Czas podwojenia populacji komórek prostaty rosnących na szkle

Tempo podziału komórkowego jest istotnym parametrem w kontekście badań nad nowotworami. Wyznaczenie czasu podwojenia populacji komórek linii PZ-HPV-7, Du145 i PC-3 było możliwe dzięki rejestracji obrazów fluorescencyjnych jąder komórkowych w czterech punktach czasowych: po 24 h, 48 h, 72 h i 96 h od rozpoczęcia hodowli. Zliczanie komórek odbywało się manualnie. Średnia liczba komórek została odłożona na osi rzędnych w funkcji czasu trwania hodowli komórkowej. Dopasowanie funkcji eksponencjalnej opisanej w paragrafie 3.2.6 umożliwiło wyznaczenie czasu podwojenia populacji.

Rysunek 10. Wyznaczenie czasu podwojenia populacji komórek na podstawie zdjęć fluorescencyjnych rejestrowanych w czterech kolejnych punktach czasowych. (A) Dopasowanie równania (6) do wyznaczonej eksperymentalnie średniej liczby komórek. (B) Czas podwojenia dla komórek linii prawidłowej PZ-HPV-7 jest najdłuższy i wynosi 46.7 ± 3.9 [h], krótszy dla komórek Du145 29.8 ± 2.6 [h], i najkrótszy dla komórek PC-3 25.5 ± 2.5 [h]. Analiza wykazała istotną statystycznie różnicę (***P < 0.001) pomiędzy czasem podwojenia populacji komórek linii prawidłowej, a liniami nowotworowymi oraz brak istotnej statystycznie różnicy (bs) pomiędzy linią komórek PC-3, a linią Du14510.

Zgodnie z tendencją obserwowaną powszechnie w literaturze, czas podwojenia komórek pochodzących z wtórnych ognisk nowotworowych jest krótszy niż dla komórek prawidłowych. Czas podwojenia populacji komórek linii Du145 i PC-3 jest w granicy błędu

82

eksperymentalnego nierozróżnialny i wynosi odpowiednio 29.8 ± 2.6 i 25.5 ± 2.5. Komórki prawidłowe PZ-HPV-7 potrzebują 46.7 ± 3.9 h na podwojenie swojej liczby w populacji (Rys. 10).

3.4 Wnioski

W niniejszym rozdziale przedstawiona została charakterystyka własności mechanicznych trzech linii komórkowych, stanowiących układ modelowy do badań raka prostaty – referencyjna linia PZ-HPV-7, pochodząca z przerzutu raka prostaty do mózgu Du145 oraz wywodząca się z przerzutu do kości PC-3. We wszystkich zaprezentowanych eksperymentach hodowle komórkowe prowadzone były w sposób konwencjonalny z użyciem szkiełek nakrywkowych jako substratów hodowlanych. Populacja komórek linii PZ-HPV-7 cechuje się jednorodną morfologią, najwolniejszym wzrostem oraz najwyższą wartością modułu Younga. Zarówno obrazy fluorescencyjne jak i pomiary wykonane przy użyciu mikroskopu sił atomowych potwierdzają wysoki stopień organizacji cytoszkieletu aktynowego tej linii w porównaniu z liniami raka prostaty posiadającymi zdolność do metastazy.

Otrzymane wyniki można podsumować następująco:

i. Stwierdzono, że komórki linii PZ-HPV-7 charakteryzują się największym polem powierzchni w porównaniu z komórkami linii Du145 oraz PC-3. Zmniejszenie pola powierzchni komórek rakowych jest obserwowane również w innych typach nowotworów.

ii. Przebadane linie wykazują kształt zbliżony do komórek pochodzenia nabłonkowego, ale dla komórek rakowych widoczne są preferencje, wynikające z kierunku metastazy – komórki linii Du145 są bardziej sferyczne, a komórki linii PC-3 bardziej wydłużone. iii. W oparciu o analizę kształtu komórek stwierdzono, że największa niejednorodność

populacji występuje dla komórek linii PC-3 o najwyższym stopniu agresji.

iv. Analiza własności mechanicznych komórek prostaty potwierdza obserwowane wcześniej relacje w ich elastyczności, tj. EPZ-HPV-7 < EPC-3 < EDu145. Efekt ten utrzymuje się w kolejnych dniach trwania hodowli komórkowej.

v. Przeprowadzenie pomiarów elastyczności w funkcji głębokości ugięcia cytoszkieletu aktynowego pozwoliło na uzyskanie informacji na temat jego niejednorodności w kolejnych warstwach poniżej błony komórkowej. Wyznaczony parametr R pokazuje, że cytoszkielet komórek prawidłowych PZ-HPV-7 cechuje większa przestrzenna

83

jednorodność niż komórek pochodzących z przerzutów raka prostaty do mózgu (Du145) i kości (PC-3).

vi. Tempo podziału komórek jest charakterystyczne dla każdej z badanych linii komórkowych, przy czym komórki rakowe dzielą się znacznie szybciej niż komórki prawidłowe.

3.5 Literatura.

[1] S. Stokłosa, Hodowla komórek i tkanek. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2011.

[2] C. M. Perou, T. Sørlie, M. B. Eisen, M. van de Rijn, S. S. Jeffrey, C. A. Rees, J. R. Pollack, D. T. Ross, H. Johnsen, L. A. Akslen, O. Fluge, A. Pergamenschikov, C. Williams, S. X. Zhu, P. E. Lønning, A. L. Børresen-Dale, P. O. Brown, and D. Botstein, “Molecular portraits of human breast tumours.,” Nature, vol. 406, no. 6797, pp. 747–52, Aug. 2000.

[3] C. R. Leemans, B. J. M. Braakhuis, and R. H. Brakenhoff, “The molecular biology of head and neck cancer.,” Nat. Rev. Cancer, vol. 11, no. 1, pp. 9–22, Jan. 2011.

[4] S. A. Fuhrman, L. C. Lasky, and C. Limas, “Prognostic significance of morphologic parameters in renal cell carcinoma.,” Am. J. Surg. Pathol., vol. 6, no. 7, pp. 655–63, Oct. 1982.

[5] A. I. Baba and C. Câtoi, “Tumor Cell Morphology.” The Publishing House of the Romanian Academy, 2007.

[6] A. Ben-Ze’ev, “Animal cell shape changes and gene expression.,” Bioessays, vol. 13, no. 5, pp. 207–12, May 1991.

[7] R. Singhvi, A. Kumar, G. Lopez, G. Stephanopoulos, D. Wang, G. Whitesides, and D. Ingber, “Engineering cell shape and function,” Science (80-. )., vol. 264, no. 5159, pp. 696–698, Apr. 1994.

[8] R. McBeath, D. M. Pirone, C. M. Nelson, K. Bhadriraju, and C. S. Chen, “Cell Shape, Cytoskeletal Tension, and RhoA Regulate Stem Cell Lineage Commitment,” Dev. Cell, vol. 6, no. 4, pp. 483–495, Apr. 2004.

[9] C. S. Chen, “Geometric Control of Cell Life and Death,” Science (80-. )., vol. 276, no. 5317, pp. 1425–1428, May 1997.

[10] D. E. Ingber, “Fibronectin controls capillary endothelial cell growth by modulating cell shape.,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 87, no. 9, pp. 3579–3583, May 1990.

[11] N. Wang and D. E. Ingber, “Control of cytoskeletal mechanics by extracellular matrix, cell shape, and mechanical tension.,” Biophys. J., vol. 66, no. 6, pp. 2181–9, Jun. 1994.

84

[12] S. Huang and D. E. Ingber, “Shape-dependent control of cell growth, differentiation, and apoptosis: switching between attractors in cell regulatory networks.,” Exp. Cell Res., vol. 261, no. 1, pp. 91–103, Nov. 2000.

[13] J. Sims, S. Karp, and D. Ingber, “Altering the cellular mechanical force balance results in integrated changes in cell, cytoskeletal and nuclear shape,” J. Cell Sci., vol. 103, no. 4, pp. 1215–1222, Dec. 1992.

[14] T. D. Pollard and J. A. Cooper, “Actin, a central player in cell shape and movement.,” Science, vol. 326, no. 5957, pp. 1208–12, Nov. 2009.

[15] T. Stossel, “On the crawling of animal cells,” Science (80-. )., vol. 260, no. 5111, pp. 1086–1094, May 1993.

[16] D. A. Lauffenburger and A. F. Horwitz, “Cell Migration: A Physically Integrated Molecular Process,” Cell, vol. 84, no. 3, pp. 359–369, Feb. 1996.

[17] Y.-W. Heng and C.-G. Koh, “Actin cytoskeleton dynamics and the cell division cycle.,” Int. J. Biochem. Cell Biol., vol. 42, no. 10, pp. 1622–33, Oct. 2010.

[18] M. A. Jordan and L. Wilson, “Microtubules and actin filaments: dynamic targets for cancer chemotherapy,” Curr. Opin. Cell Biol., vol. 10, no. 1, pp. 123–130, Feb. 1998. [19] D. A. Fletcher and R. D. Mullins, “Cell mechanics and the cytoskeleton,” Nature, vol.

463, no. 7280, pp. 485–492, Jan. 2010.

[20] K. E. Kasza, A. C. Rowat, J. Liu, T. E. Angelini, C. P. Brangwynne, G. H. Koenderink, and D. A. Weitz, “The cell as a material.,” Curr. Opin. Cell Biol., vol. 19, no. 1, pp. 101– 7, Feb. 2007.

[21] S. Suresh, “Biomechanics and biophysics of cancer cells,” Acta Mater., vol. 55, no. 12, pp. 3989–4014, Jul. 2007.

[22] M. Lekka, P. Laidler, D. Gil, J. Lekki, Z. Stachura, and A. Z. Hrynkiewicz, “Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy,” Eur. Biophys. J., vol. 28, no. 4, pp. 312–316, May 1999.

[23] Q. S. Li, G. Y. H. Lee, C. N. Ong, and C. T. Lim, “AFM indentation study of breast cancer cells.,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 374, no. 4, pp. 609–13, Oct. 2008. [24] M. Lekka and P. Laidler, “Applicability of AFM in cancer detection.,” Nat.

Nanotechnol., vol. 4, no. 2, p. 72; author reply 72–3, Feb. 2009.

[25] M. M. Webber, S. T. Quader, H. K. Kleinman, D. Bello-DeOcampo, P. D. Storto, G. Bice, W. DeMendonca-Calaca, and D. E. Williams, “Human cell lines as an in vitro/in vivo model for prostate carcinogenesis and progression.,” Prostate, vol. 47, no. 1, pp. 1– 13, Apr. 2001.

[26] P. J. Russell and E. A. Kingsley, “Human prostate cancer cell lines.,” Methods Mol. Med., vol. 81, pp. 21–39, Jan. 2003.

85

[27] A. van Bokhoven, M. Varella-Garcia, C. Korch, W. U. Johannes, E. E. Smith, H. L. Miller, S. K. Nordeen, G. J. Miller, and M. S. Lucia, “Molecular characterization of human prostate carcinoma cell lines.,” Prostate, vol. 57, no. 3, pp. 205–25, Nov. 2003. [28] P. C. Weijerman, J. J. König, S. T. Wong, H. G. Niesters, and D. M. Peehl,

“Lipofection-mediated immortalization of human prostatic epithelial cells of normal and malignant origin using human papillomavirus type 18 DNA.,” Cancer Res., vol. 54, no. 21, pp. 5579–83, Nov. 1994.

[29] K. R. Stone, D. D. Mickey, H. Wunderli, G. H. Mickey, and D. F. Paulson, “Isolation of a human prostate carcinoma cell line (DU 145).,” Int. J. Cancer, vol. 21, no. 3, pp. 274– 81, Mar. 1978.

[30] M. E. Kaighn, K. S. Narayan, Y. Ohnuki, J. F. Lechner, and L. W. Jones, “Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).,” Invest. Urol., vol. 17, no. 1, pp. 16–23, Jul. 1979.

[31] L. Liu, B. Sun, J. N. Pedersen, K.-M. Aw Yong, R. H. Getzenberg, H. A. Stone, and R. H. Austin, “Probing the invasiveness of prostate cancer cells in a 3D microfabricated landscape.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 108, no. 17, pp. 6853–6, Apr. 2011. [32] “Microscopy Resource Center.” [Online]. Available:

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorhome.html.

[33] J. H. Lee and K. J. McLeod, “Morphologic responses of osteoblast-like cells in monolayer culture to ELF electromagnetic fields.,” Bioelectromagnetics, vol. 21, no. 2, pp. 129–36, Feb. 2000.

[34] H. Yu, K. P. Lim, S. Xiong, L. P. Tan, and W. Shim, “Functional morphometric analysis in cellular behaviors: shape and size matter.,” Adv. Healthc. Mater., vol. 2, no. 9, pp. 1188–97, Sep. 2013.

[35] D. Maret, E. Gruzglin, M. S. Sadr, V. Siu, W. Shan, A. W. Koch, N. G. Seidah, R. F. Del Maestro, and D. R. Colman, “Surface expression of precursor N-cadherin promotes tumor cell invasion.,” Neoplasia, vol. 12, no. 12, pp. 1066–80, Dec. 2010.

[36] R. McBeath, D. M. Pirone, C. M. Nelson, K. Bhadriraju, and C. S. Chen, “Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment,” Dev. Cell, vol. 6, pp. 483–495, 2004.

[37] M. J. Paszek, N. Zahir, K. R. Johnson, J. N. Lakins, G. I. Rozenberg, A. Gefen, C. A. Reinhart-King, S. S. Margulies, M. Dembo, D. Boettiger, D. A. Hammer, and V. M. Weaver, “Tensional homeostasis and the malignant phenotype.,” Cancer Cell, vol. 8, no. 3, pp. 241–54, Sep. 2005.

[38] J. Gostek, S. Prauzner-Bechcicki, B. Nimmervoll, K. Mayr, J. Pabijan, P. Hinterdorfer, L. A. Chtcheglova, and M. Lekka, “Nano-characterization of two closely related melanoma cell lines with different metastatic potential.,” Eur. Biophys. J., vol. 44, no. 1–2, pp. 49–55, Feb. 2015.

86

[39] A. Hunter, C. W. Archer, P. S. Walker, and G. W. Blunn, “Attachment and proliferation of osteoblasts and fibroblasts on biomaterials for orthopaedic use,” Biomaterials, vol. 16, no. 4, pp. 287–295, Mar. 1995.

[40] E. C. Faria, N. Ma, E. Gazi, P. Gardner, M. Brown, N. W. Clarke, and R. D. Snook, “Measurement of elastic properties of prostate cancer cells using AFM.,” Analyst, vol. 133, no. 11, pp. 1498–500, Nov. 2008.

[41] M. Lekka, K. Pogoda, J. Gostek, O. Klymenko, S. Prauzner-Bechcicki, J. Wiltowska-Zuber, J. Jaczewska, J. Lekki, and Z. Stachura, “Cancer cell recognition - Mechanical phenotype,” Micron, vol. 43, no. 12, pp. 1259–1266, 2012.

[42] D. Docheva, D. Padula, M. Schieker, and H. Clausen-Schaumann, “Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells.,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 402, no. 2, pp. 361–6, Nov. 2010. [43] N. Wang, K. Naruse, D. Stamenović, J. J. Fredberg, S. M. Mijailovich, I. M.

Tolić-Nørrelykke, T. Polte, R. Mannix, and D. E. Ingber, “Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 98, no. 14, pp. 7765–70, Jul. 2001.

[44] C. Rotsch and M. Radmacher, “Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.,” Biophys. J., vol. 78, no. 1, pp. 520–35, Jan. 2000.

[45] K. Pogoda, J. Jaczewska, J. Wiltowska-Zuber, O. Klymenko, K. Zuber, M. Fornal, and M. Lekka, “Depth-sensing analysis of cytoskeleton organization based on AFM data,” Eur. Biophys. J., vol. 41, pp. 79–87, 2012.

[46] J. R. Ramos, J. Pabijan, R. Garcia, and M. Lekka, “The softening of human bladder cancer cells happens at an early stage of the malignancy process.,” Beilstein J. Nanotechnol., vol. 5, no. 1, pp. 447–57, Jan. 2014.

87

Rozdział 4 – Elastyczność komórek prostaty rosnących na podłożach