Cząsteczki anty-sRNA inaczej oddziałują z miejscami wiązania RNA na powierzchni Hfq niż

Celem kolejnego etapu badań w projekcie było określenie sposobu oddziaływania anty-sRNA z białkiem Hfq, aby porównać je z mechanizmem wiązania Hfq do sRNA i mRNA. Analizowane cząsteczki RNA posiadają sekwencje charakterystyczne dla miejsc wiązania Hfq (Ryc. 23 A-C), a eksperymentalnie wyznaczone struktury drugorzędowe RNA wskazują, że regiony te znajdują się w sekwencjach nietworzących struktur drugorzędowych (Ryc. 24 A-C, Ryc. 25).

Aby określić udział poszczególnych miejsc wiązania RNA na powierzchni białka Hfq w wiązaniu analizowanych anty-sRNA, wykonano reakcję kompetycji wobec oligorybonukleotydów wiążących się specyficznie do strony proksymalnej (U18) i dystalnej (A27), co pozwoliło na wyznaczenie wartości IC50. Wartość ta odpowiada stężeniu kompetytorowego RNA dla którego połowa RNA pozostaje związana z białkiem. Reakcja kompetycji w równowadze polegała na związaniu do Hfq znakowanego oligorybonukleotydu A27 specyficznie oddziałującego ze stroną dystalną Hfq lub U18, który wiąże się do powierzchni proksymalnej Hfq. Następnie do Hfq związanego z danym oligorybonukleotydem dodawano badane sRNA lub anty-sRNA w rosnących stężeniach i obserwowano jego zdolność do wymuszania dysocjacji znakowanego RNA od białka Hfq.

Analiza zdolności kompetycji anty-sRNA chbBC-IGR o wiązanie do białka Hfq ze znakowanymi radioaktywnie oligorybonukleotydami A27 i U18 wykazała, że chbBC-IGR nie konkuruje z oligorybonukleotydem U18 o stronę proksymalną białka Hfq (Tab. 3). Anty-sRNA posiada jedynie niewielką zdolność konkurencji z A27 o wiązanie do strony dystalnej Hfq, jednak wartość IC50 jest dużo wyższa, niż dla sRNA ChiX zależnego od strony dystalnej (Malecka i wsp., 2015), (Tab. 3). Jest to spójne ze znajdującą się w chbBC-IGR sekwencją zawierającą reszty adenozyn (Ryc. 23 A), która jest znanym miejscem rozpoznawania białka Hfq (Updegrove i wsp., 2008, Zhang i wsp., 2013, Ellis i wsp., 2015, Malecka i wsp., 2015, Schu i wsp., 2015, Wang i wsp., 2015). Dane sugerują, że chbBC-IGR oddziałuje z trzecią, boczną

stroną Hfq, gdyż posiada sekwencję zawierającą reszty adenozyn i urydyn, które służą do rozpoznawania tej powierzchni białka (Ishikawa i wsp., 2012, Murina i wsp., 2013, Panja i wsp., 2013, Dimastrogiovanni i wsp., 2014, Malecka i wsp., 2015, Schu i wsp., 2015). mRNA chiP, które ulega regulacji przy udziale sRNA ChiX, również zawiera sekwencje bogate w reszty nukleotydowe adenozyn i urydyn (Schu i wsp., 2015). Może to świadczyć o podobnym mechanizmie oddziaływania w kompleksie z Hfq sRNA ChiX z anty-sRNA oraz z mRNA.

Z kolei eksperyment IC50 wykonany dla 3'ETS^leuZ wykazał, że anty-sRNA efektywnie konkuruje ze znakowanym radioaktywnie oligorybonukleotydem A27 o wiązanie do strony dystalnej białka Hfq z wartością IC50 2,7 nM (Tab. 3). Jest to spójne z posiadaną przez 3'ETS^leuZ sekwencją zawierającą motywy ARN (Ryc. 23 B), która jest znanym miejscem wiązania strony dystalnej Hfq (Robinson i wsp., 2014). 3'ETS^leuZ w mniejszym stopniu wypierało także znakowany radioaktywnie oligorybonukleotyd U18 ze strony proksymalnej Hfq z IC50 40 nM (Tab. 3), co sugeruje niewielkie powinowactwo do tej powierzchni Hfq. Wyniki wskazują, że głównym miejscem wiązania 3'ETS^leuZ jest strona dystalna, co przypomina wiązanie mRNA regulowanych przez sRNA z klasy I.

Tabela 3 Średnie wartości IC50 dla kompetycji analizowanych RNA o dostęp do białka Hfq z

32P-A27 i ³²P-U18.

Analiza zdolności kompetycji anty-sRNA AgvB o wiązanie do białka Hfq ze znakowanymi radioaktywnie oligorybonukleotydami A27 i U18 wykazała, że AgvB wydajnie konkuruje ze znakowanym oligorybonukleotydem A27 o wiązanie do powierzchni dystalnej z IC50 3,2 nM. Jest to spójne z faktem, że w obrębie AgvB znajduje się sekwencja bogata w reszty adenozyn, która jest dobrze

scharakteryzowanym miejscem rozpoznawania strony dystalnej Hfq (Updegrove i wsp., 2008, Zhang i wsp., 2013, Ellis i wsp., 2015, Malecka i wsp., 2015, Schu i wsp., 2015, Wang i wsp., 2015). Co więcej, AgvB również wydajnie wypierało znakowany radioaktywnie oligorybonukleotyd U18 ze strony proksymalnej Hfq z IC50 9,9 nM (Tab. 3). Może to być związane z występowaniem na 3ʹ końcu AgvB sekwencji oligo(U) (Ryc. 23 C), która jest rozpoznawana przez stronę proksymalną białka Hfq (Sauer i Weichenrieder, 2011). Oddziaływanie AgvB ze stronami dystalną i proksymalną białka Hfq jest podobne do wiązania sRNA z klasy II przez Hfq (Schu i wsp., 2015).

Eksperyment IC50 wykonany dla sRNA GcvB wykazał, że GcvB nie konkuruje z A27 o stronę dystalną Hfq oraz wykazuje niewielką zdolność wypierania U18 ze strony proksymalnej z IC50 26 nM (Tab. 3). Wiązanie strony proksymalnej jest możliwe, przez sekwencję oligo(U) znajdującą się na końcu 3ʹ GcvB. Uzyskane wyniki sugerują udział trzeciej, bocznej powierzchni Hfq w oddziaływaniu z GcvB.

Jest to spójne z faktem występowania licznych reszt urydyn w obrębie sekwencji tego sRNA, które są znanym miejscem oddziaływania ze stroną boczną Hfq (Ishikawa i wsp., 2012, Murina i wsp., 2013, Panja i wsp., 2013, Dimastrogiovanni i wsp., 2014, Malecka i wsp., 2015, Schu i wsp., 2015). Podsumowując, oddziaływanie GcvB z Hfq jest podobne do wiązania Hfq przez sRNA z klasy I, jednak powinowactwo do strony proksymalnej jest niższe, niż dla typowych sRNA z tej klasy. Sugeruje to, że GcvB może też zachowywać się jak mRNA oddziałujące z sRNA z klasy II, wiążąc powierzchnię boczną Hfq (Schu i wsp., 2015).

Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, że sposób wiązania anty-sRNA przez Hfq przypomina oddziaływanie Hfq z mRNA i sRNA. Wiązanie chbBC-IGR do strony bocznej Hfq jest podobne do oddziaływania z cząsteczkami mRNA regulowanymi przez sRNA z klasy II. Z kolei wiązanie 3'ETS^leuZ do strony dystalnej białka Hfq, przypomina mechanizm oddziaływania z Hfq mRNA regulowanych przez sRNA z klasy I. 3'ETS^leuZ wiąże się także ze stroną proksymalną Hfq, jednak z mniejszym powinowactwem niż ze stroną dystalną. Analiza oddziaływania AgvB i GcvB z białkiem Hfq wskazuje, że anty-sRNA AgvB wykazuje wysokie powinowactwo do powierzchni dystalnej i proksymalnej, podobnie jak sRNA z klasy II. Z kolei sRNA GcvB zachowuje się w sposób zbliżony do sRNA z klasy I oddziałując ze stroną boczną oraz proksymalną białka Hfq. Jednak wiązanie strony

proksymalnej jest mniej wydajne niż dla typowych sRNA z klasy I, przez co oddziaływanie GcvB z Hfq może być podobne do wiązania przez Hfq mRNA regulowanych przez sRNA z klasy II.

8.2.4 Białko opiekuńcze Hfq uczestniczy w oddziaływaniach sRNA