Chromatograficzne oznaczanie związków polifenolowych

3.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest najczęściej stosowaną techniką separacyjną w analizie związków polifenolowych. Najczęściej rozdzielenie prowadzi się w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) z zastosowaniem kolumn C18 i faz ruchomych będących mieszaninami wody z acetonitrylem bądź metanolem. Coraz częściej, jako metodę detekcji stosuje się spektrometrię mas, która stopniowo zaczyna wypierad inne metody detekcji (np. metody spektrofotometryczne). Wykorzystanie trybów oferowanych przez spektrometrię mas, m. in. trybu SRM (ang. Single Reaction Monitring) podwyższa czułośd oznaczeo i jest często wykorzystywane w oznaczeniach ilościowych analizowanych związków. Dodatkowo spektrometria mas umożliwia przypisanie struktur związków polifenolowych wykrytych w próbkach o skomplikowanych matrycach. W ostatnim czasie pojawiło wiele prac przeglądowych poświęconych wykorzystaniu chromatografii cieczowej w analizie związków polifenolowych *134-137].

Częstym problemem w analizie związków polifenolowych jest zjawisko ich koelucji, nawet z zastosowaniem kolumn o wysokiej rozdzielczości. Dodatkowym mankamentem tej techniki w analizie związków polifenolowych jest długi czas pojedynczej analizy, wynoszący z reguły od 30 min do godziny. Harnly *138] przedstawił rozdzielenie flawonoidów wyekstrahowanych z owoców i orzechów, stosując mieszaninę metanolu, acetonitrylu i kwasu trifluorooctowego jako fazy ruchomej. Autorom udało się rozdzielid 20 związków polifenolowych w 60 minut. Sakakibara i współ. [139+ opracowali metodę pozwalającą na rozdzielnie i ilościowe oznaczenie szeregu klas związków polifenolowych

50 w próbkach żywności, jednak czas pojedynczej analizy wynosił aż 95 minut.

Chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas została także wykorzystana do analizy wybranych związków polifenolowych w naparach liści Forsythia supensa zebranych w różnym okresie wegetacyjnym [140+. Autorzy tej pracy skupili się jednak na konkretnych pięciu wybranych związkach polifenolowych, zatem problemy napotykane w analizie chromatograficznej związków polifenolowych zostały ograniczone do minimum. Lee i współ. [141] przeprowadzili analizę związków polifenolowych w soku z aronii. Czas pojedynczej analizy w tym przypadku wynosił ok. 70 minut.

3.2. Ultrasprawna chromatografia cieczowa

Trend panujący od dłuższego czasu w chromatografii cieczowej to prowadzenie analiz z wykorzystaniem ziaren fazy stacjonarnej o coraz mniejszych średnicach

< 2 m [142+. Zaletami złóż o małych średnicach są przede wszystkim wysoka efektywnośd rozdzieleo oraz możliwośd skrócenia czasów analiz. Są to podstawy do tzw. szybkich analiz. Kosztem, jaki trzeba ponieśd za cenę takiego rozdzielenia, jest wzrost ciśnienia na wlocie na kolumnę, które w analizach z zastosowaniem złóż sub-2-μm jest większe niż 500 barów *143+. W przypadku klasycznych układów HPLC nie przekracza ono 400 barów.

W ostatnim czasie pojawia się coraz więcej prac poświęconych wykorzystaniu ultrasprawnej chromatografii cieczowej w analizie związków polifenolowych. Wiele z nich porównuje użycie HPLC z UHPLC, skłaniając się w stronę zasadności użycia w analizach kolumn o małych średnicach ziaren. Schwarz wraz ze współpracownikami *144+ porównali RP-HPLC z wykorzystaniem kolumn C18 z ultrasprawną chromatografią cieczową, w której wykorzystana została kolumna UPLC BEH C18. Czas pojedynczej analizy udało się skrócid 10 razy z wykorzystaniem układu UPLC (z 60 min w przypadku HPLC do 6,4 min). Uzyskane chromatogramy przedstawiono na rysunku 22.

51 Rys. 22. Rozdzielenie związków polifenolowych w próbce brandy z zastosowaniem HPLC oraz UPLC [144].

Ortega [145+ porównał rezultaty analiz procyjanidyn w próbce kakao otrzymanych z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych (średnica stosowanej fazy stacjonarnej wynosiła 5 μm) i ultrasprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych (zastosowana kolumna HSS T3 o średnicy ziaren 1,8 μm). W obydwu przypadkach zastosowano tandemową spektrometrię mas jako metodę detekcji. Okazało się, że z zastosowaniem UHPLC czas analizy został skrócony do 12,5 min (z 80 min w przypadku klasycznego HPLC) z jednoczesną poprawą efektywności rozdzielenia dla badanych związków. Podobne rezultaty zostały uzyskane przez de Villersa i wsp. [146]. W przypadku analizowanych przez nich procyjanidyn w próbce kakao oraz flawonoidów w próbce zielonej herbaty, czas pojedynczej analizy udało się skrócid trzykrotnie, gdy zastosowano UHPLC. Guillarme i wsp. [147+ wykorzystując kolumnę C18 o średnicy ziaren 1,7 μm opracowali metodę pozwalającą na rozdzielenie 8 katechin w zielonej herbacie w zaledwie 30s. Wydłużenie gradientu do 8 min, pozwoliło autorom

HPLC

UPLC

52 tej publikacji na osiągnięcie lepszej selektywności i rozdzielczości w odniesieniu do klasycznej analizy z wykorzystaniem kolumny C18. Coraz więcej prac dotyczy zastosowania UHPLC w analizie produktów spożywczych takich jak napary ziołowe i wina [144,148-151], owoce [152,153], ekstrakty roślinne [154,155], miód *156] oraz produkty mleczne [157+. Autorzy wszystkich prac prezentujących zastosowanie ultrasprawnej chromatografii cieczowej zwracają uwagę na krótki czas pojedynczych analiz, wysoką czułośd oznaczeo oraz małe zużycie odczynników. Natomiast sam potencjał ultrasprawnej chromatografii cieczowej można zobrazowad na przykładzie metody opracowanej przez Eprilati i wsp. [152+, która pozwala na oznaczenie 135 związków polifenolowych w próbkach owoców, herbaty i wina w ok 15 minut.

3.3. Wysokotemperaturowa chromatografia cieczowa

W teorii chromatografii temperatura, w której prowadzone jest rozdzielenie wpływa na selektywnośd, retencję badanych związków oraz przede wszystkim na lepkośd stosowanej fazy ruchomej. Wraz ze wzrostem temperatury maleje lepkośd stosowanego eluentu, co daje możliwośd zastosowania wyższych wartości przepływu fazy ruchomej a więc prowadzenia analiz w krótkim czasie. Trzeba jednak zwrócid uwagę na fakt, że zastosowanie dużych wartości przepływu w klasycznych układach do HPLC pociąga za sobą duży wzrost ciśnienia na wlocie na kolumnę. To sprawia, że rozdzielenia w wysokiej temperaturze prowadzi się często z wykorzystaniem aparatury dedykowanej do UHPLC.

Można zatem stwierdzid, że HTLC i UHPLC są technikami komplementarnymi. Znalazło to swoje przełożenie w analizie związków polifenolowych. Klejdus *158+ przeprowadził rozdzielenie 13 izoflawonów w preparatach sojowych i ekstraktach roślinnych z wykorzystaniem kolumny Zobrax C18 w temperaturze 80 ^oC. Czas analizy wynosił 1 min.

Ten sam zespół badawczy porównał efektywnośd rozdzielenia mieszaniny kwasów polifenolowych i izoflawonów z zastosowaniem różnych faz stacjonarnych w ultrasprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych *154].

Stwierdzono, że najlepszą efektywnośd rozdzielenia uzyskano z zastosowaniem kolumny cyjanopropylowej o średnicy ziarna 1,8 μm w temperaturze 58 ^oC. Czas analizy dla próbki zawierającej 19 związków wynosił 1,9 minuty (rys. 23).

53 Rys 23. Porównanie efektywności rozdzieleo z zastosowaniem różnego typu faz

stacjonarnych w wysokotemperaturowej chromatografii cieczowej [149].

3.4. Wielowymiarowa chromatografia w analizie flawonoidów

To, jakie wymagania stawiane są współczesnej chromatografii cieczowej w analizie związków polifenolowych, można zobrazowad na przykładzie analizy procyjanidyn [159].

Związki te, obecne między innymi w winie, mogą występowad zarówno w formie monomerów, oligomerów jak i polimerów. Należy wspomnied, że stopieo polimeryzacji tych związków rośnie wykładniczo. Meyer [159] zwraca uwagę, że same dimery procyjanidyn oparte na pierścieniu katechiny i epikatechiny mogą występowad aż w 48

54 wariantach. Chcąc przeprowadzid kompleksową analizę danej próbki pod kątem występujących w niej procyjanidyn, jak i pozostałych związków polifenolowych, występujących często w śladowych ilościach, potencjał oferowany przez techniki jednowymiarowe przestaje byd wystarczający. Ograniczenie to dotyczy także wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Jednowymiarowa analiza chromatograficzna dużej liczby związków o podobnych właściwościach skutkuje uzyskiwaniem sygnałów cechujących się zbliżonymi wartościami czasów retencji, a więc zjawisku koelucji.

W takich przypadkach konieczne jest przeprowadzenie analizy tej samej próbki w wielu wymiarach a więc przeprowadzenie jej rozdzielenia na podstawie kilku jej właściwości.

Mimo znacznie bardziej skomplikowanych rozwiązao aparaturowych w stosunku do jednowymiarowej chromatografii, chromatografia dwuwymiarowa (2D) staje się obiecującym narzędziem pracy w analizie związków polifenolowych. Dodatkowym atutem tej techniki jest to, że rozdzielenie w każdym wymiarze przebiega według ortogonalnego mechanizmu w stosunku do drugiego. Dwuwymiarową analizę chromatograficzną w trybie on-line wykorzystano w analizie próbek piwa, wina i naparów ziołowych [160-162+. We wszystkich trzech przytoczonych przypadkach wykorzystano chromatografię w układzie faz odwróconych (RP-LC) w obydwu wymiarach. Działanie to ma na celu głównie zwiększenie pojemności pikowej dla danego rozdzielenia. Jednak nie jest to jedyne możliwe połączenie. Wykorzystano także połączenie chromatografii oddziaływao hydrofilowych (HILIC) z chromatografią w układzie faz odwróconych (RP-LC) w analizie wspomnianych wcześniej procyjanidyn w próbce kakao oraz ekstrakcie z jabłek [163].

Autorzy pracy zwracają uwagę na wykorzystanie przez nich ortogonalności tych dwóch technik chromatograficznych. Podczas rozdzielenia procyjanidyn w pierwszym wymiarze (z wykorzystaniem chromatografii HILIC), związki są rozdzielane w oparciu o ich polarnośd.

W przypadku procyjanidyn oznacza to dłuższą retencję związków zawierających w swojej budowie więcej grup hydroksylowych. Można więc powiedzied, że w tym etapie następuje rozdzielenie poszczególnych izomerów. W przypadku rozdzielenia tych analitów w drugim wymiarze (z zastosowaniem chromatografii w układzie faz odwróconych) związki są rozdzielane w oparciu o ich hydrofobowośd. Zatem związki mające więcej grup hydroksylowych w cząsteczce są słabo zatrzymywane na kolumnie, co przekłada się na ich krótkie czasy retencji (odwrotnie niż w analizie w pierwszym wymiarze). Połączenie

HILIC-55 RPLC w trybie off-line zostało także zastosowane w analizie związków polifenolowych w zielonej herbacie [104+. Zauważono, że retencja związków w pierwszym wymiarze, przeprowadzonym z użyciem chromatografii oddziaływao hydrofilowych rośnie wraz ze wzrostem ilości podstawników cukrowych w cząsteczce, natomiast mono-, di- i triglikozydy są rozdzielane w wymiarze drugim z wykorzystaniem chromatografii w układzie faz odwróconych.