Badanie zdolno ci tworzenia struktur fimbrialnych przez bia ka DraE-epitop

W celu okre lenia zdolno ci skonstruowanych bia ek DraE-epitop do polimeryzacji i tworzenia struktury fimbrii przeprowadzono rozdzia elektroforetyczny otrzymanych frakcji fimbrialnych bez wst pnej denaturacji termicznej w 15% elu poliakrylamidowym, a nast pnie wykonano test Western blotting z wykorzystaniem przeciwcia anty-Dr (Rys. 37) [Metody 5.14.1].

Rys. 37. Wynik testu Western blotting z wykorzystaniem przeciwcia anty-Dr.

M - Marker wielko ci (Fermentas)

1 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90 po 10 min denaturacji próbki w 98^οC

2 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90 bez denaturacji termicznej 3 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-GRA1 po 10 minutach denaturacji próbki w 98^οC

4 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-GRA1 bez denaturacji termicznej

5 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-SAG1 po 10 minutach denaturacji próbki w 98^οC

6 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-SAG1 bez denaturacji termicznej

7 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-MAG1 po 10 minutach denaturacji próbki w 98^οC

8 – 20µl frakcji fimbrialnej komórek E.coli BL21(DE3)pCC90D54stop-pDraE-MAG1 bez denaturacji termicznej

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8

Natywne bia ko DraE tworzy bardzo stabiln struktur fimbrii. Nawet po podgrzaniu próbki przez 10 minut w 98^οC struktura fimbrii nie ulega ca kowitemu zniszczeniu. Na przedstawionym zdj ciu wida wyra nie sygna y pochodz ce od dimerów, trimerów oraz multimerów bia ka DraE. W próbce niedenaturowanej termicznie monomeryczne bia ko DraE nie wyst puje.

Natomiast w przypadku skonstruowanych chimerycznych bia ek DraE-epitop jedynie w przypadku bia ka DraE-GRA1 mo liwe jest zaobserwowanie sygna ów pochodz cych od dimerów, trimerów oraz tertramerów (brak sygna u od multimerów tego bia ka). W przypadku bia ek DraE-SAG1 oraz DraE-MAG1 nie zaobserwowano ró nic mi dzy próbkami denaturowanymi oraz niedenaturowanymi, co mo e wiadczy o tym, e wprowadzone sekwencje epitopowe zak ócaj proces polimeryzacji chimerycznego bia ka DraE w struktur fimbrii lub struktury te s labilne i ulegaj atwo rozpadowi w czasie elektroforetycznego rozdzia u lub pod wp ywem SDS-u.

6.8. Badanie zdolno ci tworzenia struktur fimbrialnych przez bia ka DraE-epitop z wykorzystaniem metody s czenia molekularnego Z tego wzgl du, i eksperyment w którym rozdzielano denaturowanane lub niedenaturowane termicznie próbki w elu poliakrylamidowym nie by przeprowadzony w natywnych warunkach istnia a mo liwo , e chimeryczne fimbrie ulega y rozpadowi pod wp ywem np. SDS-u zawartego w roztworach do elektroforezy poliakrylamidowej. Zatem w celu przeprowadzenia rozdzia u frakcji fimbrialnej w warunkach natywnych, preparat bia kowy poddano s czeniu molekularnemu na kolumnie Superdex 75 (Amersham) sprz onej z aparatem HPLC firmy Merck-Hitachi. Na kolumn jednorazowo nastrzykiwano 200 µl próby (do rozdzia u u ywano buforu PBS). Otrzymane wyniki przedstawiono na rysunkach 38, 39 , 40 ,41 i 42.

Rys. 38. Chromatogram przedstawiaj cy zale no absorbancji (280 nm) od czasu retencji uzyskany dla frakcji fimbrialnej bia ka DraE dzikiego typu.

Rys. 39. Chromatogram przedstawiaj cy zale no absorbancji (280 nm) od czasu retencji uzyskany dla frakcji fimbrialnej chimerycznego bia ka DraE-GRA1.

Rys. 40. Chromatogram przedstawiaj cy zale no absorbancji (280 nm) od czasu retencji

Rys. 41. Chromatogram przedstawiaj cy zale no absorbancji (280 nm) od czasu retencji uzyskany dla frakcji fimbrialnej chimerycznego bia ka DraE-MAG1.

Wykorzystana do s czenia molekularnego kolumna Superdex 75 (Amersham) ma zdolno rozdzielcz do 75 kDa. W przypadku natywnych fimbrii typu Dr bia ko eluowane jest po czasie 16,00 minut (Rys. 38) co odpowiada martwej obj to ci kolumny. Z tego wzgl du mo na wnioskowa , e natywne bia ko DraE (o masie ok. 14,9 kDa) w warunkach natywnych polimeryzuje tworz c struktury o masie powy ej 75 kDa. W przypadku fimbrii typu DraE-GRA1 (Rys. 39) maksimum elucji nast puje po 16,85 minuty co odpowiada masie bia ka oko o 70 kDa (warto oszacowana na podstawie wykresu wzorcowego). Oszacowana masa bia ka DraE-GRA1, z wykorzystaniem programy komputerowego Antheprot, wynosi ok. 15,5 kDa, tak wi c w tym przypadku mo na wnioskowa , e w warunkach natywnych bia ko DraE-GRA1 przybiera form tetrameru. W przypadku fimbrii typu DraE-SAG1 otrzymujemy czas retencji wynosz cy 17,51 minuty, czyli jest to najprawdopodobniej trimer lub dimer (Rys. 40). Natomiast w przypadku fimbrii typu Dr-MAG1 czas retencji wynosi 21,08 minuty co odpowiada elucji bia ka o masie oko o 16 kDa (Rys. 41). Wyniki te potwierdzi y dane otrzymane w eksperymencie z wykorzystaniem metody Western blotting. Nale y zwróci równie uwag na fakt, e w przypadku bia ek DraE-MAG1 oraz DraE-SAG1 poziom absorbancji jest zdecydowanie ni szy ni w przypadku bia ek DraE i DraE-GRA1, co równie mo e wiadczy o lepszej zdolno ci do tworzenia struktur multimerycznych przez bia ko DraE-GRA1 w porównaniu do antygenów

DraE-MAG1 oraz DraE-SAG1. Wprowadzona sekwencja epitopowa zak óca proces polimeryzacji fimbrii, a tym samym chimeryczne bia ka typu DraE-epitop nie s zdolne do stworzenia stabilnych struktur fimbrialnych tak jak bia ko dzikiego typu.

6.9. Badanie zdolno ci tworzenia struktur fimbrialnych przez bia ka DraE-epitop z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej

Do bada imunofluorescencyjnych zosta y wykorzystane hodowle bakteryjne E. coli:

Ø szczepu BL21(DE3)pCC90, eksprymuj cego natywne fimbrie typu Dr (kontrola pozytywna);

Ø szczepu BL21(DE3)pCC90D54stop/pDraE-epitop, eksprymuj cego chimeryczne fimbrie typu Dr-epitop;

Ø szczepu BL21(DE3)pCC90D54stop nie eksprymuj cego fimbrii (kontrola negatywna).

Hodowle bakteryjne odpowiednich szczepów rozcie czono w buforze PBS, a nast pnie inkubowano z pierwotnymi przeciwcia ami anty-Dr oraz wtórnymi przeciwcia ami anty-króliczymi znakowanymi fluorescencyjnie [Metody 5.14.3].

Rys. 42. Mikroskopia immunofluorescencyja komórek bakteryjnych E. coli szczepu BL21(DE3) zawieraj cych plazmidy: A) pCC90, B) pCC90D54stop, C) pCC90D54stop/pDraE-GRA1, D) pCC90D54stop/pDraE-SAG1, E) pCC90D54stop/pDraE-MAG1, inkubowanych z przeciwcia ami króliczymi anty-Dr i anty-króliczymi znakowanymi FITC. Prawa cz panelu – wiat o widzialne, lewa - UV (powi kszenie X 2500; mikroskop immunofluorescencyjny Olympus BX60).

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek bakteryjnych E. coli okre lonych szczepów eksprymuj cych natywne fimbrie Dr lub chimeryczne fimbrie DraE-epitop z u yciem pierwszorz dowych przeciwcia anty-Dr oraz drugorz dowych przeciwcia znakowanych FITC pozwoli a na stwierdzenie obecno ci bia ka DraE na powierzchni komórek bakteryjnych szczepu E. coli BL21(DE3)pCC90. Jednak e, w szczepach bakteryjnych E. coli BL21(DE3)pCC90D54stop/pDraE-epitop, eksprymuj cych chimeryczne fimbrie Dr-SAG1, DraE-MAG1 lub DraE-GRA1, stwierdzono sygna y ró ni ce si od sygna u otrzymanego w przypadku fimbrii natywnych (Rys. 42). Potwierdza to wcze niej wysuni ty wniosek, i wprowadzone sekwecje epitopowe w znacznym stopniu zak óci y proces polimeryzacji bia ka DraE.

6.10. Badanie zdolno ci adhezyjnych chimerycznych bia ek DraE-epitop