Chemometryczna metoda wyznaczania widm zaburzonych

Badania nad skuteczną metodą uzyskiwania właściwych widm zaburzonych na podstawie analizy danych spektralnych były od dawna prowadzone i rozwijane w zespole Stangreta. Jego prace skupiają się między innymi na poszukiwaniu widm wody zaburzonej przez szereg substancji rozpuszczonych oraz wyznaczeniu parametru N, określającego liczbę cząsteczek zaburzonych, równą liczbie moli cząsteczek wody zaburzonej przez jeden mol substancji rozpuszczonej ^{183, 184}. Metoda uzyskiwania widm zaburzonych została w tym samym zespole zautomatyzowana poprzez wykorzystanie algorytmów chemometrycznych opartych na analizie serii widm roztworów. Zostało to dokładnie opisane w publikacji ¹⁸⁵ oraz zastosowane, również z moim udziałem, w analizie układów zawierających DNA ¹⁸⁶. W niniejszej pracy zastosowałam tę metodę do otrzymania widm DNA zaburzonego przez wybrane osmolity oraz do wyznaczenia liczby cząsteczek osmolitu zaburzonego przez obecność DNA w roztworze.

Metoda widm różnicowych zaproponowana przez Stangreta może być wykorzystywana do analizy różnych układów, jeśli tylko możliwe jest wyodrębnienie udziału zaburzonego (affected, a) i niezaburzonego (bulk, b) badanego składnika w obecności substancji rozpuszczonej w roztworze:

∙ = ∙ + ∙

(Rów. 2)

gdzie ε, ε_a, ε_b oznaczają odpowiednio, widmo roztworu badanego składnika, widmo jego części zaburzonej oraz niezaburzonej, natomiast c = ca + cb wyraża całkowite stężenie badanej substancji w roztworze (mol∙dm^-3).

Przekształcając równanie możemy wyznaczyć widmo czynnika zaburzonego w roztworze:

= ( − ) +

(Rów. 3)

Zakładając, że c = 1/MV, natomiast c_a = Nm/V, uzyskujemy równanie 3 w postaci:

= 1

( − ) +

(Rów. 4)

gdzie m oznacza molalność roztworu substancji rozpuszczonej (mol∙kg^-1); M – masę molową badanego składnika (kg∙mol^-1); V – objętość roztworu zawierającego m moli substancji rozpuszczonej i jeden kilogram czynnika badanego; N – liczbę cząsteczek zaburzonych, równą liczbie moli cząsteczek badanego czynnika zaburzonych przez jeden mol substancji rozpuszczonej.

Przedstawione powyżej równanie 4 jest najlepiej spełnione, gdy m → 0 i sprowadza się do postaci:

= 1

+

(Rów. 5)

Pochodna z powyższego równania, w warunkach nieskończonego rozcieńczenia substancji rozpuszczonej, jest uzyskiwana poprzez aproksymację ε względem m, dla każdej liczby falowej w całej serii widm danego układu, mierzonych dla różnych molalności substancji rozpuszczonej. Równanie 5 zawiera dwie niewiadome: εa oraz wartość N, w związku z tym poznając jedną z nich jednocześnie poznajemy także drugą.

Przykładowy zestaw próbnych widm zaburzonych dla różnych wartości N został przedstawiony na Rysunku 9. Ze wzrostem wartości parametru N, widmo zaburzone staje się bardziej podobne do widma czystego czynnika. Dzieje się tak, ponieważ udział widma zaburzonego maleje ze wzrostem N, a udział czystego czynnika staje się bardziej istotny.

Klasyczna metoda otrzymywania widma zaburzonego polega na znalezieniu spośród serii widm wyznaczonych z równania 5, na podstawie

analizy ich kształtu, tego widma, które w całym rozpatrywanym regionie nie posiada pasm ujemnych, jego kształt ma sens fizyczny i nie zawiera w sobie udziału formy niezaburzonej. Metoda ta jest niestety czasochłonna i pozwala na przeanalizowanie jedynie niewielkiej liczby testowych widm zaburzonych.

Rysunek 9. Przykładowy zestaw próbnych widm zaburzonych N,N,N-trimetyloglicyny dla wybranych wartości parametru N. Kolorem czerwonym zostało zaznaczone widmo niezaburzone N,N,N-trimetyloglicyny.

Procedura otrzymywania kształtu widma zaburzonego i odpowiadającej mu wartości parametru N została zautomatyzowana przez Bruździaka poprzez zastosowanie metody chemometrycznej ¹⁸⁵ i wykorzystana przeze mnie do wyznaczenia liczby cząsteczek osmolitu zaburzonych w roztworze przez DNA.

Metoda ta opiera się na wykorzystaniu równania 5 do wyznaczenia dla danej substancji rozpuszczonej serii próbnych widm zaburzonych, z których tylko jedno odpowiada poszukiwanej wartości parametru N. Udział indywiduum niezaburzonego w tych próbnych widmach zmienia się od zera (dla wartości N równych lub niższych od wartości poszukiwanej) do prawie 100 % (dla dużych wartości N). Podobnie, jak w metodzie klasycznej poszukuje się wartości parametru N, który odpowiada widmu zaburzonemu (εa), nieposiadającemu udziału widma formy niezaburzonej i pasm ujemnych. Bruździak zaproponował

1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08

Absorbancja

Liczba falowa [cm^-1] czysta TMG N=1

N=9

metodę chemometryczną polegającą na powtarzającej się cyklicznie analizie małych podzestawów widm testowych, określanych jako „okna”, co pozwala znaleźć prawdziwą wartość parametru N. Jest to wartość znajdująca się na granicy pomiędzy podzestawem próbnych widm zaburzonych, które nie zawierają jeszcze udziału formy niezaburzonej, a podzestawem w którym się ona pojawia. W celu zwiększenia dokładności wyznaczenia parametru N, analizę taką powtarza się cyklicznie dla coraz węższych zakresów serii próbnych widm zaburzonych (szerokości „okien”).

Wybrane z serii próbnych widm zaburzonych widma w danym podzestawie są porównywane z widmem niezaburzonej substancji badanej.

Podobieństwo tych czynników do widma niezaburzonego określa się za pomocą parametru ², a sumę dwóch najniższych uzyskanych parametrów ² nazwano sumarycznym parametrem ² (Σ²).

Rysunek 10. Przykładowa mapa parametru Σ² dla N,N,N–trimetyloglicyny zaburzonej przez obecne w roztworze DNA. Biały region oznacza małe podobieństwo wyizolowanych czynników do widma N,N,N–trimetyloglicyny; pozostałe kolory oznaczają wysokie podobieństwo przynajmniej jednego z wyizolowanych czynników do widma N,N,N–trimetyloglicyny. Czerwoną strzałką zaznaczone jest miejsce na osi, gdzie wyznaczony został parametr N.

szerokosc okienka

N*10

5 132129 1.9

2.9

3.9

4.9

5.9

6.9

7.9

8.9

9.9

Parametr N

5 21 szerokość „okna”

Skok wartości parametru Σ² związany jest z właściwą wartością parametru N i co się z tym wiąże również z poszukiwanym widmem osmolitu zaburzonego przez obecność DNA w roztworze. Wyniki opisanej analizy chemometrycznej przedstawiane są w postaci mapy parametru Σ², na której granica pomiędzy regionami oznaczającymi małe i duże podobieństwo wyznacza wartość parametru N. Granica ta wyznaczona jest przez ostre przejście pomiędzy różnymi kolorami na mapie w miejscu wskazującym na osi poszukiwaną wartość N, jak to zostało przedstawione na przykładowej mapie dla jednego z badanych układów (Rysunek 10).

Analogiczna metoda została przeze mnie wykorzystana do wyznaczenia widm DNA zaburzonego przez osmolity w roztworze. Substancja rozpuszczona oddziałuje w roztworze wodnym na biocząsteczkę pośrednio lub bezpośrednio.

W wyniku tego oddziaływania badane DNA występuje w roztworze również w dwóch stanach: zaburzonym (a) i niezaburzonym (b). Korzystając z prawa addytywności absorpcji możemy zapisać widmo takiego układu (A), jako:

= +

(Rów. 6)

gdzie A_a i A_b oznaczają widma poszczególnych indywiduów, a x_a i x_b ich udziały molowe w całkowitym widmie. Prawo addytywności można zastosować tylko wtedy, gdy objętość własna obu rozważanych form biomakrocząsteczki jest taka sama, co powinno być spełnione gdy różnice w ich strukturze są niewielkie. Po odpowiednim przekształceniu równania 6 uzyskujemy wzór, który pozwala wyznaczyć widmo formy zaburzonej (Aa):

= 1

( − ) +

(Rów. 7)

Równanie 7 zawiera dwie niewiadome: widmo formy zaburzonej, A_a oraz wartość parametru 1/x_a. Poznając jedną z tych niewiadomych, równocześnie poznajemy i drugą. Wykorzystując analogiczną do powyższej metodę chemometryczną, na podstawie równania 7, wyznacza się serię testowych widm zaburzonych (A_a) dla kolejnych wartości parametru 1/x_a, który jest większy lub równy 1.

W rozpatrywanym w tej pracy przypadku wyizolowane z serii testowych widm zaburzonych widma czystych czynników są porównywane z widmem DNA niezaburzonego uzyskanym z pomiaru DNA w roztworze wodnym bez udziału osmolitu. Przykładowe mapy parametru Σ² związanego z właściwą wartością parametru 1/xa oraz z procentową zawartością struktury DNA zaburzonej przez osmolit, zostały przedstawione na przykładowym zestawieniu dla jednego z badanych układów DNA – woda – N,N,N–trimetyloglicyna (Rysunek 11).

Rysunek 11. Przykładowe mapy parametru Σ² dla DNA zaburzonego przez N,N,N-trimetyloglicynę obecną w roztworze (stężenia N,N,N-trimetyloglicyny podane powyżej każdej z map). Biały region oznacza małe podobieństwo wyizolowanych czynników do widma DNA; pola szare to obszar „pusty”; pozostałe kolory oznaczają wysokie podobieństwo przynajmniej jednego z wyizolowanych czynników do widma DNA.

Czerwonymi strzałkami zaznaczone są miejsca na osiach, gdzie wyznaczony został parametr 1/xa (lub procent zaburzenia struktury DNA przez osmolit).