Ogólnych zasad doboru rodzaju immobilizacji do enzymu/procesu, mogących ułatwić i zawęzić zakres planowanych eksperymentówjest niewiele. Poniżej zebrano kilka podstawowych wskazań:
- enzymy oligomeryczne. W zdecydowanej większości przypadków dysocja-
cja enzymu do podjednostek jest jednoznaczna z częściową lub całkowitą utratą ak tywności, stąd efektywne są metody sieciowania enzymów oraz zamykanie w sieci żelu, wiclopunktowc związanie z powierzchniąnośnika lub sieciowanie już związane go enzymu [33, 38, 95, 247, 331];
728 J BRYJAK
- systemy wieloenzymatyczne. W tych pr2ypadkach preferuje się zamykanie enzymów w hydrożelach i mikro(makro)kapsułkach oraz otoczkowanic [34,98,143]. Raczej stosuje siękoimmobilizację niż immobilizacjęna różnych nośnikach;
- substrat lub produkt polimeryczny albo lepki. Taki układ reakcyjny wyklucza możliwość stosowania preparatów żelowych [34, 98, 332]. W przypadku reakcji z substratem polimerycznym zaleca się w wiązaniu kowalencyjnym stosowanie „ramion przestrzennych” oraz wiązanie nie więcej niż jednej monowarstwy białka (około 1 g/m2 [71]) lub wiązanie z polimerem odwracalnie rozpuszczalnym/nieroz puszczalnym w wodzie [34, 71, 300];
- substrat i produkt słabo rozpuszczalne. W tych przypadkach preparaty (noś niki) nie mogą być porowate, gdyż może dojść do krystalizacji reagentów w porach [332];
- analityka medyczna. Mała powierzchnia wiązania białka w biosensorach oraz konieczność stabilizacji powodują, że preferowane są metody wiązania kowalencyj nego i biospecyficznego [230,238,333-336]. Immobilizując enzym z myślą o anali zach wykonywanych przez pacjentów, preferuje się zamykanie enzymów w polime rach żelowych, nanoszonych na bibułę filtracyjną [34];
- przemysł farmaceutyczny faworyzuje preparaty umożliwiające trwałe zwią zanie białka: związane kowalencyjne, sieciowane kryształy oraz zamknięte w sicci żelu z następczym sieciowaniem [102, 332];
- lipazy. Dobrze tolerują kontakt z matrycami hydrofobowymi, a w środowi sku wodnym często wykazują hiperaktywację, spowodowaną tworzeniem przez noś nik granicy faz, aktywującej enzym [168, 179];
- niska szybkość reakcji. Należy stosować w immobilizacji enzymy oczysz czone lub sieciowane, a reaktor ze złożem upakowanym jest zalecanym rozwiąza niem aparaturowym [300, 311, 315, 316];
- wartość stałej Km po immobilizacji jest o rząd większa od wartości dla enzy mu natywnego. Wykazanie znaczącej roli ograniczeń dyfuzyjnych wymusza koniecz ność ich minimalizacji przez zastosowanie preparatów nieporowatych [86,260,337] lub o uporządkowanej strukturze wewnętrznej z przenikającą się siecią połączeń [325], lub nośników szerokoporowatych o średnicy porów > 30 nm przy średnicy ziaren nieprzekraczającej 100 /im [71, 300, 302];
- reakcje w środowisku niewodnym. W rozpuszczalnikach organicznych (< 1% wody) szybkość reakcji jest o 2-6 rzędów mniejsza, niż w wodzie [28, 179, 307, 325], dlatego preparat enzymatyczny musi posiadać wysoką aktywność, co osiąga się stosując kryształy, sieciowane kryształy i depozycję na nośniku. Nośnik powinien być amfifilowy, niepęcznięjący w rozpuszczalniku i o niskiej pojemności wodnej, aby nie odwodnił enzymu [71, 109]. Enzymy stabilne modyfikuje się lub okluduje celem zwiększenia rozpuszczalności biokatalizatora;
- reakcje w obecności kosolwentu mieszającego się z wodą. Do 20% zawarto ści rozpuszczalnika w wodzie stosuje się preparaty tak jak w środowisku wodnym. Wzrost stężenia kosolwentu przyspiesza inaktywację i niezbędna jest stabilizacja
otocz-IMMOBILIZACJA ENZYMÓW. CZĘŚĆ 1 729 kowaniem, wiązaniem z polimerami rozpuszczalnymi w wodzie, kowalencyjnym wiązaniem z nośnikami czy stosowanie sieciowanych kryształów [34,109,179,269, 338,339];
- reakcje w obecności kosolwentu niemieszającego się z wodą. Jeżeli enzy mem jest lipaza, to może być bezpośrednio stosowana w układach emulsyjnych lub poddana uprzedniej immobilizacji/solubilizacji [28,103,107,139,147]. Inne enzymy powinny być poddane uprzedniej stabilizacji/immobilizacji [106,155,157];
— dopasowanie preparatu do istniejącego rozwiązania aparaturowego. W prze myśle dominują trzy główne typy reaktorów (mieszalnikowy, kolumnowy, fluidyza cyjny (Rys. 13)) i o wdrożeniu nowej lub zmianie istniejącej technologii może decy dować możliwość wykorzystania posiadanego parku maszynowego.
SJL eto O O
P i T
s t
f Rysunek 13. Typy reaktorów dla immobilizowanych enzymów: mieszalnikowy reaktor okresowy (a)
i przepływowy (b); reaktor kolumnowy ze złożem upakowanym zasilany od gory (c), od dołu (d) i z recyrkulacja (c), reaktor fluidyzacyjny (f); S - substrat; P - produkt
O wyborze typu reaktora w większym stopniu decydują właściwości mecha
niczne preparatu enzymatycznego oraz rodzaj substratu i produktu niż aktywność preparatu. W przypadku stosowania preparatów nierozpuszczalnych w wodzie/roz puszczalnikach organicznych najczęstszym rozwiązaniem aparaturowym jest reaktor kolumnowy ze złożem upakowanym (Rys. 13 c-e), posiadający najwyższą aktyw ność w przeliczeniu na objętość reaktora oraz charakteryzujący się niskim kosztem inwestycyjnym, łatwością konstrukcyjną, operacyjną i przenoszenia skali oraz ni skim kosztem robocizny [34, 245, 267, 332, 335], To rozwiązanie jest zalecane dla procesów z niestabilnym substratem i/lub produktem (penicyliny, chloroketony, chlo- roalkohole), w których niezbędna jest precyzyjna regulacja czasu przebywania re agentów w reaktorze. Jest to również układ korzystny dla reakcji hamowanych przez produkt. Natomiast nie nadaje się do reakcji z lepkim substratem lub słabo rozpusz czalnym substratem/produktem oraz w sytuacjach, gdy reakcji towarzyszy zmiana wartości pH. Jeżeli w procesie niezbędny jest duży przepływ reagentów przez złoże (opory dyfuzyjne), można zastosować układ z recyrkulacją. Reaktor kolumnowy ze złożem upakowanym może być zasilany od góry, ale wówczas nośnik musi być
730 J. BRYJAK.
odporny na kompresję złoża i zgniatanie oraz nie może być stosowany w reakcjach z uwalnianiem gazu. Z kolei reaktory zasilane od dołu powinny zawierać złoże o gęs tości znacznie większej niż gęstość mieszaniny reakcyjnej, celem ograniczenia wypłukiwania złoża. Zalecany rozmiar nośników zawiera się od 150 do 300 /urn.
Reaktor mieszalnikowy okresowy lub przepływowy (Rys. 13 a, b) wymaga sto sowania nośników elastycznych, o niskiej podatności na kruszenie i ścieranie [16,34,71,245,302]. Jest zalecany do reakcji z lepkim substratem i/lub konieczno ścią utrzymania stałej wartości pH oraz przy dużych ziarnach nośnika (> 200 /im). Objętość preparatu nie powinna przekraczać 10% objętości reaktora.
Reaktor fluidyzacyjny (Rys. 13 f), charakteryzujący się mieszaniem roztworu cieczą, nie wymaga stosowania nośników odpornych mechanicznie [34, 245], Gęs tość preparatu powinna być zbliżona do gęstości roztworu reakcyjnego, a ten typ reaktora jest zalecany do reakcji z lepkim lub trudno rozpuszczalnym substratem albo, gdy substrat lub produkt jest gazem. Objętość preparatu immobilizowanego nie powinna przekraczać 6% objętości reaktora.