BUDOWA STATERYNY I JEJ W£AŒCIWOŒCI

Stateryna jest 43-aminokwasowym polipeptydem o masie cz¹steczkowej 5380 Da i nastêpuj¹cej strukturze pierwszorzêdowej (Rys. 1) [7]:

Rysunek 1. Struktura pierwszorzêdowa stateryny [7] Figure 1. Primary structure of statherin [7]

Sekwencja aminokwasowa stateryny zosta³a w pe³ni okreœlona przez Schlesin-gera i Haya w roku 1977 [7], przy czym natywn¹ staterynê Hay wyizolowa³ ze œliny ludzkiej i czêœciowo scharakteryzowa³ wczeœniej, tj. w roku 1970 [8]. Sk³ad amino-kwasowy N-koñcowej czêœci natywnej cz¹steczki stateryny okreœlono za pomoc¹ techniki automatycznej degradacji Edmana. Polipeptyd by³ równie¿ poddany trawie-niu chymotrypsyn¹, trypsyn¹, i proteaz¹ Staphylococcus aureus. Otrzymane w ten sposób krótkie fragmenty peptydowe, po oczyszczeniu, poddano manualnej degra-dacji Edmana. Dziêki temu ustalono sekwencjê aminokwasow¹ a¿ do przedostat-niej, C-koñcowej reszty aminokwasowej. Te analizy, ³¹cznie z trawieniem karboksy-peptydaz¹ natywnej stateryny i jej fragmentów peptydowych, zakoñczy³y siê ustale-niem kompletnej sekwencji cz¹steczki. Ustalono m. in., i¿ dwie reszty seryny (w pozy-cji 2 i 3) poprzez grupy hydroksylowe s¹ zwi¹zane kowalencyjnie (wi¹zanie estro-we) z resztami kwasu fosforowego(V) [7]. Zdaniem niektórych autorów, za fosfory-lacjê stateryny w strukturze œlinianek odpowiedzialne s¹ kinazy bia³kowe [9, 10]. Nam i in. [11] scharakteryzowali i wyizolowali kinazê bia³kow¹ œlinianki podjêzy-kowej, która zdolna jest fosforylowaæ kwaœne bia³ka œliny bogate w prolinê. Ponadto w strukturze cz¹steczki stateryny mo¿na zauwa¿yæ du¿¹ zawartoœæ reszt L-proliny, L-glutaminy i L-tyrozyny, które stanowi¹ ponad 50% wszystkich reszt aminokwaso-wych. Inn¹ cech¹ jest du¿a powtarzalnoœæ sekwencji w C-koñcowej czêœci stateryny (dwie trzecie cz¹steczki). S¹ to nastêpuj¹ce sekwencje: czterokrotnie powtórzona -Gln-Pro-, dwukrotnie powtórzone, przylegaj¹ce do siebie -Gly-Tyr- oraz trzykrot-nie -Tyr-Gln- i dwukrottrzykrot-nie powtórzona sekwencja tetrapeptydowa -Pro-Tyr-Gln-Pro-. Kontrastuj¹ one silnie z sekwencjami dipeptydowymi, ulokowanymi w N-koñcowej czêœci cz¹steczki stateryny, które s¹ z³o¿one z dwóch takich samych, na³adowanych reszt aminokwasowych: -Glu-Glu-, -Arg-Arg-, -Ser(P)-Ser(P)- [7]. Natywna state-ryna ma charakter kwaœny, a jej punkt izoelektryczny znajduje siê w pH równym 4,2. Analizuj¹c budowê cz¹steczki stateryny mo¿na zauwa¿yæ, i¿ wysoko polarny charakter ma 1/3 cz¹steczki od jej N-koñca (reszty od 1 do 15). Znajduj¹ce siê w tym obszarze dziesiêæ polarnych reszt aminokwasowych wykazuje ³adunek ujemny (5 reszt) oraz dodatni (4 reszty). Pozosta³e 2/3 cz¹steczki ma w³aœciwoœci hydro-fobowe, gdy¿ zawiera wiêkszoœæ obojêtnych reszt aminokwasowych. Dodatkowo

w C-koñcowej czêœci cz¹steczki znajduj¹ siê wszystkie L-tyrozyny, L-proliny i L-glu-taminy (Rys. 2) [7, 12, 13].

Rysunek 2. Fragmenty stateryny wed³ug Schlesingera i Haya [7], Lamkina i in. [12], Schwartza i in. [13] Figure 2. Statherin fragments by Schlesinger & Haya [7], Lamkina et al. [12], Schwartza et al. [13]

W cz¹steczce stateryny mo¿na wyodrêbniæ ró¿ne motywy strukturalne. Raj i in. [6] badaj¹c staterynê metod¹ dichroizmu ko³owego (CD) stwierdzili, ¿e N-koñcowy fragment cz¹steczki tj. (Asp1-Gly15-) tworzy amfipatyczn¹ α-helisê z resztami hy-drofobowymi i hydrofilowymi, znajduj¹cymi siê po przeciwnych stronach helisy. Uzyskane wyniki zosta³y równie¿ potwierdzone metod¹ spektroskopii NMR [14].

C-koñcowy fragment cz¹steczki (-Pro36-Phe43-) przyjmuje strukturê helisy typu 3₁₀ [15], natomiast œrodkowy (-Pro20-Pro36-) strukturê helikaln¹ typu poli-L-proliny. W rezultacie amfipatyczna α-helisa oddzia³uje z czêœci¹ helisy poli-L-proliny, powo-duj¹c, i¿ reszty hydrofobowe w pozycjach 7, 8, 11 i 14 s¹ oddzielone od œrodowiska wodnego [14]. Analiza widm dichroizmu ko³owego wykaza³a, ¿e zawartoœæ struk-tury helikalnej w natywnej cz¹steczce wynosi zaledwie 15%, podobnie jak w przy-padku syntetycznej stateryny ok. 18–20%. Natomiast w 50% roztworze trifluoroeta-nolu (TFE) zawartoœæ struktury helikalnej wzrasta do ok. 25%, co wskazuje na istnie-nie fragmentów amfipatycznych w cz¹steczce. Na podkreœleistnie-nie zas³uguje rówistnie-nie¿ fakt, i¿ zawartoœæ struktury helikalnej ulega bardzo nieznacznym zmianom przy ró¿-nym stê¿eniu jonów wodorowych (pH) oraz jonów wapnia [14]. Ponadto jakakol-wiek zmiana ujemnego ³adunku w N-koñcowym fragmencie (1-15) cz¹steczki state-ryny powoduje obni¿enie jej tendencji do przyjmowania ustalonej struktury helikal-nej, a w rezultacie spadek stabilnoœci konformacyjnej. Natomiast usuniêcie czte-rech pierwszych (1-4) ujemnie na³adowanych reszt aminokwasowych powoduje ca³kowity zanik stabilnoœci konformacyjnej i ustalonej struktury helikalnej [14].

Konformacja stateryny ulega równie¿ zmianom w zale¿noœci od tego, czy znaj-duje siê w roztworze czy te¿ jest zaadsorbowana na powierzchni szkliwa zêba (Rys. 3, 4) [14]. W modelu ludzkiej, natywnej stateryny w roztworze wszystkie ujemnie na³adowane reszty z N-koñcowego fragmentu stateryny oraz Glu26 i C-koñcowa Phe43

zgromadzone s¹ razem w przestrzeni [14].

Natomiast atomy tlenu grup fosforanowych i hydroksylowych s¹ tak usytuowane w przestrzeni, i¿ mog¹ maksymalnie oddzia³ywaæ z jonami wapnia, które na powierz-chni hydroksyapatytu s¹ oddalone od siebie o 5,4 Å. Bior¹c pod uwagê

gromadze-nie siê ujemnych ³adunków w przestrzeni, a tak¿e zdolnoœæ dwóch cz¹steczek state-ryny do formowania dimerów w poprzek wyd³u¿onej struktury na C-koñcu, mo¿na wyjaœniæ proces hamowania pierwotnej precypitacji (wytr¹cania) soli wapniowo fos-foranowych. Dimer dwóch cz¹steczek stateryny, po³¹czony z powierzchni¹ szkliwa zêba (Rys. 3) zawiera skupione N-koñcowe ujemnie na³adowane grupy, które s¹ ca³kowicie wyeksponowane dla wi¹zania siê z j¹drem wapniowym, ale miejsca poten-cjalnej adhezji bakterii s¹ zamaskowane [14].

Rysunek 3. Model cz¹steczki stateryny w roztworze [14] Figure 3. Model of statherin molecule in solution [14]

W przedstawionym modelu kotwic¹ trzymaj¹c¹ jony wapnia narastaj¹cych zarodków krystalizacji w roztworze lub na powierzchni szkliwa jest reszta Glu26

oddalona od polarnego N-koñca stateryny, która przy udziale C-koñcowego frag-mentu Tyr38-Phe43 mo¿e odpowiadaæ za funkcjê mineralizacyjn¹ stateryny w jamie ustnej [14].

Cz¹steczki stateryny charakteryzuj¹ siê wysokim powinowactwem do hydroksy-apatytu. W momencie, gdy nastêpuje adsorpcja cz¹steczek stateryny z roztworu na powierzchniê hydroksyapatytu, ulegaj¹ one czêœciowemu rozfa³dowaniu. Taka zmiana konformacji jest korzystna termodynamicznie, gdy¿ miêdzy C-koñcowymi resztami L-tyrozyny i/lub L-glutaminy tworz¹ siê wi¹zania wodorowe. W wyniku rozfa³dowa-nia wyeksponowane zostaj¹ potencjalne miejsca wi¹¿¹ce dla bakterii (kryptotopy), które w przypadku wystêpuj¹cej konformacji w roztworze, s¹ zamaskowane. Naj-czêœciej s¹ to C-koñcowe segmenty -Pro-Gln-, które s¹ rozpoznawane przez adhe-zyny bakteryjne [16]. N-koñcowy fragment stateryny (Asp1-Glu26) s³u¿y do zakotwi-czenia cz¹steczki na HAP, podczas gdy C-koñcowy segment mo¿e byæ doœæ elas-tyczny, zwiêkszaj¹c stabilnoœæ cz¹steczki przez oddzia³ywanie z powierzchni¹ HAP (Rys. 4).

Rysunek 4. Model cz¹steczki stateryny na powierzchni szkliwa [14] Figure 4. Model of statherin molecule on enamel surface [14]

Przedstawione modele struktury stateryny w roztworze i na powierzchni hydro-ksyapatytu (Rys. 3, 4) wyjaœniaj¹ funkcjonowanie jej jako smaru granicznego i jako czynnika promuj¹cego adhezjê bakterii.

Model przedstawiony na Rysunku 3 jest konformacj¹ dimerów cz¹steczek state-ryny w roztworze, w której miejsca bakteryjnego rozpoznawania s¹ maskowane przez pofa³dowanie struktury. Podczas wi¹zania siê stateryny z roztworu do powierzchni szkliwa, mo¿e nast¹piæ jej czêœciowe rozfa³dowanie, co pokazuje Rysunek 4. Na tym modelu stateryna jest czêœciowo rozwiniêta, ale zachowuje swój indywidualny, strukturalny porz¹dek. Badania na syntetycznych fragmentach bia³ek bogatych w prolinê pokaza³y, ¿e bakteryjne adhezyny (miejsca przylegania) mog¹ rozró¿niaæ C-terminalne segmenty -Pro-Gln-. W C-koñcowym odcinku cz¹steczki stateryny wystêpuj¹ dwie takie sekwencje dipeptydowe (reszty 31-32 oraz 36-37). W przed-stawionym modelu (Rys. 3) te dwa dipeptydowe segmenty s¹ czêœciowo zakryte, w wyniku formowania dimerów stateryny, i dlatego s¹ niedostêpne dla bakteryjnej adhezji. Czêœciowe rozwiniêcie cz¹steczki na powierzchni szkliwa udostêpnia frag-menty -Pro-Gln- dla w³aœciwego oddzia³ywania z adhezynami bakteryjnymi [14].