Badania ilościowe

8.2.1. Odczynniki i substancje wzorcowe Oznaczanie zawartości sumy polifenoli

 kwas galusowy, Sigma-Aldrich

 odczynnik Folin-Ciocalteu, Merck

 węglan sodu (Na2CO3), POCH

 metanol cz.d.a., POCH

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

60 Oznaczanie zawartości flawonoidów

 7-glukozyd apigeniny (ze zbioru KiZ Farmakognozji UMP)

 kwas octowy lodowaty 99,5% (HOAc) cz.d.a., POCH

 kwas mrówkowy 99% (HCO2H) cz., POCH

 kwas borowy (H3BO3) cz.d.a., POCH

 kwas szczawiowy (C2H2O4) cz.d.a., POCH

 metanol cz.d.a., POCH

 woda destylowana

8.2.2. Aparatura

 spektrofotometr UV/VIS Lambda 35, Perkin-Elmer

 wytrząsarka Laboratory Shaker type 358S, Elpan

 waga analityczna LE225D-0CE, Sartorius

 waga apteczna PS 2100/C/2, Radwag

 wyparka próżniowa Rotavapor R-210, firmy Bűchi

8.2.3. Oznaczanie zawartości sumy polifenoli z odczynnikiem Folin-Ciocalteu (FC)

Całkowitą zawartość sumy polifenoli oznaczaono wg Shi i wsp. (2011), na

podstawie zmodyfikowanej metody Singleton i wsp. (1999). Oznaczenie prowadzono

wykorzystując odczynnik Folin-Ciocalteu (FC) oraz 20% roztwór węglanu sodu

(Na2CO3). Na skutek reakcji zachodzącej pomiędzy FC, Na2CO3 oraz obecnymi

w badanych wyciągach związkami o charakterze fenoli, dochodziło do powstawania barwnego, niebieskiego kompleksu, wykazującego maksimum absorbancji przy długości fali λ = 760 nm (Shi i wsp., 2011).

8.2.3.1. Przygotowanie wzorcowego roztworu kwasu galusowego

100 mg wzorcowego kwasu galusowego rozpuszczono w metanolu, w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, otrzymując roztwór w stężeniu 2 mg/ml. Następnie do 7 owiniętych w folię aluminiową kolbek miarowych o pojemności 5 ml przeniesiono

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

61

kolejno 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4 ml roztworu wzorcowego kwasu galusowego i uzupełniono do współmierności metanolem, uzyskując stężenia w zakresie 0,04-0,16 mg/ml kwasu galusowego.

8.2.3.2. Przygotowanie wyciągów do badań

Stężenia wyciągów do badań zostały ustalone doświadczalnie tak, aby wartość mierzonej absorbancji mieściła się w zakresie pomiędzy 0,3-0,8.

Wyciąg metanolowy (Wp)

5 g rozdrobnionego ziela A. amaranthoides ekstrahowano dwukrotnie 150 ml metanolu na wrzącej łaźni wodnej, pod chłodnicą zwrotną, każdorazowo przez 1 godzinę w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Otrzymane wyciągi połączono i przecedzono przez watę, a następnie zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce

próżniowej, uzyskując 0,8607 g suchej masy. 100 mg wyciągu (Wp) rozpuszczono

w niewielkiej objętości metanolu, a następnie przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełniono do współmierności, uzyskując roztwór o stężeniu 4 mg wyciągu/ml.

Odwar (Op)

5 g rozdrobnionego ziela A. amaranthoides zalano 150 ml wody destylowanej i ogrzewano dwukrotnie przez 30 min na wrzącej łaźni wodnej w temperaturze 95º C. Uzyskane odwary połączono i przecedzono przez watę, a następnie zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce próżniowej, uzyskując 1,2343 g suchej masy. 75

mg wyciągu (Op) rozpuszczono w niewielkiej objętości metanolu, a następnie

przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 25 ml i uzupełniono do współmierności, uzyskując roztwór o stężeniu 3 mg wyciągu/ml.

8.2.3.3. Przebieg oznaczenia

Do 10 ml kolbek miarowych owiniętych w folię aluminiową przeniesiono 4 ml wody destylowanej i 0,5 ml roztworu wzorcowego kwasu galusowego lub badanych

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

62

wyciągów w odpowiednim stężeniu. Następnie do każdej kolbki dodawano 0,5 ml

odczynnika Folin-Ciocalteu, a po upływie minuty 2 ml 20% Na2CO3. Wszystkie kolbki

uzupełniono wodą destylowaną do współmierności i energicznie mieszano. Po 30 minutach od dodania węglanu sodu prowadzono pomiar absorbancji dla poszczególnych

prób przy długości fali λ = 760 nm wobec próby ślepej, w której badane wyciągi

zastąpiono 0,5 ml metanolu (7 ml wody + 0,5 ml FC + 0,5 ml metanolu + 2 ml 20%

Na2CO3). Liczba pomiarów dla każdego ze stężeń badanych wyciągów wynosiła 12,

natomiast w przypadku wzorcowego kwasu galusowego dla każdej z prób otrzymano po 6 wyników. Całkowitą zawartość sumy polifenoli obliczono na podstawie krzywej wzorcowej dla kwasu galusowego.

8.2.4. Oznaczanie zawartości flawonoidów (Ph. Eur. VII )

Oznaczanie zawartości flawonoidów w surowcu prowadzono wykorzystując

metodę farmakopealną opisaną w Ph. Eur. VII dla Violae herba cum flore (Ph. Eur. VII,

2010), zmodyfikowaną przez Siatka i Kašparová (2010). W metodzie tej wykorzystuje się charakterystyczną dla flawonoidów reakcję tworzenia barwnych, zielonożółtych kompleksów z kwasem borowym w obecności kwasu szczawiowego, dla których

pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali λ= 405 nm (Rycina 21) (Strzelecka

i wsp., 1982).

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

63 8.2.4.1. Przygotowanie wzorcowego roztworu 7-glukozydu apigeniny

Odważono 5 mg wzorcowego 7-glukozydu apigeniny, przeniesiono do kolbki miarowej o pojemności 5 ml i dodano niewielką objętość metanolu. Po rozpuszczeniu uzupełniono do współmierności, uzyskując w ten sposób roztwór wzorcowy o stężeniu 1 mg/ml. Następnie do 6 kolbek miarowych o pojemności 25 ml przeniesiono kolejno 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml roztworu wzorcowego i dodano mieszaniny o składzie 10 cz. metanolu i 100 cz. lodowatego kwasu octowego tak, by objętość każdej próby wynosiła 11 ml. W kolejnym etapie do każdej z kolbek dodano 10 ml roztworu zawierającego 25 g/l kwasu borowego i 20 g/l kwasu szczawiowego w bezwodnym kwasie mrówkowym. Na końcu wszystkie kolbki uzupełniono bezwodnym kwasem octowym do objętości 25 ml. Badane próby zawierały 7-glukozyd apigeniny w zakresie stężeń 2-20 µg/ml.

8.2.4.2. Przygotowanie wyciągu do badań

0,3 g surowca zalano 40 ml 60 % metanolu i ekstrahowano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika na łaźni wodnej przez 10 min, co jakiś czas mieszając. Otrzymany wyciąg ostudzono i przesączono przez watę do kolbki miarowej na 100 ml, a pozostałość (wraz z watą) przeniesiono do kolby okrągłodennej i poddano ponownej ekstrakcji w takich samych warunkach jak poprzednio. Otrzymany ekstrakt, podobnie jak pierwszy wyciąg, przesączono do tej samej kolbki miarowej. Surowiec pozostały w kolbie przemyto 60 % metanolem i przesączono do połączonych wyciągów. Całość uzupełniono do współmierności i poddano jeszcze jednej filtracji, uzyskując roztwór podstawowy o stężeniu 3 mg/ml.

8.2.4.3. Przebieg oznaczenia

5 ml roztworu podstawowego przeniesiono do kolbki okrągłodennej i odparowano do sucha w wyparce próżniowej. Suchą pozostałość rozpuszczono w 8 ml mieszaniny składającej się w 10 cz. z metanolu i 100 cz. w bezwodnego kwasu octowego, a następnie przeniesiono do kolbki miarowej o pojemności 25 ml. Dodatkowo kolbkę, w której zagęszczano roztwór podstawowy przemyto 3 ml powyższej mieszaniny i przeniesiono do tej samej kolbki miarowej. W dalszej części doświadczenia do badanej próby dodano 10 ml roztworu zawierającego 25 g/l kwasu bornego i 20 g/l kwasu

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

64

szczawiowego w bezwodnym kwasie mrówkowym, po czym uzupełniono kolbkę do współmierności bezwodnym kwasem octowym. Pomiaru absorbancji dla roztworu badanego (12 powtórzeń) i wzorcowego (6 powtórzeń dla każdej próby) prowadzono przy długości fali λ= 405 nm wobec próby odniesienia, którą stanowiła mieszanina otrzymana jak w przypadku próby badanej z tą różnicą, że 10 ml mieszaniny kwasu bornego i szczawiowego w bezwodnym kwasie mrówkowym zastąpiono samym bezwodnym kwasem mrówkowym. Całkowitą zawartość flawonoidów obliczono na podstawie krzywej wzorcowej dla 7-glukozydu apigeniny.