Określenie aktywności związku lub innymi słowy efektywności powinowactwa względem enzymu można określić wyznaczając wartość IC50 (half maximal inhibitory concentration) lub wartość Ki będąca parametrem zdefiniowanym w oparciu o kinetykę procesu wiązania się inhibitora z enzymem, a więc odzwierciedla siłę powinowactwa liganda do białka. Stężenie potrzebne do uzyskania połowy maksymalnego efektu inhibicji (IC50) jest to ilościowa miara potencjału substancji do hamowania specyficznej funkcji biochemicznej lub biologicznej.
Powszechnie jest stosowana jako miara antagonizmu substancji w warunkach in vitro.
63
Odpowiednikiem tego wskaźnika w warunkach in vivo jest EC50, który określa stężenie leku w osoczu dla uzyskania 50 % maksymalnego efektu (lub w uproszczeniu ED50 jako dawka wywołująca odpowiedź u połowy populacji). IC50 nie jest bezpośrednim wskaźnikiem powinowactwa chociaż oba te parametry można skorelować w przypadku agonistów i antagonistów kompetycyjnych, stosując równanie Cheng-Prusoff’a [214].
Równanie 2. [S] – stężenie inhibitora, Km – stężenie inhibitora przy którym aktywność enzymu jest połową maksymalnej.
𝐾𝑖 = 𝐼𝐶50 1 +[𝑆]
𝐾𝑚
Z równania wynika, że wartość IC50 jest zawsze wyższa od wartości Ki. Stała dysocjacji Ki
definiowana jest kinetycznie jako stosunek stałych szybkości reakcji asocjacji i dysocjacji, jednocześnie nie zależąc od stężenia enzymu. Inna często wykorzystywana metoda określania IC50 polega na regresji równania logistycznego o czterech parametrach, które odzwierciedla charakterystykę wielu zjawisk biologicznych.
Równanie 3. Logistyczne równanie, odzwierciedlające charakterystykę zjawisk naturalnych
𝑦 = 𝑑 + 𝑎 − 𝑑 1 + (𝑥 𝑐)
𝑏
Parametr c określa punkt przegięcia krzywej, parametr b określa nachylenie krzywej, a więc punkt gdzie krzywa o przebiegu sigmoidalnym pomiędzy asymptotami określającymi minimum oraz maksimum. Dopasowanie krzywej następuje numerycznie, na przykład metodą najmniejszych kwadratów. Wartość IC50 uzyskuje się na podstawie przebiegu dopasowanej krzywej, a punkt centralny na krzywej (wartość współczynnika c) po operacji dopasowania stanowi wyznaczoną w ten sposób wartość IC50. Metodę tę można uważać za uproszczenie równania Hilla [215], będącego równaniem różniczkowym, które opisuje jaka część makromolekuły wysycona ligandem jako funkcję stężenia ligandu. Cztero-współczynnikowy model równania logistycznego Hilla służy do modelowania teoretycznej zależności pomiędzy stężeniem inhibitora a odpowiedzi biologicznej i stosować go można do obliczenia wartości IC50. Zależność ta stanowi podstawę strategii badań przesiewowych, które polegają na określaniu procentowej inhibicji przy ujednoliconej wartości stężenia [216]. Następnym krokiem jest walidacja krzywej opisującej reakcję na dawkę (concentration – response curve).
Określenie IC50, będącej miarą efektywności opiera się na dopasowaniu krzywej logistycznej, o której wspomniano wcześniej, chociaż stosuje się także inne bardziej złożone modele. Do walidacji wybiera się związki dla których określono siłę inhibicji dla 3 – 6 stężeń lub te które przekroczyły ustaloną wartość inhibicji dla pojedynczego stężenia. Jednakże w praktyce nie zawsze obserwuje się dobrą korelację. Podkreślić należy, że metoda oparta na dopasowaniu
64
krzywej logistycznej służy do przewidywania wartości IC50, którą zmierzyć można wyłącznie jako zaobserwowany efekt biologiczny. Dopasowanie krzywej na podstawie danych dla 6 różnych, odpowiednio dobranych stężeń, pozwala na użyteczną predykcję. Porównywanie wartości IC50 pozwala porównywać efektywność leków przy stosowaniu standaryzowanych oznaczeń.
W niniejszej rozprawie2 zdecydowano się określić jedynie poziom zahamowania enzymów przy stałym stężeniu badanych związków. Wyniki nie służyły bowiem jako podstawa do dalszej optymalizacji struktury wiodącej a wstępnej ich klasyfikacji do puli związków aktywnych, znacząco aktywnych i nie wykazujących aktywności. Dla najbardziej obiecujących związków przeprowadzono rozszerzone pomiary pozwalające na wyznaczenie parametru IC50. Wyniki omówiono odnosząc się do oznaczonej aktywności dla dasatynibu – inhibitora o szerokim spektrum działania oraz imatynibu, czyli inhibitora selektywnego względem kinazy BCR-ABL1WT.
Tabela 11. Oznaczenie parametru IC50 dla kilku wybranych kandydatów i porównanie do aktywności dasatynibu.
IC50 (nM)
Jako cele molekularne w przeprowadzonych badaniach wybrano grupę ośmiu kinaz tyrozynowych w której szczególnie wyróżnić można ABL1 oraz kinazy przynależące do rodziny Src. Dobór podyktowany był znaczeniem jakie mają mutacje tych kinaz w nowotworzeniu i jednocześnie w regulowaniu mechanizmu apoptozy [217]. Kinazy wykazują zróżnicowaną ekspresję w zależności od linii komórek.
2 Badania aktywności biologicznej zostały wykonane we współpracy z dr Katarzyną Malarz z Instytutu Fizyki Uniwersytetu Śląskiego, częściowo w ramach projektu preludium "Spojrzenie na aktywność biologiczną i mechanizm działania nowych pochodnych styrylochinazoliny, jako inhibitorów kinaz tyrozynowych” NCN 2016/23/N/NZ7/00351.
65
Tabela 12. Wyniki testów na inhibicję panelu kinaz.
inhibitor Efekt hamujący kinazy tyrozynowe, %
Nr. Structure ABL
66
67
68
69 nieaktywne lub wykazujące nieznaczną aktywność wobec niektórych kinaz, oznaczone kolorem zielonym. Do grupy tej przynależą między innymi związki 5, 8, 3b, 4b, 5b, 13b. Druga grupa to związki selektywne o aktywności głównie w zakresie pomiędzy 40 – 60 % i aktywne wobec mniej niż trzech kinaz. Reprezentantami tej grupy to między innymi związki 1, 3, 7, 9, 12, 8b, 13c. Związki te można traktować jako struktury wiodące. Szczególnie te niepodstawione przy C-4 atomie chinazoliny. Ostatnia grupa to związki, które wykazują się
70
niską selektywnością i jednocześnie wykazują aktywność przekraczającą 60% w badanym stężeniu przynajmniej dla jednej z kinaz. W grupie tej znajdują się 6, 2b, 6b, 1c, 6c. Można zauważyć, że więcej jest w tej grupie związków o bardziej rozbudowanej strukturze, chociaż można się spodziewać, że mniejsze fragmenty wykażą niższą selektywność. Układy te w większości są rozwinięciem struktury związku 4, stanowiącego fragment 2-[(E)-2-(2-metoksyfenylo)etenylo]chinazolin-4(3H)-onu. Na wyróżnienie zasługują dwie pary związków, których struktury zaprezentowano na rysunku 35. Związek 6b jest inhibitorem o szerokim spektrum. Przykładowo IC50 dla ABL1 wynosi 182 nM. Związek 10c wykazuje słabą lub szczątkową aktywność względem testowanych kinaz. Względem ABL1 jest nieaktywny.
Związek 3b można uznać za nieaktywny, w przeciwieństwie do 1c, który jest inhibitorem o szerokim spektrum, przewyższającym aktywność związku 6b.
Rysunek 35. Zestawienie dwóch par struktur, różniących się pomiędzy sobą grupą NH oraz S.
N
Ponieważ w literaturze odnaleźć można przykłady struktur o analogicznym sposobie podstawienia chinazoliny, to porównać można wpływ podstawnika 2-styrylowego na aktywność otrzymanych kandydatów. Na poniższym rysunku przedstawiono opatentowane cząsteczki, będące aktywne względem kinazy Lck [218]. Czerwoną linią zaznaczono wspólne fragmenty strukturalne. W bezpośrednim porównaniu do związków na rysunku 36, struktury 3b, 4b, 11b, 7c, 8c nie wykazują aktywności hamującej Lck, natomiast mniej podobne cząsteczki 3b, 4b, 11b, 7c, 8c są aktywniejsze. Jednakże należy mieć na względzie, że mechanizm wiązania z miejscem aktywnym może być w tych przykładach odmienny.
Rysunek 36. Struktury znanych inhibitorów wykazujących inhibicję kinazy Lck.
N