CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 1. Materiały i metody

4.1.1. Badane materiały

Do badań użyto pochodne kwasu chlorofenoksyoctowego: kwas

2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) i kwas 4-chloro-2-metylofenoksyoctowy (MCPA). Poddane badaniom kwasy chlorofenoksyoctowe były produktami technicznymi.

Techniczny 2,4-D zawierał 98% 2,4-D. Natomiast techniczny MCPA zawierał 97 % MCPA.

4.1.2. Zwierzęta doświadczalne

W badaniach każdego związku użyto 160 szczurów (80 samców i 80 samic) o symbolu Imp: WIST (stado outbred), pochodzących z hodowli Instytutu Medycyny Pracy w Łodzi, utrzymanej w typie konwencjonalnym. Stan zdrowia zwierząt został potwierdzony w formie sprawozdania z badań bakteriologicznych, mikologicznych i parazytologicznych wykonanych w Zakładzie Higieny Weterynaryjnej w Wojewódzkim Inspektoracie Weterynarii w Łodzi. Przed rozpoczęciem doświadczenia wszystkie zwierzęta przeszły tygodniowy okres kwarantanny, z zachowaniem tych samych warunków jak w okresie całego doświadczenia. W dniu przyjęcia zwierząt do kwarantanny wykonano ogólne badania lekarsko-weterynaryjne, a przed wprowadzeniem do doświadczenia u zwierząt przeprowadzono szczegółowe badania lekarsko-weterynaryjne. Do doświadczenia wprowadzono zwierzęta niewykazujące żadnych objawów chorobowych. Szczury były indywidualnie oznakowane. Do poszczególnych grup zwierzęta dobierano w sposób losowy według płci i z uwzględnieniem masy ciała. Zwierzęta wprowadzono do doświadczenia w wieku od 6 do 8 tygodni. Średnia masa ciała zwierząt wprowadzonych do badania 2,4-D wynosiła 248,8g (samce, zakres masy ciała 217g - 281g) oraz 184,4g (samice, zakres masy ciała: 162g - 204g). Średnia masa ciała zwierząt wprowadzonych do badania MCPA wynosiła 165,6g (samce, zakres masy ciała: 129g - 185g) oraz 136,5g (samice, zakres masy ciała: 116g - 154g)

Masy ciała poszczególnych szczurów wprowadzanych do doświadczenia znajdowały się w zakresie ± 20% wartości średniej dla danego związku i płci.

Badania przeprowadzono w Zakładzie Badań Toksykologicznych Instytutu Przemysłu Organicznego, Oddział w Pszczynie.

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Katowicach (nr opinii 25/04 i 26/04).

4.1.3. Warunki przetrzymywania zwierząt

W okresie kwarantanny oraz doświadczenia zwierzęta przebywały w klimatyzowanych pomieszczeniach o następujących parametrach:

- temperatura powietrza 19°C - 24°C , średnio 22⁰C ± 20

C

- wilgotność względna powietrza 30% – 70 % , średnio 50%-60%

- warunki świetlne: oświetlenie sztuczne, jarzeniowe; cykl oświetlenia: 12 godzin jasno / 12 godzin ciemno.

Zwierzęta przetrzymywane były w plastikowych klatkach o wymiarach 58×37×21 cm (długość x szerokość x wysokość), z pokrywą z metalowych prętów, każda płeć oddzielnie, po 5 zwierząt w klatce. Jako ściółki używano odpylonych wiórów drzewnych, naświetlonych promieniami UV, które wymieniano dwa razy w tygodniu. Każda klatka wyposażona była w zawieszkę zawierającą informacje na temat: stężenia badanej substancji w paszy, daty założenia i planowanej likwidacji doświadczenia, płci oraz numeracji zwierząt.

4.1.4. Stosowane stężenia i liczba zwierząt w doświadczeniach

Stosowane w doświadczeniach stężenia związków w paszy zostały ustalone na podstawie przeprowadzonych wcześniej badań własnych toksyczności przy powtarzanym 28 -- dniowym podawaniu doustnym (range finding test) (Przybyła i wsp., 2003, praca niepublikowana; Kita i wsp., 2000, praca niepublikowana), jak również danych z piśmiennictwa (Mattsson i wsp., 1997; Charles i wsp., 1996a; Charles i wsp., 1996b; Hayes

Tabela 3. Stężenia 2,4-D w paszy i liczba zwierzątużytych w badaniu. grupa stężenie 2,4-D w paszy [ppm] liczba zwierząt samce samice 0 0 20 20 1 150 20 20 2 600 20 20 3 2400 20 20

Tabela 4. Stężenia MCPA w paszy i liczba zwierząt użytych w badaniu.

grupa stężenie MCPA w paszy [ppm] liczba zwierząt samce samice 0 0 20 20 1 200 20 20 2 700 20 20 3 2450 20 20 4.1.5. Pasza i woda

W trakcie badań szczurom pozostawiono swobodny dostęp do paszy oraz wody. Zwierzęta karmiono standardową paszą "GLM" produkowaną przez firmę GAN – RAT w Krakowie oraz pojono wodą wodociągową.

W trakcie doświadczenia zwierzętom grup narażanych podawano paszę z dodatkiem 2,4-D lub MCPA, natomiast zwierzęta grup kontrolnych otrzymywały tą samą paszę, lecz bez dodatku badanych substancji.

W celu przygotowania paszy z dodatkiem 2,4-D, do 10 kg sypkiej paszy dodawano odpowiednio 1,5 g; 6,0 g oraz 24,0 g 2,4-D w postaci zawiesiny wodnej, uzyskując w ten sposób stężenia 150 ppm, 600 ppm oraz 2400 ppm 2,4-D w paszy. Paszę dokładnie mieszano, a następnie granulowano i suszono w temperaturze 20-24°C przez ok. 20 godzin.

2,0 g, 7,0 g oraz 24,5 g, badanej substancji wcześniej zmielonej w młynku elektrycznym. Paszę dokładnie mieszano, a następnie granulowano i suszono w temperaturze 20-24°C przez ok. 20 godzin.

Przed rozpoczęciem doświadczenia sprawdzano metodą chromatografii cieczowej z detektorem UV-VIS, stężenia i trwałość 2,4-D oraz MCPA w sporządzonej paszy. Ponieważ deklarowane stężenia 2,4-D i MCPA w paszy po 21 dniach nie uległy istotnym zmianom, każdą przygotowaną partię paszy z dodatkiem 2,4-D lub MCPA podawano zwierzętom maksymalnie do trzech tygodni od daty jej sporządzenia.

Paszę z dodatkiem 2,4-D lub MCPA podawano szczurom codziennie przez siedem dni w tygodniu, w ciągu 13 tygodni.

4.2. Przebieg doświadczenia 4.2.1. Badania kliniczne 4.2.1.1. Obserwacje kliniczne

Ogólne obserwacje kliniczne były przeprowadzane każdego dnia doświadczenia o tej samej porze. W trakcie obserwacji zwierzęta oceniano pod kątem stanu zdrowia i śmiertelności.

Szczegółowe obserwacje kliniczne wszystkich zwierząt wykonywane były przed rozpoczęciem doświadczenia, a następnie pod koniec drugiego, szóstego, dziesiątego oraz trzynastego tygodnia narażania. Obserwacje obejmowały ocenę ogólnego zachowania się zwierząt w klatce oraz poza klatką podczas trzymania w ręce. Zwierzęta oceniano pod kątem zmian na skórze, w sierści, w oczach, błonach śluzowych. Odnotowywano pojawianie się wydzielin i wydalin oraz czynności autonomicznych (np. łzawienie, stroszenie sierści, nieprawidłowy sposób oddychania), zmiany w sposobie chodzenia, zmiany w postawie ciała, zmiany w reakcji na chwytanie, zmiany w aktywności ruchowej, obecność ruchów mimowolnych klonicznych lub tonicznych. Rejestrowano wszystkie przypadki ruchów stereotypowych (nadmierne czyszczenie się, ciągłe krążenie) oraz innych nietypowych

4.2.1.2. Masa ciała

Przed rozpoczęciem doświadczenia (dzień 0), a następnie raz w tygodniu przez cały okres doświadczenia wszystkie zwierzęta ważono kontrolując ich przyrost masy ciała.

4.2.1.3. Spożycie paszy

Spożycie paszy przez zwierzęta sprawdzano raz w tygodniu przez cały okres doświadczenia. Pomiaru spożycia paszy dokonywano dla wszystkich zwierząt w klatce, a następnie wyliczano średnie spożycie paszy dla jednego szczura w klatce.

4.2.2. Badania zachowania się zwierząt

Badania zachowania się zwierząt wykonywano u 10 samców i 10 samic z każdej grupy w pięciu punktach czasowych tj. przed pierwszym narażeniem (pomiar 1), pod koniec drugiego tygodnia narażania (pomiar 2), pod koniec szóstego tygodnia narażania (pomiar 3), pod koniec dziesiątego tygodnia narażania (pomiar 4) oraz pod koniec trzynastego tygodnia narażania (pomiar 5).

Badania obejmowały: obserwacje zwierząt w otwartym polu, ocenę reakcji czuciowo – ruchowych na bodźce, pomiar siły chwytności kończyn przednich i tylnych oraz pomiar aktywności ruchowej.

4.2.2.1. Obserwacja zwierząt w otwartym polu

W celu przeprowadzenia obserwacji zwierząt w otwartym polu, każde ze zwierząt indywidualnie umieszczano w klatce o wymiarach 48 x 48 x 45cm i oceniano zachowanie przez 3 minuty. W trakcie prowadzenia obserwacji notowano brak lub wystąpienie oraz rodzaj ruchu mimowolnego klonicznego i tonicznego, oceniano sposób chodzenia zwierząt i stopień ich rozbudzenia, a także opisywano nietypowe zachowania zwierząt, jeżeli takie wystąpiły. Jednocześnie prowadzono pomiar aktywności ruchowej poziomej wyrażonej w przebytej drodze oraz pomiar aktywności ruchowej pionowej wyrażonej liczbą wzniesień. Pomiaru aktywności ruchowej dokonano przy użyciu aparatu TSE ActiMot for rats (rycina 2). Do detekcji ruchu badanego zwierzęcia zostało wykorzystane promieniowanie świetlne (niewidzialne dla zwierząt). Ruch poziomy zwierzęcia określano dzięki czujnikom promieniowania umieszczonym w płaszczyźnie X i Y w liczbie 16 x 16. Odległość między

czujników umieszczonych na wysokości 130 mm. Po zakończeniu obserwacji zliczano bolusy kału oraz kałuże moczu (NBRP Rat Kyoto: Rat Strain Phenotype Site, 2003).

Wyniki obserwacji notowano przy użyciu klasyfikacji zamieszczonej w załączniku 2.