V. DYSKUSJA
1. Badanie potencjalnej zdolności plemników do zapłod-
kario-typem somatycznym oraz podstawowymi
parametrami nasienia
Stosunkowo liczne dane literaturowe dostarczyły in-formacji o częstości występowania aberracji chromosomo-wych w limfocytach krwi obwodowej u mężczyzn z nie-powodzeniami rozrodu (rozdział I.2.). Większość tych badań dotyczyła pacjentów z nieprawidłowymi parametra-mi ejakulatu, jedynie nieliczne pacjentów z normozoosper-mią [112, 114, 115, 326]. Podawane przez różnych autorów wyniki dotyczące częstości występowania określonych rodzajów aberracji chromosomowych wykazują różnice, co prawdopodobnie wynika z różnej liczebności badanych grup i faktu, że część danych dotyczyła nieselekcjonowa-nych grup pacjentów. Pomimo pewnieselekcjonowa-nych rozbieżności, badania te dostarczyły ważnych informacji wskazujących na związki pomiędzy genezą męskiej niepłodności a aber-racjami chromosomowymi [4, 111]. W większości tych prac analiza ograniczała się tylko do badania kariotypów somatycznych i analizy seminologicznej. Z kolei w pra-cach, w których oceniano własności plemników za pomocą jednego z testów funkcjonalnych, wyniki korelowano przede wszystkim z cechami ejakulatu a nie z wynikami kariotypowania [327, 328]. W przedstawionych niniejszych badaniach (Rozdział IV.1.) sprawdzano, czy można zaob-serwować ewentualne korelacje pomiędzy kariotypem somatycznym a „potencjalną zdolnością plemników do
zapłodnienia” ocenianą in vitro testem funkcjonalnym SPA, w powiązaniu z podstawowymi parametrami nasienia. W związku z tym, badaniami objęto zarówno pacjentów z normozoospermią (I) (tabele 5. i 6.), jak i z zaburzeniami spermatogenezy (O;A;T) (tabele 8. i 10.). Trzeba zazna-czyć, że w przypadku pierwszej grupy (pary małżeńskie z tzw. niepłodnością idiopatyczną) można było jedynie domniemywać męską niepłodność, natomiast mężczyźni ci nie spełniali w sposób jednoznaczny kryterium „męskiej niepłodności idiopatycznej”, bowiem ich partnerki nie po- dejmowały wcześniej prób zajścia w ciążę (a tym samym nie miały dzieci) z innymi partnerami.
Choć stwierdzenie, że test SPA ocenia „potencjalną zdolność” plemników do zapłodnienia in vitro jest okre-śleniem umownym wydaje się, że dla założonych celów badawczych test ten spełniał swoje zadanie. Prawidłowo wykonywany test SPA pozwala ocenić zdolność plemni-ków do kapacytacji, reakcji akrosomowej, fuzji z oolemmą, penetracji ooplazmy i dekondensacji własnego DNA [329]. Ograniczeniem tego testu jest fakt, iż wykonywany jest na oocytach (chomiczych) pozbawionych enzymatycznie osłonki przejrzystej (celem usunięcia bariery międzyga-tunkowej), co stanowi znaczne „ułatwienie” dla wyko-nywania funkcji przez plemnik. Najistotniejszą zaletą testu SPA (przynajmniej z punktu widzenia badań gene-tycznych) jest możliwość obserwacji kształtowania się męskich przedjądrzy. Natomiast z punktu widzenia prak-tyki klinicznej, wartość prognostyczna testu SPA w sto- sunku do faktycznych sukcesów reprodukcyjnych (ciąż spontanicznych lub wyniku zapłodnień IVF i/lub ICSI) jest dyskusyjna: w licznych publikacjach dotyczących takiego porównania autorzy uzyskiwali zarówno pozy-tywną, jak i słabą korelację [328, 330, 331, 332]. Na pewno jedną z przyczyn tych rozbieżności był brak stan-daryzacji testu. W konsekwencji, część nieprawidłowych wyników testów SPA była rezultatem zbyt krótkiej ka-pacytacji i/lub zbyt małej (poniżej 0,5 mln/ml buforu) koncentracji plemników [190]. Przeważa opinia, że w prak-tyce klinicznej test SPA może być użyteczny przede wszystkim w rozróżnianiu pomiędzy parami z wysokim prawdopodobieństwem uzyskania ciąży w wyniku za-płodnienia IVF a bardzo niskim prawdopodobieństwem, kiedy to od razu wskazana byłaby metoda ICSI [333]. Wynika to z obserwacji, że przy prawidłowo wykony-wanym teście SPA odsetek fałszywie negatywnych wy-ników jest bardzo mały (< 0,03% wg [334]). Spośród pacjentów, dla których w niniejszych badaniach wyko-nywano test SPA (tabele 5. i 8.), udało się uzyskać in-formację o wynikach zapłodnień in vitro jedynie od niewielkiej grupy (34 pary/164 pary, dla których wyko-nano test SPA). Zestawienie tych danych (tabela 12.) potwierdziło sugestie innych autorów, że odsetek fał-szywie negatywnych wyników (2,9%) był w tym teście istotnie mniejszy w porównaniu do wyników fałszywie pozytywnych (około 30%). Dotyczyło to zarówno pa-cjentów z normozoospermią (I), jak i z obniżonymi ce-chami ejakulatu (O;A;T).
Tab. 33. Zestawienie wyników testu penetracji plemników (SPA) i analizy chromosomów w dwóch grupach pacjentów: z
nor-mozoospermią (I) oraz z (O;A;T)
Tab. 33. Comparison of the results of (SPA) assay and of the karyotyping in two groups of patients with normozoospermia (I) and with (O;A;T)
Wyniki SPA Typ *
niepłodności Średnia SPA (%) Pozytywny > 30% Negatywny ≤ 20%
Kariotyp I O;A;T I O;A;T I O;A;T I O;A;T
46,XY 71% 74% 45 ± 23 34 ± 21 70% 49% 17% 31%
heteromorfizmy 9% 24% 37 ± 15 28 ± 18 50% 37% 17% 26%
aberracje struktury 6% 2.5% 29 ± 14 26 ± 6 50% 50% 50% 50%
chromosomy markerowe 12% - 53 ± 20 - 88% - 0% -
aberracje liczby chromosomów 3% - 34 ± 6 - 50% - 0% -
*typ niepłodności (I): mężczyźni z par małżeńskich z niepłodnością idiopatyczną (tabela 6.); (O;A;T): mężczyźni z nieprawidłowymi parame-trami ejakulatu (tabela 10.)
** dane dotyczą tylko pacjentów, dla których wykonano zarówno test SPA, jak i badanie kariotypu Z zestawienia danych dotyczących testu SPA i
kario-typów somatycznych (tabela 33.) wynika, że w obu gru-pach pacjentów (I oraz O;A;T) odsetek kariotypów 46,XY był podobny (odpowiednio 71% i 74%). Jedno-cześnie niemal o połowę więcej pacjentów z O;A;T wykazywało upośledzoną funkcję penetracyjną plemni-ków (jednoznacznie negatywny wynik testu SPA) w stosunku do grupy I (odpowiednio 31% i 17%). Mimo iż podgrupy pacjentów z określoną wadą plemników były różnej liczebności i/lub mało liczne (tabele 8., 9. i 10.) można powiedzieć, że u pacjentów O;A;T z kariotypem 46,XY (tzn. bez jakiejkolwiek anomali kariotypu) nie zauważono bezpośredniego związku pomiędzy wyni-kiem testu SPA a określoną wadą plemników.
We wcześniejszych doniesieniach literaturowych u pa- cjentów z O;A;T (bez badania kariotypów) często opisy-wano korelację pomiędzy potencjalną zdolnością do pro-kreacji a koncentracją [173, 335], ruchliwością [173, 336] lub normalną/nieprawidłową morfologią plemników [337]. Bardziej szczegółowe analizy wskazywały na korelacje pomiędzy dobrą morfologią plemników a zdolnością do wiązania się z osłonką przejrzystą oocytów oraz pomiędzy ruchliwością plemników a zdolnością penetracji do oocytu [338].
Z licznych prac wynikało, że u pacjentów z O;A;T spośród podstawowych parametrów ejakulatu morfolo-gia zdaje się być najlepszym indykatorem funkcji plem-nika [310, 327, 339, 340]. Jednak późniejsze badania raczej tego nie potwierdziły [341, 342]. Biorąc pod uwa-gę zarówno dane literaturowe, jak i uzyskane wyniki własne uwzględniające badanie kariotypów (tabele 8., 9. i 10.) można stwierdzić, że w przypadku niepłodnych mężczyzn ani kariotyp 46,XY (tzn. bez jakichkolwiek anomalii lub/i heteromorfizmów) ani określona wada nasienia nie odzwierciedlają jednoznacznie funkcjonal-nych kompetencji plemnika [343].
Na podstawie informacji z meta-analizy [110] należało-by oczekiwać, że w grupie pacjentów O;A;T odsetek pa-cjentów z kariotypem 46,XY będzie niższy w porównaniu
z grupą I (tabela 33.). Zestawiając te wyniki trzeba jednak uwzględnić istotnie mniejszą liczebność analizowanych przypadków w porównaniu z meta-analizą. Poza tym, dane literaturowe są niejednorodne w tym sensie, że większość autorów jako kariotypy 46,XY opisuje również warianty (heteromorfizmy) oraz niskoprocentowy (< 10%) moza-icyzm dotyczący liczby chromosomów lub chromosomów markerowych. Wynika to między innymi z faktu, że wy-krycie niskoprocentowego mozaicyzmu wymaga analizo-wania 50 zamiast rutynowo analizowanych 20 płytek meta-fazowych [344]. Ponadto, szczególnie w przypadku chromosomu markerowego, wymaga to pewnego wyczule-nia osoby analizującej preparaty. Być może właśnie z tych względów odsetek pacjentów (12%), u których wykrywano chromosomy markerowe był dużo wyższy, niżby należało oczekiwać na podstawie danych literaturowych (patrz roz-dział I.6.4.) [326]. Jednocześnie, z danych literaturowych wiadomo, że wpływ chromosomów markerowych na nie-płodność nie jest jednoznacznie określony (rozdział I.6.4). Tym trudniej doszukiwać się związku z niepowodzeniami rozrodu u nosicieli chromosomów markerowych występu-jących w niewielkim tylko odsetku komórek somatycznych (tabela 5.). Na podstawie uzyskanych wyników można jedynie stwierdzić, że obecność chromosomów
markero-wych w żadnym przypadku nie upośledzała zdolności plemników do penetracji oocytów in vitro (tabele 5. i 6.). Jednocześnie zwraca uwagę niełatwy do wyjaśnienia fakt, iż tak często (12%) przypadki z niskoprocentowym moza-icyzmem chromosomów markerowych wykrywano tylko wśród badanych pacjentów z normozoospermią (I) (3% u ich partnerek – tabela 5.). Trudno jednak, jedynie na tej podstawie, domniemywać istnienia związków przyczyno-wych z niepłodnością u pacjentów z normozoospermią (I), szczególnie w kontekście obserwacji o nieobniżonej funkcji penetracyjnej plemników (tabele 5. i 6.). W większości przypadków wykrywanych mozaicyzmów w komórkach somatycznych brak jest badań i/lub równoległej informacji o ewentualnej obecności chromosomu markerowego w tkance gametogenicznej [344]. Dotychczas opisano
segre-gację mejotyczną chromosomu markerowego jedynie u dwóch płodnych mężczyzn nosicieli chromosomów mar-kerowych bi-satelitarnych nieznanego pochodzenia [184] oraz w trzech przypadkach chromosomów markerowych der(15) [274, 278, 287]. W tych pięciu przypadkach chro-mosom markerowy wykrywano w 100% limfocytów krwi obwodowej. U trzech spośród pięciu nosicieli stwierdzono segregację mejotyczną chromosomu markerowego równą lub zbliżoną do 1:1, zatem zgodną z oczekiwaniami. U jed- nego z nosicieli chromosomu markerowego der(15), które-go partnerka miała trzy wczesne poronienia wykryto chro-mosom markerowy tylko w 6,3% plemników [287]. Rów-nież u kolejnego nosiciela chromosom markerowy inv dup(15) wykryto tylko w 26% plemników [278]. Zdaniem autorów może to wskazywać na ogólny tkankowo-specy- ficzny mozaicyzm lub być skutkiem selekcji chromosomu markerowego tylko podczas spermatogenezy [287]. Moza-icyzm i niestabilność chromosomów markerowych może wynikać z mniej wydajnej replikacji w stosunku do prawi-dłowych chromosomów i/lub ze spowolnionego cyklu komórkowego. Najlepiej udokumentowanym zjawiskiem jest mozaicyzm będący konsekwencją przypadkowej utraty chromosomu markerowego w kolejnych podziałach mito-tycznych zachodzących w trakcie życia osobniczego [345]. U pacjentów Nr 39 i Nr 15 (tabela 5.) analizowano se-gregację mejotyczną chromosomów markerowych wykry-tych, w obydwóch przypadkach, w 4% limfocytów krwi obwodowej. U pacjenta Nr 39 nie udało się ustalić pocho-dzenie chromosomu markerowego co uniemożliwiło analizę chromosomów plemnikowych metodą FISH. Zatem badano chromosomy plemnikowe barwione metodą GTG, uzyskane z męskich przedjądrzy w wyniku ksenogenicznej penetracji do oocytów chomiczych (rycina 18.). Ograniczeniem tego podejścia metodycznego było tylko sto zanalizowanych kariotypów plemnikowych, natomiast zaletą było uwidocz-nienie innych, poza chromosomem markerowym, aberracji chromosomowych (Nr 39, tabela 15.). Stwierdzona w 7% plemników obecność chromosomu markerowego wskazuje, że w diploidalnej tkance gametogenicznej chromosom mar-kerowy występował w minimum 14% komórek. W porów-naniu z limfocytami oznacza to ponad 3-krotną kumulację w tkance gametogenicznej, co potwierdza sugestie, że wystę-powaniu chromosomów markerowych często współtowa-rzyszy tkankowo-specyficznym mozaicyzm [345]. W przy-padku pacjenta Nr 15 (tabele 5. i 15.), którego kariotyp opisano jako
46,XY[96]/47,XY, +mar[4].fishder(20)(wcp20+,D20Z1+) bezpośrednią przyczyną badania kariotypu były wczesne poronienia u partnerki (kariotypów płodów nie badano) (opis przypadku w rozdziale IV.2.2.). Chromosom marke-rowy der(20) został „odziedziczony” po matce pacjenta, u której występował w 3% limfocytów krwi obwodowej. U pacjenta stwierdzono 8% plemników z wykrytym (meto-dą FISH) chromosomem markerowym der(20) co wskazuje, że proporcja komórek gametogenicznych z chromosomem markerowym wynosiła minimum 16%. W porównaniu z limfocytami oznaczało to 4-krotną kumulację w tkance gametogenicznej. Jednocześnie w plemnikach pacjenta
stwierdzono podwyższoną częstość plemników 24,XY, co jest częstym zjawiskiem u mężczyzn ze wszystkimi typami niepłodności (patrz rozdział I.5., [158, 199]). W literaturze dotychczas opisano 14 przypadków nosicielstwa chromo-somu markerowego der(20), ale tylko jeden pacjent był w wieku reprodukcyjnym [283, 315]. Stwierdzono u niego azoospermię, a chromosom markerowy wykryto w 80% limfocytów [283].
Nie można wykluczyć, że w przypadku badanego pacjenta Nr 15 (tabele 5. i 15.) z normozoospermią wczesne poronienia u partnerki były jedynie koincyden-talne wobec obecności chromosomu markerowego w 8% plemników. Biologiczna rola chromosomów markero-wych w poronieniach jest niejasna, ale przyjmuje się, że ryzyko poronień u nosicieli jest bardzo niskie [346, 347]. Jednocześnie wiadomo, że dla partnerów kobiet z kilko-ma poronieniami charakterystyczna jest podwyższona częstość disomii chromosomów w plemnikach [348, 349]. Znane są również przypadki par o podwyższonym ryzyku poronień współtowarzyszącym mozaicyzmowi w gonadach [350]. Ocenia się, że wśród niepłodnych męż-czyzn tzw. przypadków „mozaicyzmu germinalnego” może być 1%–17% [351, 352]. W rozdziale IV.2.2. opisano doświadczenia, które podjęto celem wykazania, że plemniki pacjenta Nr 15 ze zidentyfikowanym chro-mosomem markerowym der(20) posiadały zdolność penetracji oocytów (w teście SPA) oraz rozwoju chro-matyny przedjądrza męskiego do chromosomów w sta-dium metafazy (rozdział IV.2.2). Uzyskanie tylko osiemdziesięciu płytek metafazowych była przypusz-czalnie przyczyną, z powodu której, ku pewnemu roz-czarowaniu, chromosomu markerowego der(20) … nie znaleziono (rycina 10.). Jednak potencjalne ryzyko nie-powodzeń rozrodu w opisanych przypadkach mozaicy-zmu komórkowego, choć prawdopodobnie bardzo małe i niemożliwe do precyzyjnego określenia, występuje i nie-zmiennie stanowi istotny problem dla poradnictwa gene-tycznego.
W wynikach dotyczących niepłodnych pacjentów z normozoospermią (I), z których aż 69% miało prawidło-we wyniki testu SPA i tylko 17% negatywne (tabele 5. i 6.), zwraca jednocześnie uwagę obserwacja, że wśród ich parte-rek przeciwciała w śluzie szyjkowym wykrywano znacznie częściej niż w grupie O;A;T (odpowiednio 15% i 1%) (tabela 8.). Obserwacja ta uzupełnia wcześniejsze dane literaturowe, których analiza prowadziła do wniosku, że w przypadkach niepłodności idiopatycznej relatywnie bardzo często o braku koncepcji decydować mógł nie domniemy-wany „czynnik” męski, ale współwystępowanie obniżonej (w niewielkim stopniu?) płodności (ang. subfertility) u oby-dwóch partnerów [353, 354, 355, 356]. W konsekwencji można przypuszczać, że w tych przypadkach naturalna koncepcja mogłaby mieć miejsce z partnerem biologicznym o bardzo dobrej płodności.
W grupie pacjentów z O;A;T (tabela 8.) odsetek wykry-tych nosicieli translokacji (1,5%) był niższy niż w grupie z normozoospermią (6%) (tabela 5.). Ponadto dwóch nosicie-li translokacji wykryto w grupie pacjentów z azoospermią
(10%) (tabela 8.). Łącznie, spośród wykrytych siedmiu translokacji (tabele 5. i 8.) cztery należały do translokacji wzajemnych (TCW) a trzy były translokacjami robertso-nowskimi (TR) t(13;14), które są najczęściej spotykaną translokacją wśród pacjentów z niepowodzeniami rozrodu [357]. Nie stwierdzono jednoznacznej asocjacji między nosicielstwem translokacji i/lub obniżoną wartością testu SPA i cechami nasienia (tabela 33.). Wyniki te potwierdza-ją dane literaturowe wskazupotwierdza-jące, że niezależnie od proble-mu poronień niezrównoważonych genetycznie płodów, związek nosicielstwa translokacji z niepłodnością (w zna-czeniu braku koncepcji) jest trudny do ustalenia (patrz rozdział I.6.1.). Dobrze ilustruje to przykład trzech pacjen-tów, nosicieli translokacji t(13;14)(q10;q10) (Nr 33 w tabe- li 5., Nr 56 oraz Nr 93 w tabeli 8.). Ta sama translokacja współwystępowała w przypadkach z normozoospermią i pra- widłową wartością testu SPA (Nr 33), z asthenoteratozo-ospemią i obniżoną wartością testu SPA (Nr 56) oraz z azoo- spermią (Nr 93).
W grupie pacjentów z O,A,T odsetek wszystkich wy-krytych wariantów (heteromorfizmów) chromosomów był blisko trzykrotnie wyższy w porównaniu z niepłodną grupą z normozoospermią (I) (tabela 33.). W obydwóch grupach pacjentów wykryto zarówno warianty będące inwersjami pericentrycznymi, jak i wydłużonymi blokami heterochro-matyny oraz warianty długości ramion krótkich chromoso-mów akrocentrycznych (tabele 7 i 11). Większość klinicy-stów nie wiąże z ich występowaniem żadnych efektów genotypowych, ale jest szereg badań wskazujących na korelację z niepowodzeniami rozrodu [358, 359, 360, 361, 362, 363]. Są dane wskazujące, że konjugacja dwóch ho-mologicznych chromosomów, takich jak 1 czy 9, z których jeden ma heteromorfizm w heterochromatynowym regio-nie, może być zaburzona [364, 365]. Wśród dużej grupy pacjentów poddawanych zabiegowi IVF opisano 29% mężczyzn oraz 17% kobiet z wariantami chromosomów [366]. W grupie z niepowodzeniami rozrodu badanej przez Teo i wsp. odsetek nosicieli wariantów wynosił aż 36% [361]. Podobnie wysoki odsetek (34%) nosicieli wariantów różnych chromosomów stwierdzili w 84 osobowej grupie niepłodnych mężczyzn Penna i wsp. [367]. Szacuje się, że w populacji ogólnej najczęściej rozpoznawana inwersja pericentryczna inv(9)(p11q12) występuje z częstością 1%– 2%, natomiast wśród mężczyzn z niepowodzeniami rozro-du różnego typu częstość szacowana jest na 3,8%–4,2 [358, 362]. Z badań Collodela wynika, że wpływ tej inwersji na spermatogenezę jest zróżnicowany [358]. W populacji ogólnej wydłużony blok heterochromatyny 9qh+ występuje z częstością 6%-8% [362]. Eiben i wsp. [368] w badaniach dotyczących występowania heteromorfizmów u pacjentów z teratozoospermią określił częstość tego wariantu na 25% i spekulował, że obecność heterochromatynowych warian-tów chromosomów może być jednym z wielu nierozpozna-nych dotąd czynników zaburzających normalną spermato-genezę. Z kolei w badaniach Nakamury i wsp. [369] wśród 1790 niepłodnych mężczyzn najczęstszym wariantem (1,6%) był blok heterochromatyny 1qh+ wykrywany
za-równo wśród pacjentów z azoospermią, jak i normozo-ospermią [369].
Zarówno w grupie badanych pacjentów z normozo-ospermią (I), jak i z O;A;T odsetek nosicieli wariantów z jednoznacznie negatywnym wynikiem testu SPA był podobny do przypadków z kariotypem 46,XY (odpowied-nio 17% i 17% oraz 31% i 26%) (tabela 33.). Jednocześnie, w obydwóch grupach średnia wartość testu SPA dla nosi-cieli wariantów była niższa (o około 20%) w porównaniu z przypadkami z kariotypem 46,XY (tabela 33.). Wskazuje to, że warianty chromosomów faktycznie upośledzały zdol-ność plemników do penetracji oocytów in vitro choć tylko w niewielkim stopniu i bez jednoznaczengo związku z okre-śloną wadą nasienia.
Interesująca wydaje się dodatkowa obserwacja, że odse-tek wszystkich wykrytych wariantów u partnerek pacjentów zarówno z grupy I, jak i O;A;T (odpowiednio 8% i 10%) był wyższy niż w ogólnej populacji (około 2%). Wobec tej obserwacji ponownie nasuwa się przypuszczenie, że przy-czyną bezdzietności u wielu spośród badanych par było współwystępowanie obniżonej płodności (ang. subfertlity) u obydwóch partnerów. Stąd już tylko krok do być może kontrowersyjnej spekulacji, że mężczyźni i kobiety o obni-żonej płodności zawierają między sobą związki częściej niżby to wynikało jedynie ze zdarzeń losowych.