Badania dotyczące modyfikowanych TiO 2

4.2.2.1. Peroksydacja lipidów w układzie liposomów POPC:cholesterol

A

B

Rys.56 Kinetyka spadku stężenia tlenu cząsteczkowego indukowanego światłem niebieskim (A) oraz zielonym (B) w obecności 0.1 g/dm3 Hmx@TiO2 i Brp@TiO2 w układzie z liposomami POPC:Cholesterol (1:1) o stężeniu w próbce 5 mM oraz z lub bez 2 mM NADH (szczegółowy opis w legendzie).

Wyniki

113 Pomiary konsumpcji tlenu metodą tlenometrii EPR towarzyszącej fotosensybilizowanej peroksydacji lipidów pokazują, iż naświetlanie modyfikowanych TiO2 zarówno światłem niebieskim (Rys.56A) jak i zielonym (Rys.56B) w układzie z liposomami POPC:Chl, prowadzi do spadku stężenia tlenu w próbce. W obecności NADH efekt ten jest przynajmniej kilkakrotnie większy. Tempo fotokonsumpcji tlenu jest również większe w przypadku, gdy używano światła niebieskiego w porównaniu do zielonego. Dla Hmx@TiO2 z 5 mM POPC:Chl szybkość konsumpcji tlenu wynosi: 1.02·10-4 mM/s. Natomiast gdy do układu wprowadzimy 2 mM NADH wzrasta do wartości 2.14·10-3 mM/s. Dla Brp@TiO2 uzyskano odpowiednio: 1.52·10-4 mM/s i 1.66·10-3 mM/s (Rys.57). Naświetlanie samych liposomów w warunkach prowadzenia eksperymentów z modyfikowanym TiO2 nie powoduje spadku stężenia tlenu w próbce.

Rys.57 Szybkość konsumpcji tlenu podczas naświetlania liposomów POPC:Chl w obecności 0.1 g/dm3 Hmx@TiO2 oraz 0.1 g/dm3 Brp@TiO2. Stężenie NADH wynosi 2 mM. Kinetyka indukowana światłem z zakresu 404-510 nm. W obu przypadkach stosowano znacznik spinowy mHCTPO o stężeniu równym 100 µM.

Wyniki

114 Naświetlanie liposomów w warunkach tlenowych, w obecności modyfikowanych TiO2: Brp@TiO2 jak i Hmx@TiO2, powoduje akumulację wodoronadtlenków lipidów (Rys.58A). Prowadzone eksperymenty umożliwiają oznaczenie charakterystycznych produktów utleniania cholesterolu przez tlen singletowy (5α-OOH, 6α-OOH i 6β-OOH) oraz wolne rodniki (OOH). Obserwowane wodoronadtlenki cholesterolu: 7α/β-OOH, 5α-7α/β-OOH, 6α-OOH oraz 6β-OOH po 360 s naświetlania Brp@TiO2 i Hmx@TiO2 wobecności 5 mM liposomów nie były wykrywalne dla kontroli w ciemności oraz w przypadku naświetlania samych liposomów POPC-Chl światłem niebieskim (wyniki niezamieszczone). W przypadku Brp@TiO2 obserwuje się większą ilość ChOOH niż w przypadku Hmx@TiO2 (Rys.58 i Rys.59). Są to głównie produkty wolnorodnikowej peroksydacji lipidów (pik 7α/β-OOH). Dla Hmx@TiO2 obserwuje się również istotną akumulację 5α-OOH, 6α-OOH oraz 6β-OOH wodoronadtlenków cholesterolu (Rys. 59B).

A B

Rys.58 Rozdział HPLC i elektrochemiczna detekcja produktów fotosensybilizowanego utleniania liposomów POPC:Ch o stosunku molowym 1:1 i łącznym stężeniu 5 mM po 360 s naświetlania (światło niebieskie, 59 mW/cm2, temperatura 25 °C) w obecności 0.1 g/dm3 Brp@TiO2 oraz 2 mM NADH, 25 µM FeQ, zgodnie z opisem w legendzie (A). Stężenia poszczególnych wodoronadtlenków cholesterolu (B).

Wyniki

115

A B

Rys.59 Rozdział HPLC i elektrochemiczna detekcja produktów fotosensybilizowanego utleniania liposomów POPC:Ch (1:1) i stężeniu 5 mM po 360 s naświetlania (światło niebieskie, 59 mW/cm2, temperatura 25 °C) w obecności 0.1 g/dm3 Hmx@TiO2 oraz 2 mM NADH, 25 µM FeQ, zgodnie z opisem w legendzie (A). Stężenia poszczególnych wodoronadtlenków cholesterolu (B).

Fotosensybilizowana peroksydacja lipidów w obecności NADH charakteryzuje się przede wszystkim istotnie zwiększoną produkcją 7α/β-OOH (stężenie wzrasta ponad 5– krotnie dla Brp@TiO2 i ponad 4-krotnie dla Hmx@TiO2) w stosunku do układu bez donora elektronu (Rys.58B, 59B). Z drugiej strony dodatek NADH powoduje obniżenie stężenia rejestrowanych: 5α-OOH oraz 6α i 6β-OOH w stosunku do kontroli w przypadku Hmx@TiO2 i całkowity zanik w/w pików dla Brp@TiO2 (Rys.58B, 59B). Naświetlanie układu zawierającego fotosensybilizator, NADH i kompleks żelaza z 8-hydroksychinoliną, zarówno w przypadku Brp@TiO2 jak i Hmx@TiO2, powoduje istotne zmniejszenie akumulacji 5α-OOH wodoronadtlenków cholesterolu oraz zanik pików dla 6α i 6β –OOH (w stosunku do układu kontrolnego tj. modyfikowany TiO2 + liposomy). Równocześnie obserwuje się ponad dwukrotny wzrost stężenia 7α/β-OOH

Wyniki

116 w przypadku Hmx@TiO2 (Rys.59B). Dla Brp@TiO2 zarejestrowane stężenie w badanym układzie jest ok. 40% niższe niż w kontroli (Rys.58B).

W celu dalszej analizy śledzono akumulację poszczególnych wodoronadtlenków cholesterolu ChOOH w zależności od czasu naświetlania. Podobnie jak w badaniach fulerenów liczba adduktów 1O2 z cholesterolem: 5α-OOH (Rys.60B), 6α-OOH i 6β-OOH wzrastała liniowo z czasem oraz produktów reakcji wolnorodnikowych - 7α/β-OOH (Rys.60A). Stężenie 7α/β-OOH w mieszaninie reakcyjnej przyrastało ok. 7 razy szybciej niż 5α-OOH (1.2·10-2 µM/s w stosunku do 1.85·10-3 µM/s) oraz ponad 8 razy, gdy do układu wprowadzono donor e – NADH (9·10-2 µM/s) w stosunku do układu samego Brp@TiO2 (Rys.60A). W przypadku Hmx@TiO2 przyrost stężenia 7α/β-OOH był również większy w porównaniu do 5α-OOH (6.5·10-3 µM/s w stosunku do 5.76·10-3 µM/s). Różnice te są znacznie mniejsze w odniesieniu do Brp@TiO2. W obecności NADH i żelaza w układzie fotosensybilizowanym przez Brp@TiO2 następuje istotna redukcja wodoronadtlenków cholesterolu a tym samym wydatne zmniejszenie ich akumulacji (Rys.60A i B).

A B

Rys.60 Kinetyka akumulacji 7α/β-OOH (A) oraz 5α-OOH (B) wodoronadtlenków cholesterolu podczas naświetlania 0.1 g/dm3 Brp@TiO2 w układzie z liposomami POPC:Ch światłem niebieskim.

Wyniki

117 Modyfikowane TiO2: Brp@TiO2 i Hmx@TiO2 indukują fotosensybilizowaną peroksydację lipidów w układzie liposomów wielowarstwowych POPC:Chl. Głównym produktem utleniania cholesterolu jest w tym przypadku 7α/β-OOH, co pozwala wnioskować, iż kluczowym mechanizmem odpowiedzialnym za peroksydację lipidów są reakcje wolnorodnikowe. Znaczące zwiększenie akumulacji wodoronadtlenków cholesterolu obserwuje się po wprowadzeniu do układu donora elektronu – NADH.

Wyniki

118 4.2.2.2. Fotosensybilizowana peroksydacja lipidów na modelu

komórkowym linii B16

A B

C D

Rys.61 Stężenia specyficznych wodoronadtlenków cholesterolu: 7α/β-OOH, 5α-OOH oraz 6α i 6β-OOH jako produktów fotosensybilizowanego utleniania endogennych lipidów błonowych komórek B16F0 (A, B) i B16F10 (C, D) po 30 min naświetlania (λ=405 nm, 26 mW/cm2) w obecności modyfikowanych TiO2, zgodnie z opisem w legendzie.

Wyniki

119 Naświetlanie komórek melanomy B16, w obecności modyfikowanych TiO2, prowadzi, do peroksydacji lipidów błonowych tych komórek, obserwowanej poprzez akumulację wodoronadtlenków cholesterolu za pomocą detekcji HPLC-EC(Hg). Otrzymane chromatogramy i wyznaczone na ich podstawie stężenia ChOOH wskazują na obecność głównie 7α/β-OOH i 5α-OOH wodoronadtlenków cholesterolu we wszystkich czterech grupach badawczych (Rys.61A-D). Sumarycznie największa akumulacja wodoronadtlenków lipidów ma miejsce w przypadku naświetlania komórek B16F10 w obecności 0.1 mg/ml Hmx@TiO2 (Rys.61D). Produkcja wodoronadtlenków cholesterolu zależnych od wolnych rodników (7α/β-OOH) jest kilkukrotnie wyższa niż wodoronadtlenków powstających na skutek oddziaływania z tlenem singletowym (5α-OOH, 6α-OOH i 6β-OOH) dla wszystkich badanych układów. W przypadku Brp@TiO2 obserwuje się zależne od stężenia zwiększenie ilości rejestrowanych 7α/β-OOH i 5α-OOH (Rys.61A i C). Dla Hmx@TiO2 akumulacja 7α/β-OOH wykazuje te same tendencje jak dla Brp@TiO2. Natomiast w przypadku naświetlania komórek B16FO dla wyższego stężenia PS obserwuje się 3-krotnie mniejszą akumulację 5α-OOH (Rys.61B). Dla eksperymentów kontrolnych tj. dla komórek inkubowanych w ciemności w obecności fotosensybilizatora, nie zarejestrowano żadnych charakterystycznych dla wodorotlenków cholesterolu pików (kontrola w ciemności Rys.61A-D).

Podobnie jak w przypadku liposomów POPC:Chl, modyfikowane ditlenki tytanu indukują fotosensybilizowaną peroksydację lipidów błonowych w układzie komórek nowotworowych B16. Analiza charakterystycznych produktów utleniania cholesterolu pozwala na stwierdzenie, iż głównym mechanizmem peroksydacji w tym przypadku, jest oddziaływanie z wolnymi rodnikami generowanymi przez Hmx@TiO2 i Brp@TiO2. Detekcja niewielkich ilości wodoronadtlenku 5α-OOH nie wyklucza również udziału tlenu singletowego w badanym procesie.

Wyniki

120

4.3. Efektywność fotodynamiczna fotosensybilizatorów w układzie