Badania genetyczne: Ocena wpływu polimorficznych wariantów genów

KOMBINACJI TYCH GENÓW ORAZ TRANSPORTERA SEROTONINY NA PALENIE TYTONIU

Do kliniczno-kontrolnych badań włączono 310 dorosłych osób, w tym 150 bieżą-cych lub byłych palaczy tytoniu oraz 160 osób nigdy nie paląbieżą-cych. Poza statusem pale-nia tytoniu, w doborze osób do grup przypadków i kontroli uwzględpale-niano płeć. Wszyst-kie osoby były polsWszyst-kiej narodowości. Rekrutację osób do badania przeprowadzono wśród pacjentów i personelu Akademickiego Centrum Klinicznego w Gdańsku oraz pa-cjentów Katedry i Zakładu Lekarza Rodzinnego Uniwersytetu im. Mikołaja Kopernika w Toruniu - Collegium Medicum w Bydgoszczy (UMKT-CMB). Status palenia tytoniu, przy przyjęciu definicji postaw wobec palenia wg WHO, określany był w trakcie wstępnej rozmowy przed rekrutacją [116, 181, 374]. Za osobę nigdy nie palącą uzna-wano tę, która albo nigdy nie sięgnęła po papierosa, albo wypaliła w ciągu życia mniej niż 100 papierosów [374], natomiast za byłych palaczy uznawano osoby, które nie pali-ły papierosów co najmniej od roku. Do badania włączono tylko te osoby, które wyrazipali-ły pisemną zgodę na udział w badaniu po zapoznaniu się z jego celem, procedurach i ewentualnych zagrożeniach dla uczestników. Projekt został zaaprobowany przez obie komisje ds. etyki i badań naukowych - przy Akademii Medycznej w Gdańsku oraz przy UMKT-CMB.

U byłych palaczy, w celu weryfikacji abstynencji tytoniowej, przeprowadzano po-miar tlenku węgla w powietrzu wydychanym przy użyciu miernika Micro CO (Bedfont Instruments, Kent, UK). Z wszystkimi badanymi przeprowadzano wywiad kwestiona-riuszowy, odnotowując dane demograficzne (wiek, płeć, stopień wykształcenia: pod-stawowe, zawodowe, średnie, wyższe), wiek rozpoczynania regularnego palenia, liczbę papierosów wypalanych dziennie oraz długość trwania nałogu. Bieżący palacze pytani byli także o długość maksymalnego okresu abstynencji tytoniowej podczas prób rzuca-nia palerzuca-nia w przeszłości. Czas ten przeliczano na dni. Liczbę paczkolat obliczano na podstawie długości trwania nałogu i liczby papierosów wypalanych dziennie. U bieżą-cych palaczy stopień uzależnienia od tytoniu określano przy użyciu kwestionariusza

Fagerströma [128]. Uczestnicy badania pytani byli również o inne uzależnienia, a także o aktualne lub przebyte w przeszłości zaburzenia psychiczne oraz o przyjmowane w związku z nimi leki. Wywiad dotyczył także palenia papierosów przez krewnych pierw-szego stopnia, tj. rodziców, rodzeństwo i dzieci. Obliczano częstości palenia tytoniu w rodzinach, dzieląc liczbę palących krewnych pierwszego stopnia probanda przez liczbę wszystkich jego krewnych o tym stopniu pokrewieństwa.

Od wszystkich uczestników pobierano próbki 8 ml krwi obwodowej do probówek zawierających etylenodwuaminoczterooctan (EDTA). Krew zamrażano i do czasu wy-konania analizy molekularnej przechowywano w temperaturze –80⁰C. Badania moleku-larne wykonano w laboratorium A&A Biotechnology, Gdynia. Izolację genomowego DNA z krwi obwodowej wykonano metodą enzymatyczną za pomocą komercyjnego zestawu Blood DNA Prep Plus (A&A Biotechnology).

Analiza molekularna

Badanie polimorfizmu genu receptora dopaminy DRD2 wykonano z zastosowa-niem techniki długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP; restriction fragment length polymorphism), na podstawie metody opisanej wcześniej przez innych autorów [114, 318]. Za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR; polymerase chain reaction), przy użyciu polimerazy Taq i specyficznych starterów [37, 236] amplifikowano frag-menty genu DRD2 zawierające miejsca polimorficzne TaqIA i TaqIB. W wyniku ampli-fikacji otrzymywano produkty o długości 310 par zasad (pz) dla fragmentu zawierają-cego miejsce polimorficzne TaqIA i 459 pz dla fragmentu zawierajązawierają-cego miejsce poli-morficzne TaqIB. Pierwotne produkty PCR poddawane były trawieniu przez enzym re-strykcyjny TaqI, który rozpoznawał sekwencję obecną w allelu A2 (otrzymywano dwa fragmenty o długości 180 i 130 pz), a nieobecną w allelu A1, dla którego zamplifikowa-ny fragment pozostawał niestrawiozamplifikowa-ny (310 pz). Ten sam enzym restrykcyjzamplifikowa-ny rozpozna-wał sekwencję obecną w allelu B2 (otrzymywano dwa fragmenty o długości 267 i 192 pz), a nieobecną w allelu B1, dla którego zamplifikowany fragment pozostawał nie strawiony (459 pz). Identyfikacji powyższych fragmentów dokonywano za pomocą elektroforezy na 3% żelach agarozowych barwionych bromkiem etydyny i wizualizacji w świetle UV (Aneks; ryc. 10 i 11).

Badanie polimorfizmu genu transportera dopaminy (SLC6A3) wykonano na pod-stawie metody opisanej przez Sano i wsp. [293]. Amplifikację regionu, zawierającego miejsce polimorficzne typu VNTR (variable number of tandem repeats), tj. o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń fragmentu o długości 40 par zasad, wykonano przy użyciu polimerazy Taq i specyficznych starterów, określonych przez Vanderbergha i wsp. [353] w reakcji PCR. W wyniku amplifikacji otrzymywano produkt o długości 450 pz dla allelu „dzikiego”. Dla potwierdzenia, że amplifikacja została przeprowadzona właściwie, stosowano metodę RFLP. W wyniku cięcia enzymem restrykcyjnym SphI otrzymywano fragment o długości 40 pz, co oznaczało, że miejsce cięcia jest obecne w każdym elemencie repetytywnym. Produkty uzyskane w wyniku cięcia enzymem re-strykcyjnym identyfikowano w 3% żelu agarozowym, barwionym bromkiem etydyny (Aneks; ryc. 12)

W badaniu polimorfizmu genu transportera serotoniny 5-HTTLPR (5-HTT linked polymorphism region) zastosowano skład mieszaniny do reakcji PCR, a warunki prze-prowadzania reakcji PCR i rozdziału elektroforetycznego przyjęto jak w metodzie opi-sanej wcześniej przez Heilsa i wsp. [129], z niewielkimi modyfikacjami [79]. Amplifi-kację regionu regulatorowego zawierającego polimorficzne miejsce przeprowadzono przy użyciu polimerazy Taq i specyficznych starterów [129] flankujących region regula-torowy w reakcji łańcuchowej polimerazy. W wyniku amplifikacji genomowego DNA otrzymywano produkt o wielkości 484 lub 528 par zasad (Aneks; ryc. 13).

Analiza statystyczna

Wyniki podano jako proporcje lub średnie arytmetyczne ± SD. Przy użyciu testu Kołmogorova-Smirnova oceniano rozkład zmiennych ciągłych pod kątem jego zgodno-ści z rozkładem normalnym. Znamienność statystyczną różnic pomiędzy średnimi zmiennych o rozkładzie normalnym oceniano przy użyciu testu t-Studenta, a zmiennych o rozkładzie różnym od normalnego – testem Manna Whitneya U. Zmienne kategorycz-ne oceniano za pomocą testu χ². Test ten został użyty również do analizy zgodności rozkładu genotypów z równowagą Hardy-Weinberga. Związek poszczególnych genoty-pów DRD2*A, DRD2*B, SLC6A3 i 5-HTTLPR lub kombinacji genotygenoty-pów DRD2*AxSLC6A3 z paleniem tytoniu oceniano za pomocą wieloczynnikowej analizy

logistycznej, z uwzględnieniem innych czynników ryzyka dla palenia. Jako miarę ryzy-ka związanego z danym genotypem ryzy-kalkulowano ilorazy szans (OR; odds ratios) z 95-procentowymi przedziałami ufności (95% CI - confidence intervals) z uwzględnieniem innych czynników ryzyka (adjusted OR) lub bez (crude OR). W obliczaniu skorygowa-nych ilorazów szans uwzględniano następujące zmienne: płeć, wiek, wykształcenie, obecność psychicznych chorób, uzależnienie od alkoholu oraz odsetek palaczy wśród krewnych pierwszego stopnia.

We wszystkich analizach wartość p<0,05 przyjęto za statystycznie istotną.

Obliczenia statystyczne wykonano za pomocą programu komputerowego STATI-STICA for Windows, wersja 7.1 (StatSoft Inc., USA).

3.2. BADANIA POPULACYJNE:OCENA WPŁYWU CZYNNIKÓW