Badania biologiczne tiopochodnych CA-4

Badanie cytotoksyczności (test żywotności komórek – MTT) oraz wpływ na proces polimeryzacji tubuliny in vitro

Wszystkie otrzymane tiopochodne CA-4 zostały przebadane pod kątem ich aktywności cytotoksycznej na wybranych liniach komórek nowotworowych: MCF7, MDA-MB-231, A439, HeLa, A549, SKOV3 i prawidłowych HaCaT i CCD39Lu. Identycznie jak w przypadku tiopochodnych RSV posłużono się testem MTT. Przeprowadzenie prób testów MTT dla poszczególnych linii komórkowych pozwoliło określić odpowiedni zakres stężeń związków badanych i związku referencyjnego (CA-4) a mianowicie: od 0-20 M. Inkubacja związków badanych oraz związku referencyjnego w każdym teście wynosiła 48 godzin. Dla każdego stężenia wykonano 3 powtórzenia próby, a każda inkubacja wykonywana była w trzech niezależnych eksperymentach. Wyniki testów MTT pokazujących wpływ badanych tiopochodnych CA-4 oraz związku referencyjnego (CA-4) na procent przeżywających komórek (100% przyjęto dla grupy kontrolnej, w której stężenie badanego związku wynosiło 0 µM) przedstawiono na rysunkach 63-67.

Z uwagi, iż wśród tiopochodnych CA-4 występowały związki prezentujące cztery opisane wcześniej struktury rdzeniowe wyniki testów MTT zestawiono porównując

179

obok siebie w miarę możliwości związki charakteryzujące się różną strukturą rdzenia, ale posiadające ten sam układ podstawników w pierścieniach fenylowych.

Rysunek 63. Wpływ tiopochodnych CA-4 (KomOx1, KomOx3, KomNMeI1, KomNMeI2) na przeżywalność komórek badanych linii (test MTT, 48 godz.)

Rysunek 64. Wpływ tiopochodnych CA-4 (KomOx2, KomOx4) na przeżywalność komórek badanych linii (test MTT, 48 godz.)

180

Rysunek 65. Wpływ tiopochodnych CA-4 (KomOx5, KomOx6, KomOx7, KomNMeI5, KomNMeI6, KomNMeI7) na przeżywalność komórek badanych linii (test MTT, 48 godz.)

181

Rysunek 66. Wpływ tiopochodnych CA-4 (Kom-C4, Kom-C6, Kom4, Kom6) na przeżywalność komórek badanych linii (test MTT, 48 godz.)

Rysunek 67. Wpływ CA-4 na przeżywalność komórek badanych linii (test MTT, 48 godz.)

Następnie wszystkie związki poddano badaniom skrinigowym w teście oceniającym ich wpływ na proces polimeryzacji tubuliny. Zastosowano stężęnie 10 M. Jako związku referencyjnego używano CA-4. W oparciu o przeprowadzone badania skrinigowe zostały sporządzone następujące założenia umożliwiające oszacowanie wpływu badanych związków:

 IC₅₀ < stężenia 10 µM zmniejsza szybkość polimeryzacji o 60–70%  IC50 ~ stężenia 10 µM zmniejsza szybkość polimeryzacji o 40–60%  IC50 > stężenia 10 µM zmniejsza szybkość polimeryzacji o 20–40%

182

 IC50 >> stężenia 10 µM brak wpływu na szybkość polimeryzacji

Dla dwóch najbardziej aktywnych inhibitorów KomOx3 i KomOx7 wyznaczono wartości IC50. W tym celu dla czterech stężeń związków badanych 1, 2, 5 i 10 M oraz kontroli wyznaczono przebieg krzywych polimeryzacji tubuliny w funkcji czasu (Rysunek 68).

Rysunek 68. Wpływ związków KomOx7 (A) i KomOx3 (B) na proces polimeryzacji tubuliny

Wyniki wszystkich badań cytotoksyczności oraz wpływu na proces polimeryzacji tubuliny wraz z rankingiem otrzymanym za pośrednictwem metody VCL-VS wyrażonym wartością konsensusowej funkcji oceniające „Cscore” zestawiono w tabeli 26.

Tabela 26. Wyniki badań aktywności cytotoksycznej i antymitotoycznej tiopochodnych CA-4 wraz z ich rankingiem VS (Cscore) Związek Linia, IC50 ± SD [M] Polimeryzacja tubuliny [µM] Ranking VS CScore

A431 HaCaT MCF7 MDA-MB-231 HeLa CCD39Lu A549 SKOV3

KomOx1 >20 >20 1.43±0.37 >20 7,33±0,91 >20 >20 >20 ~ 10 3 KomOx2 1.22±0.82 1.28±0.75 2.11±0.57 2.87±0.34 4,44±0,97 >20 >20 3,18±0,26 < 10 4 KomOx3 0.25±0.20 0.32±0.09 0.45±0.14 0.71±0.16 0,009±0,002 >20 >20 0,25±0,12 0.64 5 KomOx4 0.43±0.29 0.43±0.23 0.60±0.10 0.85±0.13 0,645±0,03 >20 >20 1,48±0,16 ~10 3 KomOx5 >20 16.74±2.64 1.42±0.23 17.87±0.90 >20 >20 >20 >20 >> 10 2 KomOx6 0.41±0.30 0.26±0.10 2.48±0.64 0.76±0.10 0,44±0,04 >20 >20 1,03±0,12 < 10 3 KomOx7 0.43±0.31 0.52±0.08 2.78±0.77 0.92±0.14 0,63±0,04 >20 >20 1,16±0,13 1.61 2 KomNMel1 >20 >20 2.29±0.46 >20 >20 >20 >20 >20 >> 10 3 KomNMel2 0.43±0.33 0.50±0.09 1.63±0.27 0.39±0.28 0,39±0,02 >20 >20 1,72±0,14 > 10 4 KomNMeI5 16.57±3.71 >20 2.51±0.87 >20 8,18±2,28 6,13±0,75 >20 >20 >> 10 1 KomNMeI6 13.64±3.23 >20 2.20±0.57 15.45±0.37 >20 19,26±2,14 >20 >20 >> 10 2 KomNMeI7 >20 >20 5.24±1.11 >20 >20 >20 >20 brak efektu >> 10 3 Kom-C4 >20 brak efektu 0.95±0.33 brak efektu >20 brak efektu brak efektu brak efektu >>10 1 Kom-C6 >20 brak efektu 1.84±0.36 brak efektu >20 brak efektu brak efektu brak efektu ~ 10 2 Kom4 3.61±2.44 9.56±3.03 0.65±0.19 11.73±0.85 6,18±0,46 >20 >20 14,47±1,25 ~ 10 3 Kom6 8.22±4.66 12.82±1.83 2.35±1.04 14.20±0.54 11,68±2,54 >20 >20 14,08±0,61 >> 10 2 CA-4 0.25±0.21 0.19±0.08 0.17±0.04 0.56±0.08 0,11±0,11 >20 >20 0,38±0,09 2.3-2.8 5 Wyniki i dy skusja 183

184

Analizując wyniki zaprezentowanych badań aktywności przeciwnowotworowej tiopochodnych CA-4 widać generalnie ścisłe zależności pomiędzy poziomem aktywności cytotoksycznej i antymitotycznej opartej na zdolności do hamowania polimeryzacji tubuliny.

Związki najbardziej aktywne antymitotycznie, a więc tiopochodne oksazolowe CA-4 KomOx3 i KomOx7 wykazują jednocześnie najsilnijeszy efekt cytotoksyczny w badanych liniach komórek nowotworowych. Ponadto wyznaczone wartości IC50 w odniesieniu do hamowania polimeryzacji tubuliny są większe od związku referencyjnego CA-4 odpowiednio: 0,64 M dla związku KomOx3 oraz 1,61 M dla pochodnej KomOx7 vs 2,3-2,8 M dla CA-4. Oba związki wykazują działanie cytotoksyczne wobec linii komórek prawidłowych fibroblastów CCD39Lu przy znacznie wyższym stężeniu wynoszącym ponad 20 M. Można więc mówić w aspekcie badanej linii CCD39Lu o ich selektywnym działaniu przeciwnowotworowym. Jednocześnie w przypadku linii prawidłowej keratynocytów HaCaT nie zauważono różnicy w działaniu w stosunku do linii nowotworowej raka skóry A431. Co ciekawe CA-4 wykazuje równie wysoką cytotoksyczność zarówno dla badanych linii komórek nowotworowych, jak i prawidłowych.

Porównując związki w odniesieniu do różnych rdzeni molekularnych można stwierdzić, iż pochodne oksazolowe charakteryzują się wyższą aktywnością zarówno cytotoksyczną, jak i antymitotyczną w porównaniu do ich odpowiedników N-metyloimidazolowych (związek KomOx1 vs KomNMeI1, KomOx3 vs

KomNMeI2, KomOx5 vs KomNMeI5, KomOx6 vs KomNMeI6 oraz KomOx7 vs KomNMeI7). Największe różnice widoczne są dla związków KomOx5 i KomOx7 w

porównaniu do ich analogów KomNMeI5 i KomNMeI7. Widoczne różnice w aktywności prezentują również pochodne w grupie Kom-C i Kom. Zwiąki Kom-C4 i

Kom-C6 praktycznie nie wykazują działania cytotoksycznego oraz wpływu na proces

polimeryzacji tubuliny. Natomiast ich odpowiedniki Kom4 i Kom6 mają wyższe aktywności cytotoksyczne.

Uwzględniając z kolei wpływ podstawienia pierścieni fenylowych na efekt aktywności przeciwnowotworowej w badanych testach widać, iż najbardziej preferowane jest podstawienie pierścenia B w pozycjach 3 i 4 uwzgledniając wystepujce w związkach podstawniki (metoksyl, hydroksyl, metylotiol, tiol) – związki

185

podstawników w tych pozycjach i podstawienie grupą metylotiolową pierścienia A w pozycji 2 znacznie zmniejsza aktywność cytotoksyczną i antymitotyczną – związki

KomOx1, KomNMeI1, Kom-C6, Kom6. Ponadto podstawienie pierścienia B

jednocześnie w pozycjach 3,4,5 powoduje znaczne obniżenie cytotoksyczności i aktywności antmitotycznej takich pochodnych – związki KomOx5 i KomNMeI5. Konfrontując uzyskane wyniki z doniesieniami literaturowymi nt. badań SAR pochodnych CA-4 można powiedzieć, iż są one zgodne z występującymi tutaj zależnościami [95, 96, 106].

Porównując wyniki aktywności antmitotycznej opartej o wpływ na polimeryzację tubuliny z badanimi in silico opartymi na protokole VCL-VS widać, iż charakteryzują się one dużą korelacją. Można powiedzieć, że przyjęty model predykcyjny był w stanie z dużym prawdopodobieństwem przewidzieć, które związki powinny charakteryzować się większą, a które mniejszą aktywnością antymitotyczną. Dla najbardziej aktywnego związku KomOx3 w badanej gupie tiopochodnych CA-4 model przewidział jego aktywność dając mu najwyższą z możliwych ocen 5. Jednakże w przypadku drugiego w kolejności związku aktywnego KomOx7 model nie był w stanie przewidzieć jego wysokiej aktywności dając mu ocenę 2. Należy jednak podkreślić, iż żaden z obecnie wykorzystywanych modeli predykcyjnych w procedurze wirtualnego skriningu nie jest w stanie idealnie przewidzieć aktywności dla badanej populacji związków. Związane jest to głównie z niedostateczną ilością danych na temat samego miejsca wiążącego (niewystarczająca rozdzielczość zdeponowanych w bazie PDB struktur krystalograficznych kompleksów liganda z receptorem), nie braniem pod uwagę warunków panujących w środowisku in vivo (dokowanie molekularne wykonywane jest zazwyczaj w próżni) i wpływu innych nieznanych obecnie czynników, które mogą powodować specyficzne zachowanie białka docelowego (celu molekularnego). Zastosowany model predykcyjny wymaga dalszej walidacji oparciu o uzyskane wyniki aktywności biologicznej tiopochodnych CA-4 co powinno poprawić jego skuteczność.

186