Biblioteka fragmentów

Program ModeRNA przeprowadza modelowanie na podstawie dostarczonego przez użytkownika szablonu i przyrównania. Miejsca w sekwencji celu, które nie mają odpowiednika w strukturze szablonu uzupełniane są fragmentami z biblioteki dołączonej do źródła programu. Głównym celem biblioteki fragmentów jest zapewnienie fragmentów łączących dwie reszty, a nie szukanie konkretnych motywów. Do wygenerowania biblioteki posłużył zbiór struktur rnaDB2005 oryginalnie użyty do wyliczenia możliwych konformacji

łańcucha głównego RNA (Murray and Carr, 2008). Zawiera on szeroką gamę konformacji, i jak pokazały testy na rodzinie tRNA, może zostać użyty do wygenerowania fragmentów o wystarczającej zmienności konformacyjnej pozwalającej na modelowanie insercji i delecji w kontekście modelowania porównawczego (Rother, i wsp., 2011). Fragmenty pochodzą z różnych rodzin, i żadna rodzina nie jest faworyzowany pod względem liczby struktur.

Już sama struktura rRNA (również zawarta w zbiorze rnaDB2005) jest, rozważana jako wystarczające źródło fragmentów do budowy modelu (Das and Baker, 2007).

Podobne podejście do modelowania fragmentów bez szablonu używane jest w programie SWISS^-MODEL do modelowania porównawczego białek (Schwede, i wsp., 2003).

Metoda oceny dopasowania fragmentów z biblioteki do reszty modelu była inspirowana bazą danych LIP (Michalsky, i wsp., 2003). Baza ta dedykowana jest modelowaniu homologicznemu pętli w białkach. Przechowuje fragmenty białek o długości od jednego do piętnastu aminokwasów. Procedura wyszukiwania w bazie fragmentu pasującego pomiędzy dwa niepołączone aminokwasy szablonu podzielona jest na dwa etapy.

W pierwszej, bardzo szybkiej, fazie szacowane jest RMSD fragmentów o odpowiedniej długości, a także identyczność szukanej sekwencji z sekwencją fragmentu. W drugim, zajmującym więcej czasu, etapie wyselekcjonowana pula fragmentów jest dopasowywana do modelu, liczone jest dokładne RMSD i odrzucane są fragmenty, które tworzące poważne zderzenia steryczne z modelem.

Biblioteka fragmentów ModeRNA zawiera fragmenty RNA o maksymalnej długości 17 nukleotydów. Takie ograniczenie wiąże się z rozmiarem całego pakietu ModeRNA.

W przypadku, gdy konieczne jest wstawienie dłuższego fragmentu ze strony programu ModeRNA pobrać można bibliotekę zawierająca fragmenty o długości do 100 nukleotydów (111MB). Procedura dopasowania fragmentów w programie ModeRNA również podzielona jest na dwa etapy. Podczas optymalizacji całego procesu szczególnie dużo czasu poświęcono na optymalizację funkcji szacującej RMSD. Porównane zostały różne wartości geometryczne (np. dystanse i kąty na płaszczyźnie wyznaczonej przez dwa wektory będące przedłużeniami odcinków pomiędzy atomami P i C4′ w obydwu resztach kotwiczących – Rycina 37).

Najdokładniejsze dopasowanie fragmentów uzyskane zostało, gdy do szacowania RMSD używanych było sześć dystansów pomiędzy odpowiadającymi sobie atomami z reszt kotwiczących (O5′; C5′; C4′; C3′; C1′; N1 lub N9). Wszystkim dystansom przypisana jest równa waga (rozdział 4.2.2.4). Analiza ta prowadzona była przez wielokrotne budowanie

modeli dla zbioru 99 tRNA. Na czas tej analizy z biblioteki wyłączone zostały fragmenty pochodzące z tRNA.

Rycina 37. Przykłady wartości rozważanych podczas implementacji programu ModeRNA jako kryteria wstępnego dopasowania fragmentu.

Ostateczne kryteria używane w bieżącej wersji programu ModeRNA omówione zostały w rozdziale 4.2.2.4 i przedstawia je Rycina 20.

Dalsze wsparcie dla zastosowanej metody modelowania elementów sekwencji celu bez szablonu zostało przedstawione przez Schudomę i wsp. (Schudoma, i wsp., 2010;

Schudoma, i wsp., 2010), którzy rozwinęli narzędzie do wyszukiwania fragmentów działające na bardzo podobnej zasadzie jak metoda zaimplementowana w ModeRNA. Przeprowadzona przez nich analiza wykazała, że podobieństwo strukturalne jest utrzymywane nawet w dużych pętlach i że jest skorelowane z podobieństwem sekwencyjnym. W badaniach przeprowadzonych przez Schudomę i wsp. uwzględnione zostały jedynie fragmenty jednoniciowe. W ModeRNA podejście modelowania regionów bez szablonu poprzez wstawianie fragmentów z biblioteki było z sukcesem stosowane do wszystkich regionów strukturalnych cząsteczki RNA. W czasie optymalizacji procedury wstawiania fragmentów porównane zostały: biblioteka zawierająca jedynie fragmenty pochodzące z regionów jednoniciowych oraz biblioteka utworzona ze wszystkich regionów cząsteczek RNA (również helis). Biblioteka zawierająca fragmenty pochodzące zarówno z regionów jedno- jak i dwuniciowych pozwoliła na uzyskanie dokładniejszego dopasowania fragmentów do modelu.

Struktura drugorzędowa została uwzględniona jako dodatkowe kryterium, które może zostać opcjonalnie wykorzystane podczas przeszukiwaniu biblioteki fragmentów programu ModeRNA. Biblioteka nie jest jednak przeznaczona do wyszukiwania motywów trzeciorzędowych, czy elementów dwuniciowych. W celu uwzględnienia takich fragmentów program ModeRNA wspiera bezpośrednie użycie elementów pobranych z innych szablonów.

Kilka baz danych specjalizujących się w motywach strukturalnych RNA ułatwia szukanie odpowiedniego fragmentu. Przykładowo RNAJunction zapewnia 12000 motywów złącza i całujących się pętli, uzyskanych z 1176 struktur RNA z bazy PDB (Bindewald, i wsp., 2008). Baza SCOR (Structural Classification of RNA) zawiera klasyfikację strukturalną i funkcjonalną 579 plików PDB. Wspiera ona wyszukiwanie motywów (np. zwrotu i pętli GNRA). Pozwala też na przegląd motywów znajdujących się we wskazanej strukturze PDB (Klosterman, i wsp., 2002). Baza WebFR3D (Sarver, i wsp., 2008) umożliwia szukanie motywów trzeciorzędowych poprzez definiowanie matrycy oddziaływań pomiędzy poszczególnymi nukleotydami.

Zaawansowanym narzędziem do poszukiwania fragmentów o zadanej sekwencji i strukturze drugorzędowej (określanej przez użytkownika w notacji VIENNA) jest baza FRABASE opracowana na podstawie 1990 plików PDB zawierających struktury RNA (Popenda, i wsp., 2008), (Popenda, i wsp., 2010). Przykłady struktur drugorzędowych, które mogą być wyszukiwane poprzez interfejs internetowy tej bazy przedstawia Rycina 38.

Ostatnio podobna baza – RNA CoSSMos, została zaproponowana przez Vanegasa i wsp.

Do szukania różnego rodzaju motywów pętli (symetrycznych i asymetrycznych pętli wewnętrznych, pętli terminalnych i wybrzuszeń) (Vanegas, i wsp., 2012).

Rycina 38. Przykłady motywów dostępnych w bazie FRABASE: A) spinka do włosów; B) wybrzuszenie; C) asymetryczna pętla wewnętrzna; D) złącze; E) całujące się pętle. Rycina przygotowana na podstawie ilustracji dostępnych na stronie bazy FRABASE (Popenda, i wsp., 2008).

Fragmenty wyszukane przez niezależne bazy danych mogą zostać z pomocą programu ModeRNA wycięte i wstawione do struktury modelu. Mogą być to zarówno fragmenty jedno- jak i dwuniciowe. Należy zauważyć, że wprowadzenie nawet prostego motywu może wpłynąć na całą strukturę przestrzenną (np. (Popenda, i wsp., 2008)). W programie ModeRNA użytkownik może też łączyć ze sobą dowolną ilość fragmentów. Wybiega to poza modelowanie prostych pętli i pozwala składać model RNA z motywów uzyskanych z wymienionych wcześniej bibliotek. Zautomatyzowane składanie fragmentów drugorzędowych pozwoliłoby na modelowanie de novo podobne do prezentowanego przez program RNA2D3D (Martinez, i wsp., 2008), FARNA (Das and Baker, 2007), lub MC-Fold/MC-Sym (Parisien and Major, 2008), jednak ten typ modelowania nie jest obecnie dostępny w programie ModeRNA.