Badania ilościowe

7.3.1. Odczynniki i substancje wzorcowe

Do oznaczania zawartości flawonoidów

− kwercetyna dwuwodna (nr serii 288213490) Fluka

− kwas solny cz.d.a. (roztwór wodny, 250g/l) POCH

− chlorek glinu (20g/l) rozpuszczony w mieszaninie

HOAc - MeOH (1:19) (nr serii BCBD3987V) Sigma-Aldrich

− heksametylenotetramina cz.d.a. (0,5% wodny roztwór) Chempur¹³

− mieszanina: HOAc (1,02 kg/l) - MeOH (1:19)

− aceton cz.d.a. POCH

− octan etylu cz.d.a. POCH

− metanol cz.d.a. POCH

− siarczan sodu bezwodny cz.d.a. POCH

− woda dejonizowana.

Do oznaczania zawartości kwasów fenolowych

− kwas kawowy (nr serii 24050-030) Sigma-Aldrich

− 0,5 N (18g/l) roztwór kwasu solnego POCH

− 1 N (40g/l) roztwór wodorotlenku sodu POCH

− azotyn sodu cz.d.a. (nr serii 0314/05/03) POCH

− molibdenian sodu cz.d.a. (nr serii 0235/11/98) POCH

− metanol cz.d.a. POCH

− woda dejonizowana.

odczynnik Arnov’a: rozpuszczono 10,0 g molibdenianu sodu i 10,0 g azotynu sodu w kolbie miarowej o pojemności 100 ml i uzupełniono wodą dejonizowaną.

Do oznaczania zawartości sumy polifenoli

− kwas galusowy (nr serii 71181-079) Sigma-Aldrich

− odczynnik Folin-Ciocalteu (FC) (nr serii HC807325) Merck

− węglan sodu (7% wodny roztwór) (nr serii 0101/09/08) POCH

− metanol cz.d.a. POCH

− woda dejonizowana.

METODYKA BADAŃ Badania ilościowe

Do oznaczania zawartości kwasu L(+)-askorbinowego

− kwas L(+)-askorbinowy cz.d.a. (nr serii 529150113) POCH

− 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) (0,1% acetonowy

roztwór) przygotowany ex tempore (nr serii BCBB2081) Fluka

− wodorotlenek sodu (0,2 M) POCH

− kwas cytrynowy jednowodny cz.d.a. (0,5% wodny roztwór)

(nr serii 1172/02/10) POCH

− aceton cz.d.a. (50% wodny roztwór) POCH

− woda dejonizowana.

Do oznaczania zawartości pierwiastków

− kwas azotowy 65 % Ultranal POCH

− woda dejonizowana.

7.3.2. Aparatura

− mineralizator mikrofalowy CEM Corporation USA Mars 5 (rozdz. 8.3.5.)

− spektrofotometr UV/VIS Lambda 35, Perkin-Elmer

− waga analityczna LE225D-0CE, Sartorius

− waga apteczna PS 2100/C/2, Radwag

− wyparka próżniowa Rotavapor R-210, firmy Bűchi

− wytrząsarka type 358S, Elpan.

7.3.3. Przygotowanie wyciągów

7.3.3.1. Wyciągi podstawowe

Podstawowy wyciąg metanolowo – wodny (MWP)

1,0 g wysuszonego ziela żółtlicy drobnokwiatowej poddano wyczerpującej ekstrakcji trzykrotnie 200 ml metanolu i czterokrotnie 150 ml mieszaniny metanol-woda dejonizowana (1:1) na wrzącej łaźni wodnej, pod chłodnicą zwrotną, w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, każdorazowo przez 1 godzinę. Otrzymane wyciągi połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono do objętości około 20 ml na wyparce próżniowej w temperaturze poniżej 45º C. Zagęszczony wyciąg przeniesiono do kolbki miarowej o pojemności 50 ml i uzupełniono wodą dejonizowaną. Otrzymano podstawowy wyciąg

METODYKA BADAŃ Badania ilościowe

metanolowo-wodny o stężeniu 20 mg/ml. Wyciąg przygotowano w 3 powtórzeniach (naważki surowca: m₁=1,01 g; m₂=1,02 g; m₃=1,02 g).

Nalewka podstawowa (NP)

5,0 g wysuszonego ziela żółtlicy drobnokwiatowej zalano w kolbie stożkowej 300 ml 70% etanolu. Następnie wytrząsano na wytrząsarce przez 1 godzinę i pozostawiono w ciemnym miejscu na okres 2 dni. Wytrawianie powtórzono jeszcze raz. Uzyskane nalewki połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono na wyparce próżniowej, do objętości około 30 ml, a następnie przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupełniono wodą dejonizowaną. Uzyskano nalewkę podstawową o stężeniu 100 mg/ml. Nalewkę podstawową przygotowano w 3 powtórzeniach (naważki surowca: m1=5,00 g; m2=5,03 g; m3=5,02 g).

Odwar podstawowy (OP)

5,0 g wysuszonego ziela żółtlicy drobnokwiatowej zalano w kolbie stożkowej 300 ml wody dejonizowanej o temperaturze pokojowej, a następnie gotowano przez 20 minut w łaźni wodnej w temperaturze 95° C. Wytrawianie powtórzono jeszcze raz, a uzyskane odwary połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono do objętości około 30 ml. Zagęszczony odwar przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupełniono wodą dejonizowaną. Uzyskano odwar podstawowy o stężeniu 100 mg/ml. Odwar podstawowy przygotowano w 3 powtórzeniach (naważki surowca: m1=5,01 g; m2=5,03 g; m3=5,00 g).

7.3.3.2. Wyciągi do oznaczeń ilościowych

Do oznaczania zawartości flawonoidów

Wyciąg z ziela żółtlicy drobnokwiatowej (wg FP IX)

Do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml odważono 0,6 g wysuszonego, sproszkowanego ziela żółtlicy drobnokwiatowej, dodano 20 ml acetonu, 2 ml kwasu solnego i l ml roztworu wodnego heksametylenotetraminy (metenaminy). Mieszaninę ogrzewano na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną przez 30 minut od chwili zawrzenia. Otrzymany hydrolizat przecedzono przez watę do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Surowiec wraz z watą umieszczono ponownie w kolbie okrągłodennej, dodano 20 ml acetonu i ponownie utrzymywano w stanie wrzenia przez 10 minut. Otrzymany wyciąg przecedzono przez watę do kolby miarowej. Wytrawianie powtórzono jeszcze raz, a uzyskany wyciąg przesączono do kolby miarowej i uzupełniono acetonem do 100 ml.

METODYKA BADAŃ Badania ilościowe

20 ml zhydrolizowanego wyciągu przeniesiono do rozdzielacza, dodano 20 ml wody dejonizowanej i wytrząsano z 15 ml octanu etylu, a następnie trzema porcjami octanu etylu po 10 ml. Połączone wyciągi octanu etylu w rozdzielaczu przemyto 2 razy po 50 ml wody dejonizowanej, a następnie przesączono przez 10 g bezwodnego siarczanu sodu do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupełniono octanem etylu, uzyskując stężenie 2,4 mg surowca w 1 ml wyciągu. Wyciąg z ziela żółtlicy drobnokwiatowej przygotowano w 3 powtórzeniach (naważki surowca: m1=600,00 mg; m2=600,01 mg; m3=600,02 mg). Nalewka i odwar

12,5 ml nalewki podstawowej (NP) oraz 10 ml odwaru podstawowego (OP) (rozdz. 7.3.3.1.) zagęszczono oddzielnie do sucha w kolbach okrągłodennych o pojemności 50 ml. Następnie postępowano jak w przypadku ziela żółtlicy drobnokwiatowej. Z nalewki podstawowej uzyskano wyciąg o stężeniu 5 mg/ml, a z odwaru podstawowego 4 mg/ml.

Do oznaczania zawartości kwasów fenolowych

Wyciągi do badań otrzymano w wyniku rozcieńczenia wyciągów podstawowych (rozdz. 7.3.3.1.).

Do kolb miarowych o pojemności 25 ml pobrano:

− 0,8 ml podstawowego wyciągu metanolowo-wodnego (MWP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 0,64 mg surowca w 1 ml wyciągu,

− 0,2 ml nalewki podstawowej (NP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 0,8 mg surowca w 1 ml nalewki,

− 0,15 ml odwaru podstawowego (OP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 0,6 mg surowca w 1 ml odwaru

i uzupełniono wodą dejonizowaną.

Do oznaczania zawartości sumy polifenoli

Wyciągi do badań otrzymano w wyniku rozcieńczenia wyciągów podstawowych (rozdz. 7.3.3.1.).

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml pobrano:

− 5 ml podstawowego wyciągu metanolowo-wodnego (MWP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 1 mg surowca w 1 ml wyciągu,

− 1,4 ml nalewki podstawowej (NP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 1,4 mg surowca w 1 ml nalewki,

METODYKA BADAŃ Badania aktywności biologicznej

− 1,1 ml odwaru podstawowego (OP), uzyskując rozcieńczenie o stężeniu 1,1 mg surowca w 1 ml odwaru

i uzupełniono wodą dejonizowaną.

Do oznaczania zawartości kwasu L(+)-askorbinowego

50,0 g świeżego, rozdrobnionego ziela żółtlicy drobnokwiatowej umieszczono w kolbie płaskodennej o pojemności 100 ml i ekstrahowano 50 ml wodnego roztworu 0,5% kwasu cytrynowego w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 30 min. Otrzymany wyciąg przesączono przez sączek bibułowy do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Wytrawianie powtórzono jeszcze dwukrotnie, a uzyskane wyciągi przesączono do kolby miarowej i uzupełniono roztworem 0,5% kwasu cytrynowego do 100 ml, uzyskując stężenie 500 mg/ml. Wyciąg przygotowano w 3 powtórzeniach (naważki surowca: m₁=50,02 g; m₂=50,01 g; m₃=50,03 g).

Do oznaczania zawartości pierwiastków metodą ICP-OES

Dwie naważki (m₁=0,3120 g i m₂=0,2856 g) wysuszonego ziela żółtlicy drobnokwiatowej mineralizowano w 10 ml kwasu azotowego Ultranal i uzupełniono wodą dejonizowaną do objętości 15 ml.