Badania ilościowe

8.4.1. Odczynniki i substancje wzorcowe

8.4.1.1. Do oznaczania zawartości sumy polifenoli

o kwas galusowy (seria 71181-079) Sigma-Aldrich o odczynnik Folin-Ciocalteu (FC) (seria HC807325) Merck

o węglan sodu (7% roztwór wodny) (seria 0101/09/08) POCH

o metanol cz.d.a. POCH

o woda destylowana

8.4.1.2. Do oznaczania zawartości flawonoidów

o kwercetyna dwuwodna (seria 288213490) Fluka o kwas solny cz.d.a. (roztwór wodny, 250 g/L) POCH o chlorek glinu (seria BCBD3987V) rozpuszczony w

METODYKA BADAŃ ^{Badania ilościowe}

o heksametylenotetramina cz.d.a. (0,5% roztwór wodny) Chempur o mieszanina HOAc (1,02 kg/L) – MeOH (1:19)

o aceton cz.d.a. POCH

o octan etylu cz.d.a. POCH

o metanol cz.d.a. POCH

o bezwodny siarczan sodu cz.d.a. POCH o woda destylowana

8.4.1.3. Do oznaczania zawartości kwasów fenolowych

o kwas kawowy (seria 24050-030) Sigma-Aldrich o 0,5 N roztwór kwasu solnego (18 g/L) POCH

o 1 N roztwór wodorotlenku sodu (40 g/L) POCH o azotyn sodu cz.d.a. (seria 0314/05/03) POCH o molibdenian sodu cz.d.a. (seria 0235/11/98) POCH

o metanol cz.d.a. POCH

o woda destylowana

o odczynnik Arnov’a: 10,0 g molibdenianu sodu i 10,0 g azotynu sodu rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100 mL, a następnie uzupełniono wodą destylowaną do współmierności

8.4.2. Aparatura

o spektrofotometr UV/VIS Lambda 35 Perkin-Elmer o wyparka próŜniowa Rotavapor R-210 Büchi

o wytrząsarka 358S Elpan

o waga apteczna PS 2100/C/2 Radwag

8.4.3. Przygotowanie wyciągów

8.4.3.1. Wyciągi podstawowe

8.4.3.1.1. Wyciąg metanolowo-wodny podstawowy (MWP)

1,0 g wysuszonego ziela dymnicy lekarskiej poddano wyczerpującej ekstrakcji trzykrotnie 250 mL metanolu oraz czterokrotnie 200 mL mieszaniny metanol-woda destylowana (1:1). Ekstrakcję kaŜdorazowo prowadzono przez 1 godzinę na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskane wyciągi połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono na wyparce próŜniowej do objętości około 25 mL, po czym przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełniono wodą destylowaną. W ten sposób uzyskano wyciąg podstawowy metanolowo-wodny o stęŜeniu 20 mg/mL. Wyciąg przygotowano w 3 powtórzeniach.

8.4.3.1.2. Nalewka podstawowa (NP)

5,0 g wysuszonego ziela dymnicy lekarskiej zalano w kolbie stoŜkowej 300 mL 70% etanolu, a następnie wytrząsano na wytrząsarce przez 1 godzinę. Kolbę odstawiono w ciemne miejsce na okres 2 dni. Wytrawianie przeprowadzono w powyŜszy sposób dwukrotnie. Uzyskane nalewki połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono na wyparce próŜniowej do objętości około 25 mL, po czym przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełniono wodą destylowaną. W ten sposób uzyskano nalewkę podstawową o stęŜeniu 100 mg/mL. Nalewkę podstawową przygotowano w 3 powtórzeniach.

8.4.3.1.3. Odwar podstawowy (OP)

5,0 g wysuszonego ziela dymnicy lekarskiej zalano w kolbie stoŜkowej 300 mL wody destylowanej o temperaturze pokojowej, a następnie ogrzewano przez 20 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95°C. Wytrawianie przeprowadzono w powyŜszy sposób dwukrotnie. Uzyskane odwary połączono, przecedzono przez watę i zagęszczono na wyparce próŜniowej do objętości około 25 mL, po czym przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełniono wodą destylowaną. W ten sposób

METODYKA BADAŃ ^{Badania ilościowe}

uzyskano odwar podstawowy o stęŜeniu 100 mg/mL. Odwar podstawowy przygotowano w 3 powtórzeniach.

8.4.3.2. Wyciągi do oznaczeń ilościowych

8.4.3.2.1. Do oznaczania zawartości sumy polifenoli

Wyciągi do badań uzyskano poprzez rozcieńczenie wyciągów podstawowych.

8.4.3.2.1.1.Wyciąg metanolowo-wodny

Do kolby miarowej o pojemności 10 mL pobrano 1,4 mL podstawowego wyciągu metanolowo-wodnego (MWP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 2,8 mg/mL.

8.4.3.2.1.2.Nalewka

Do kolby miarowej o pojemności 100 mL pobrano 4 mL nalewki podstawowej (NP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 4 mg/mL.

8.4.3.2.1.3.Odwar

Do kolby miarowej o pojemności 100 mL pobrano 3 mL odwaru podstawowego (OP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 3 mg/mL.

8.4.3.2.2. Do oznaczania zawartości flawonoidów

8.4.3.2.2.1.Wyciąg z ziela dymnicy (wg FP IX)

Do kolby okrągłodennej o pojemności 50 mL odwaŜono 0,6 g wysuszonego, sproszkowanego ziela dymnicy lekarskiej. Dodano następnie 20 mL acetonu, 2 mL kwasu solnego i 1 mL wodnego roztworu heksametylenotetraminy (metenaminy). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną przez 30

minut od chwili zawrzenia, a następnie przecedzono przez zwitek waty do kolby miarowej o pojemności 100 mL. Surowiec wraz z watą umieszczono ponownie w kolbie okrągłodennej, dodano 20 mL acetonu i utrzymywano w stanie wrzenia przez 10 minut. Uzyskany wyciąg przecedzono przez watę do kolby miarowej. Ekstrakcję powtórzono jeszcze raz, a uzyskany ostatecznie wyciąg przesączono do kolby miarowej przez sączek bibułowy i uzupełniono acetonem do 100 mL. 20 mL tego roztworu przeniesiono do rozdzielacza, dodano 20 mL wody destylowanej i wytrząsano z 15 mL octanu etylu. Następnie wytrząsanie powtórzono jeszcze trzema porcjami octanu etylu po 10 mL kaŜda. Połączone wyciągi octanu etylu przemyto w rozdzielaczu dwiema porcjami wody destylowanej po 50 mL, a następnie przesączono przez 10 g bezwodnego siarczanu sodu do kolby miarowej o pojemności 50 mL i uzupełniono octanem etylu do współmierności. Uzyskano stęŜenie 2,4 mg ziela w 1 mL wyciągu. Wyciąg z ziela dymnicy przygotowano w powyŜszy sposób w 3 powtórzeniach.

8.4.3.2.2.2.Nalewka

Do kolby miarowej o pojemności 50 mL pobrano 16,5 mL nalewki podstawowej (NP) i zagęszczono do sucha. Następnie postępowano jak w przypadku wyciągu z ziela dymnicy wg FP IX. Uzyskano w ten sposób stęŜenie 6,6 mg ziela w 1 mL wyciągu.

8.4.3.2.2.3.Odwar

Do kolby miarowej o pojemności 50 mL pobrano 25,0 mL odwaru podstawowego (OP) i zagęszczono do sucha. Następnie postępowano jak w przypadku wyciągu z ziela dymnicy (wg FP IX). Uzyskano w ten sposób stęŜenie 10,0 mg ziela w 1 mL wyciągu.

8.4.3.2.3. Do oznaczania zawartości kwasów fenolowych

METODYKA BADAŃ ^{Badania aktywności biologicznej}

8.4.3.2.3.1.Wyciąg metanolowo-wodny

Do kolby miarowej o pojemności 25 mL pobrano 2,75 mL podstawowego wyciągu metanolowo-wodnego (MWP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 2,2 mg/mL.

8.4.3.2.3.2.Nalewka

Do kolby miarowej o pojemności 25 mL pobrano 0,9 mL nalewki podstawowej (NP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 3,6 mg/mL.

8.4.3.2.3.3.Odwar

Do kolby miarowej o pojemności 25 mL pobrano 0,6 mL odwaru podstawowego (OP), a następnie uzupełniono wodą destylowaną, uzyskując stęŜenie 2,4 mg/mL.