. 18).

Zaskakujące dane uzyskano z analiz testów wzrostowych w obecności niefermentowalnych źródeł węgla tj. etanolu czy glicerolu oraz w obecności G418.

Jak pokazano wcześniej komórki mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 nie są wstanie wykorzystać niefermentowalnych źródeł węgla jak etanol czy glicerol, a wzrost w obecności G418 jest zahamowany. Natomiast komórki szczepu dzikiego w obecności niefermentowalych źródeł węgla oraz G418 także tracą zdolność do wykorzystania etanolu i glicerolu, odzwierciedlając fenotyp komórek szczepu uL10Δh1h2 hodowanego na pożywce na bazie tych źródeł węgla (Fig. 32B).

Dalsze rozwinięcie prowadzonych badań związanych z wykorzystaniem antybiotyków to analiza wydajności procesu translacji w obecności G418 oraz sordarinu, wykorzystując inkorporację znakowanej radioaktywnie metioniny

35S-Met do nowo syntetyzowanego białka w obecności tzw. subletalnego (100 μg/ml) stężenia G418 oraz 0,5 µg/ml sordarinu, dla komórek szczepu dzikiego oraz mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 (Fig. 33A i Fig. 34A).

Wyniki

74

Fig. 33. Analiza wydajności procesu translacji w obecności G418. Analizę wydajności procesu translacji określono jako funkcja inkorporacji ³⁵S-metioniny do nowo syntetyzowanych polipeptydów w obecności subletalnej dawki G418 (100 μg/ml), w czasie hodowli. A: analiza ogólnej wydajności translacji; kolorem niebieskim oznaczono dane dotyczące szczepu dzikiego +G418 w stężeniu 100 μg/ml (◊) i -G418 (♦) oraz kolorem żółtym oznaczono dane dla mutanta drożdżowego uL10Δh1h2

+G418 w stężeniu 100 µg/ml (Δ) i -G418(▲). Błędy reprezentują odchylenia standardowe uzyskane z trzech niezależnych eksperymentów. Wstawka przedstawia znormalizowane wyniki wydajności translacyjnej komórek szczepu dzikiego oraz komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2

nietraktowanych G418 wyrażone jako 100%, w stosunku do wydajności translacji komórek szczepu dzikiego oraz komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2, * - istotność statystyczna P <0,01, test t Studenta. B: Analiza T1/2 - tzw. half transit time, wykonano z wykorzystaniem szczepu dzikiego w obecności 100 μg/ml antybiotyku G418.

Analiza wydajności translacji wskazała na 40% (w obecności G418) oraz 60%

(w obecności sordarinu) zmniejszenie wydajności tego procesu w przypadku komórek szczepu dzikiego oraz 80% (w obecności G418) oraz 20% (w obecności sordarinu) dla komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2.

Wyniki

75

Fig. 34. Analiza wydajności procesu translacji w obecności sordarinu w badanych szczepach drożdżowych. A: Analiza wydajności procesu translacji określona jako funkcja wbudowywania

35S metioniny do nowo syntetyzowanych polipeptydów w obecności 0,5 μg/ml sorarinu, na czas hodowli Kolorem niebieskim oznaczono dane dotyczące szczepu dzikiego +Sor w stężeniu 0,5 μg/ml

(◊) i -sordarinu (♦) oraz kolorem żółtym dane dla mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 +sordarinu w stężeniu 0,5 µg/ml (Δ) i -0,5 µg/ml(▲). Błędy reprezentują odchylenia standardowe uzyskane z trzech niezależnych eksperymentów. Wstawka przedstawia znormalizowane wyniki wydajności translacyjnej komórek szczepu dzikiego oraz komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2

nietraktowanych sordarinem wyrażone jako 100%, w stosunku do wydajności translacji komórek szczepu dzikiego oraz komórek mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 w obecności sordarinu,; * - istotność statystyczna P <0,01, test t Studenta. B: Analiza half transit time dla szczepu dzikiego w obecności 0,5 μg/ml sordarinu.

Na szczególną uwagę zasługuje analiza T1/2, „half transit time”, mierząca wydajność etapu elongacji i terminacji. Analizę tę wykonano dla komórek szczepu dzikiego w obecności 100 µg/ml G418 oraz 0,5 µg/ml sordarinu, w celu bliższego scharakteryzowania działania tych antybiotyków pod względem oddziaływania metabolicznego na maszynerię translacyjną in vivo. W przypadku G418 T1/2

nie znacznie wzrosło do 39s (wzrost o 20%) (Fig. 33B), w stosunku do około 32s dla komórek kontrolnych (Fig. 25). W przypadku T1/2 mierzonego w obecności sordarinu zanotowano wzrost aż do 89s (Fig. 34B). Sordarin jest postrzegany jako związek blokujący translokację na etapie elongacji łańcucha polipeptydowego, co analiza ta jednoznacznie pokazała. Odmienny wpływ

Wyniki

76 ma aminoglikozyd G418, którego działanie nie wpływa znacząco na etap elongacji procesu translacji.

W kolejnym kroku analiz podjęto próbę charakterystyki funkcjonowania maszynerii translacyjnej w obecności G418 i sordarinu, przeprowadzając analizę profili polisomów z wykorzystaniem mutanta drożdżowego uL10Δh1h2, jak i szczepu kontrolnego. W pierwszej kolejności przeprowadzono analizę wykorzystując antybiotyk sordarin. Analizy strukturalne orasz szereg prac funkcjonalnych wskazały, że antybiotyk ten oddziałuje z centrum GTPazowy, a przede wszystkim z czynnikiem elongacyjnym EF2 [63, 147]. Postuluje się również, że rybosomalne białko uL10 jest zaangażowane w interakcję sordarinu z rybosomem [148, 149].

Wykonana analiza T1/2 wykazała, że faktycznie antybiotyk ten znacząco obniża etap elongacji/terminacji a zatem jego efekt powinien być dobrze widoczny na obrazie polisomów, analogicznie do efektu wywoływanego przez CHX. Analiza profili polisomów w obecności sordarinu wskazała, że w szczepie kontrolnym następuje akumulacja monosomów 80S oraz znaczne zmniejszenie frakcji polisomów w stosunku do analizy kontrolnej z wykorzystaniem CHX; zaś stosunek podjednostek 40/60 nie uległ znaczącej zmianie w stosunku do kontroli. Zaskakujące wyniki otrzymano w przypadku mutanta drożdżowego uL10Δh1h2, w obecności sordarinu. Profil polisomów przypomina profil dla układu kontrolnego z CHX, tj. frakcja polisomów jest wyraźna, z tą różnicą że wartość P/M jest mniejsza;

ponadto stosunek 40/60 ulega zmianie, co sugeruje zaburzenia w procesie inicjacji czy też biogenezy podjednostki 60S. (Fig. 35). Podsumowując, otrzymane wyniki wskazły, że sordarin nie blokuje procesu elongacji w komórkach szczepu dzikiego (brak frakcji polisomów). Zachowanie się maszynerii translacyjnej w mutancie drożdżowym uL10Δh1h2, który wykazuje oporność na ten antybiotyk, wskazuje że proces elongacji może przebiegać wydajnie (obecność frakcji polisomów).

Wyniki

77

Fig. 35. Analiza profili polisomów w obecności sordarinu. Analiza profili polisomów w obecności cykloheksymidu (CHX) - układ kontrolny (A, C) oraz sordarinu (B, D). Stosunek polisomów do monosomu (P/M) obliczono dla każdego profilu przez podzielenie obszaru pierwszych czterech pików polisomalnych przez obszar frakcji dla monosomu 80S.

W związku z zaobserwowanym intrygującym zachowaniem się badanych komórek drożdżowych w obecności sordarinu, wykonano dodatkową analizę profili polisomów w obecności tego inhibitora i jednocześnie w obecności cykloheksymidu, który jest antybiotykiem wydajnie blokującym translację na etapie elongacji (dobrze widoczne polisomy). Jak wykazano w szczepie kontrolnym, w analizowanych profilach polisomów następuje akumulacja frakcji monosomów 80S, przy braku frakcji polisomów, zaś stosunek 40S/60S jest podobny jak w układzie kontrolnym (Fig. 36B). Ponadto, analiza wykonana z wykorzystaniem mutanta drożdżowego uL10Δh1h2 przyniosła zaskakujące wyniki, pokazując profil polisomów z dobrze zachowaną frakcją polisomów (Fig. 36D). Przeprowadzone analizy mogą wskazywać, że maszyneria translacyjna w komórkach mutanta uL10Δh1h2 nie jest

Wyniki

78 w pełni blokowana przez sordarin, co może tłumaczyć niską wrażliwość na ten antybiotyk. W przypadku komórek kontrolnych, obecność frakcji 80S może wskazywać że blokada działania rybosomu może następować na etapie rekrutacji nieaktywnych monosomów 80S do procesu translacji. Zjawisko to nigdy nie było powiązane z aktywnością sordarinu.

Fig. 36. Analiza profili polisomów w obecności sordarinu i cykloheksymidu. Analiza profili polisomów w obecności cykloheksymidu (A, C) oraz sordarinu i cykloheksymidu (B, D). Stosunek polisomów do monosomu (P/M) obliczono dla każdego profilu jako stosunek obszaru pierwszych czterech pików polisomalnych do obszaru frakcji dla monosomu 80S.

Wyniki

79

Fig. 37. Analiza polisomów w obecności G418 wykorzystując kontrolny szczep drożdżowy.

A: Profil polisomów dla komórek szczepu dzikiego hodowanych w obecności 100 µg/ml G418 i zablokowanych translacyjnie przez CHX. B: Profil polisomów w warunkach „runoff” w obecności 100 µg/ml G418. C i D: Profile polisomów uzyskany przy użyciu 1,65x10⁶ komórek drożdżowych w obecności lub braku G418. Całkowitą powierzchnie obliczono dla wszystkich poszczególnych frakcji 40S, 60S, 80S i czterech frakcji polisomalnych. Pozostałe wartości, P/M i 40/60 opisują stosunek polisomów do monosomów oraz podjednostek rybosomalnych 40 do 60S.

W kolejnym kroku, z racji na zaobserwowanie synergistycznego działania G418 w mutancie uL10Δh1h2, oraz analogiczne działanie tego antybiotyku na szczep kontrolny, przeanalizowano wpływ tego antybiotyku na maszynerie translacyjną w komórkach szczepu kontrolnego. Analiza polisomów w obecności G418 wykazała, że w obecności tego antybiotyku profil polisomów nie odbiega znacząco od układu kontrolnego, z taką różnicą, że wartość P/M zmniejszyła się wskazując, że ilość rybosomów zaangażowanych w translację spadła (Fig. 37). Analiza profili polisomów w tzw. eksperymencie „runoff” w obecności 100 µg/ml G418 wykazała brak frakcji polisomalnej oraz akumulacje monosomów 80S, podobnie jak w układzie kontrolnym (Fig. 27B). Ponadto, w analizie wydajności translacji

Wyniki

80 w obecności G418 zaobserwowano spadek wydajności tego procesu. Przypomina to zachowanie zaobserwowane w komórkach mutanta drożdżowego uL10Δh1h2. Zatem, dodatkowo porównano profile polisomów uzyskane przy użyciu jednakowej liczby komórek szczepu dzikiego w obecności lub braku G418. Obliczone całkowite pole powierzchni polisomów, dla komórek szczepu dzikiego hodowanych w obecności G418, wykazuje o 60% mniejszą frakcję rybosomalną niż pole powierzchni polisomów dla komórek nietraktowany G418 (Fig. 37). Zatem, obniżenie wydajności translacji związane jest z obniżeniem ilości rybosomów w komórce drożdżowej. Podsumowując, działanie antybiotyku G418 na szczep kontrolny z grupy aminoglikozydów nie upośledza znacząco poszczególnych etapów translacji realizowanych przez rybosom, podobnie do zachowania się maszynerii translacyjnej w mutancie uL10Δh1h2.

Wyniki

81

3. W

P