DYSKUSJA - Zastosowanie metody real-time PCR oraz kompetycyjnego testu ELISA do określania pote

Badania nad tempem wzrostu lina trwają od wielu lat, ale do dziś nie udało się ani stworzyć nowej linii hodowlanej, ani odtworzyć historycznej, która w pierwszej połowie XX wieku istniała w miejscowości Quolsdorf położonej w Saksonii (Milkau 1921, Müller 1961). Pokładano wielkie nadzieje w badaniach nad jakością i ilością paszy skarmianej linom w różnych stadiach rozwojowych, ale i to nie przynosiło oczekiwanych rezultatów a dodatkowo wywoływało deformacje w ich szkielecie (Wolnicki i in. 2003). Problem wolnego tempa wzrostu lina był także badany w Turcji, Chinach i Czechach. Jak dotąd jedynym rezultatem tych badań jest stwierdzenie, że hodowla tej ryby jest nieopłacalna (Altındağ i in. 1998, Gela i in. 2006, Wang i in.

2006b). W Czechach prowadzono także badania związane z manipulacjami w składzie chromosomowym, lecz pomimo zwiększonego tempa wzrostu osobniki poliploidalne nie były w stanie prawidłowo się rozwijać (Flajshans i in. 2004).

Dlatego przeprowadzone badania poza opracowaniem metodyki badawczej skupiły się na sprawdzeniu, czy występuje zależność między temperaturą wody a aktywnością genu hormonu wzrostu oraz stężeniem produktu białkowego GH w zależności od płci lina. Badania real-time PCR potwierdziły, że mRNA genu hormonu wzrostu lina transkrybowany jest głównie w przysadce mózgowej (Reinecke i in. 2005), gdyż oznaczono go tam dla 23 z 24 badanych osobników. Otrzymane wyniki zostały następnie przeanalizowane pod kątem fenomenu SSD (ang. sexual size dimorphism), polegającym na zróżnicowaniu tempa wzrostu osobników danego gatunku w powiązaniu z ich płcią. Bazując na otrzymanych wynikach dla badanych osobników lina nie potwierdzono powszechnie znanego fenomenu szybszego tempa wzrostu samic lina (Nordquist 1927, Walter 1927, Kennedy i Fitzmaurice 1970).

Możliwe, że na postać otrzymanych wyników wpływ mogło mieć oddziaływanie ze strony układu doświadczalnego. Dowodów weryfikujących powyższą myśl dostarczają rezultaty badań nad karpiem oraz okoniem żółtym (Perca flavescens). Ryby w tych badaniach pozyskano ze środowiska naturalnego, bezpośrednio po czym pobrano z nich próby i przeprowadzono analizy za pomocą reakcji real-time PCR. Na podstawie otrzymanych wartości Ct dla mRNA gh stwierdzono, że u tych gatunków istnieje wyraźna zależność między płcią osobnika a charakterystycznym tempem wzrostu. Samice obu gatunków zawsze charakteryzowały się niższymi wartościami Ct dla mRNA gh niż samce, co oznaczało, że aktywność genu hormonu wzrostu u szybciej

rosnących samic była na wyższym poziomie niż u samców (Devlin i Nagahama 2002, Lynn i in. 2009). Takiej zależności nie stwierdzono u badanych ryb. Nawet uśrednione wartości Ct dla samców lina okazały się nieznacznie niższe niż dla samic (średnio 1,32).

Wyższe tempo wzrostu stwierdzono także u samic gatunków ryb łososiowatych, gdzie między zdefiniowanymi regionami chromosomów a determinacją płci, dojrzewaniem oraz hormonami zaangażowanymi w steroidogenezę, istniała silna współzależność (Haidle i in. 2008). Natomiast przykładem gatunku, gdzie samce charakteryzują się szybszym wzrostem niż samice, jest tilapia nilowa. Wykorzystywane jest to w masowej produkcji, gdzie samicom podaje się androgeny maskulinizujące je w pełni funkcjonalne samce (Mair i in. 1997).

Analizując uzyskane wartości Ct dla mRNA gh pod kątem poszczególnych wariantów temperaturowych zauważyć można pewną prawidłowość. Pięć z sześciu ryb przetrzymywanych w akwarium, gdzie woda miała temperaturę 15 °C, stanowiło połowę pierwszych dziesięciu wyników uszeregowanych od najmniejszej wartości Ct.

Oznacza to, że między temperaturą, w jakiej przetrzymywane były ryby, a aktywnością ich genu hormonu wzrostu, istnieje zależność, która wskazuje, że aktywność badanego genu w przysadce mózgowej linów jest największa w stosunkowo niskiej temperaturze wody. Możliwym jest, że stan ten jest skorelowany z początkiem syntezy oraz sekrecją gonadotropin, które stymulują komórki somatotropowe do produkcji hormonu wzrostu niezależnie od fotoperiodu a zależnie od temperatury. Gdy woda osiągnie minimum 10 °C komórki gonadotropowe lina ulegają aktywacji i w miarę wzrostu temperatury produkują więcej gonadotropin. W momencie, gdy woda osiągnie temperaturę 20 °C ich aktywność stopniowo obniża się, czego następstwem jest spadek stężenia produkowanych hormonów, które stymulują syntezę genu gh w przysadce (Breton i in.

1980a, Breton i in. 1980b, Horoszewicz i in. 1981). Niemniej jednak, niezależnie od drogi, jaką stymulowane są komórki somatotropowe, otrzymane wyniki dowodzą, że transkrypcja mRNA gh lina zachodziła w sposób najbardziej efektywny w temperaturze oscylującej wokół 15 °C. Podobne relacje stwierdzono także u innych gatunków ryb.

Przykładem mogą tu być badania nad karasiem pospolitym oraz doradą (Sparus aurata). Synteza i sekrecja hormonu wzrostu zachodziła u tych gatunków najintensywniej od marca do połowy maja, gdy pora dnia wydłużała się, a temperatura wody mieściła się w granicach między 15 a 20 °C. W innych badaniach nad karpiem, Figueroa wraz z zespołem (1995) dowiódł, że temperatura ma istotny wpływ na poziom ekspresji genu hormonu wzrostu. Ponadto na podstawie analiz ekspresji innych genów

(prolaktyny, proopiomelanokortyny, czynnika transkrypcyjnego Pit-1) wykazano, że podlegają one bezpośrednio wpływom ze strony czynnika temperaturowego i są najwyższe w okresie wiosenno-letnim (Figueroa i in. 1994, Arends i in. 1998, Kausel i in. 1999).

Doświadczenie przeprowadzone w ramach niniejszej pracy trwało łącznie 8 dni, podczas których ryby nie były karmione. Składniki pokarmowe ze względu na swój ogromny wpływ na oś somatotropową mogłyby utrudnić bądź nawet uniemożliwić prawidłową interpretację wpływu temperatury na poziom ekspresji genu gh badanych linów ponieważ po zaprzestaniu karmienia stężenie hormonu wzrostu w plazmie krwi rośnie bądź maleje w zależności od gatunku (Duan 1998). Jednakże analizując wyniki innych badań prowadzonych w tym kierunku stwierdzono, że wzrost ten następuje przykładowo po dwóch tygodniach u tilapii mozambijskiej (Oreochromis mossambicus), między dwoma a trzema tygodniami u pstrąga tęczowego, po trzech tygodniach u baramundi (Lates calcarifer), między dwoma a czteroma tygodniami u suma kanałowego (Ictalurus punctatus) oraz między trzema a czteroma tygodniami u kiżucza (Oncorhynchus kisutch) (Duan i Plisetskaya 1993, Kakizawa i in. 1995, Matthews i in. 1997, Uchida i in. 2003, Small i Peterson 2005). Inne badania nad pstrągiem tęczowym wskazują na brak wpływu składników pokarmowych na efekt, jaki wywiera temperatura względem stężenia GH w plazmie krwi (Gabillard i in. 2003).

Dlatego też z pewną ostrożnością można założyć, że ośmiodniowa głodówka ryb nie miała wpływu na uzyskane wyniki Ct dla mRNA gh lina. Ponadto można się pokusić o wniosek, że produkcja GH u osobników doświadczalnych przetrzymywanych w ciemnościach podlegała kontroli głównie ze strony czynnika temperaturowego i była zależna od płci. Ze względu na zachowania linów w środowisku naturalnym (preferencja obszarów zacienionych) interesującym jest, czy istnieje możliwość, aby synteza przysadkowego GH linów podlegała w dużej mierze regulacji ze strony czynnika temperaturowego? Odpowiedzi na to pytanie mogą udzielić w przyszłości badania prowadzone na osobnikach pochodzących ze środowiska naturalnego.

Podsumowując tą część rozważań sam wpływ temperatury na aktywność genu hormonu wzrostu w przysadce mózgowej lina jest bezsporny. Natomiast dalszych badań wymaga określenie dokładnej charakterystyki tej zależności.

Przysadka mózgowa uważana jest za główne miejsce, w którym syntetyzowany jest hormon wzrostu. Jednak liczne badania wskazują, że jest on także produkowany w limfocytach T oraz B, szyszynce, mózgu, mięśniu sercowym, nerce głowowej,

jajnikach, jądrach, wyrostkach pylorycznych oraz wątrobie. Powyższe miejsca produkcji mRNA gh zostały zlokalizowane podczas prac nad pstrągiem tęczowym oraz doradą, przy użyciu technik łańcuchowej reakcji polimerazy oraz metod immunohistochemicznych (Hattori i in. 1990, Maggiano i in. 1994, Harvey i in.2002, Poppi i in. 2002, Herrero-Turrión i in. 2003). Ponadto Yang i in., (1999) dokonali podziału organizmu ryby na miejsca charakteryzujące się wysoką oraz niską aktywnością transkrypcyjną genu hormonu wzrostu. Przysadka mózgowa, mózg, serce oraz skrzela zostały zaklasyfikowane do miejsc gdzie mRNA gh jest produkowany w większych ilościach niż w nerce, wyrostkach pylorycznych, gonadach oraz wątrobie.

Badania własne, przeprowadzone na próbach wątroby linów doświadczalnych wskazują również, że ilość transkryptu dla hormonu wzrostu jest niska. Dowodem na to są jedynie trzy krzywe amplifikacji dla dwóch samców i jednej samicy oraz ich wysokie (na tle innych badanych prób) wartości Ct. Trudno jest natomiast wnioskować o wpływie temperatury oraz płci na poziom ekspresji genu hormonu wzrostu na podstawie trzech pozytywnych prób. Zastanawiającym jest, jak wyglądałaby aktywność genu hormonu wzrostu w temperaturze oscylującej wokół 5 °C, odzwierciedlającej okres zimowy. Marchant i Peter, (1986) wykazali u osobników karasia złocistego (Carassius auratus) przetrzymywanych w tej temperaturze, że SRIF nie wywiera swego inhibicyjnego wpływu na proces produkcji oraz sekrecji GH. Natomiast badania nad doradą dowiodły przeciwnej zależności (Cavari i in. 1993). Reasumując, nieliczne wyniki otrzymane dla prób wątroby okazały się spójne z tymi dla przysadki mózgowej wykazując że, aktywność genu hormonu wzrostu lina była największa w najniższych temperaturach. Brak krzywych amplifikacji w wyższych temperaturach może świadczyć o bardzo niskiej (poniżej progu detekcji) aktywności transkrypcyjnej badanego genu bądź o jej braku.

Na 24 badane próby tkanki mięśniowej (pochodzące od 12 samców i 12 samic) uzyskano 10 wartości Ct, z których 70 % należało do samic, a 30 % do samców.

Odwołując się ponownie do badań przeprowadzonych przez Lynn i in. (2009) sytuację taką można swobodnie powiązać z fenomenem SSD rozpatrywanym dla samic lina.

Trzy pozytywne wyniki Ct na 12 badanych samców świadczą o niskim poziomie syntezy mRNA gh u tej płci. Godnym podkreślenia jest fakt, że ponownie krzywe amplifikacji uzyskano głównie dla prób (7 na 10 pozytywnych) pobranych od ryb przetrzymywanych w temperaturach 10 i 15°C. Z uwagi na fakt, iż dla 10 z 24 prób uzyskano krzywe amplifikacji można wnioskować, że w komórkach mięśniowych lina

dochodzi do ekspresji genu hormonu wzrostu. W dostępnej literaturze brak jest podobnych wyników dla ryb. W badaniach przeprowadzonych nad strzępielem Epinephelus coioides sprawdzono obecność transkryptów gh w próbach z przysadki mózgowej, mózgu, wątroby, jajników, żołądka, serca, nerki, śledziony oraz mięśni szkieletowych. Po zestawieniu otrzymanych wyników stwierdzono, że w próbach z mięśni, wątroby, nerki, żołądka oraz serca nie uzyskano amplikonu charakterystycznego dla mRNA gh. Badania wykonano w oparciu o hybrydyzację typu Northern Blot wspartą przez RT-PCR (Li i in. 2005). Wynik negatywny może być faktycznie efektem braku mRNA gh w próbach mięśni bądź też wynikać z niższej czułości użytych technik detekcji zwłaszcza przy analizach, gdzie stężenie badanej matrycy jest krytycznie niskie. Wykorzystane w powyższych badaniach metody badawcze nie charakteryzują się taką czułością jak zastosowana przez autora real-time PCR. Ponadto po zakończeniu reakcji musimy przeprowadzić dodatkowo rozdział elektroforetyczny otrzymanych prób i dopiero wtedy uzyskujemy wynik jakościowy a nie dokładny ilościowy, jak w qPCR (Bustin i in. 2000). Liczbę kopii oraz stężenie mRNA wyliczono na podstawie krzywych standardowych przygotowanych dzięki rozcieńczeniom dziesiętnym EGFP RNA oraz gh RNA lina. Obie krzywe standardowe zostały przygotowane poprzez in vitro transkrypcję, jednakże jak można było zauważyć nieznacznie różniły się one wartością współczynnika regresji „R”, aczkolwiek w obu przypadkach był on wysoki (powyżej 0,95). Należy także zwrócić uwagę na nachylenie krzywych amplifikacji dla obu standardów. W przypadku EGFP RNA po przekroczeniu progu wznosiły się one stromo ku górze, po czym osiągały fazę plateau (fotodetektor nie mierzył dalej fluorescencji). Natomiast przebieg krzywych na podstawie gh RNA lina nie zmierzał ku fazie plateau tak stromo i dlatego też parametr R był niższy niż dla pierwszego konstruktu. Nie jest to jednakże błąd, bądź podstawa do odrzucenia uzyskanych wyników stężenia badanych prób. Wynikające różnice mogą mieć przyczynę w tym, że EGFP RNA był przetrzymywany w specjalnym buforze stabilizującym RSB, w przeciwieństwie do gh RNA (Hoffmann i in. 2006). Porównując ze sobą wyniki stężenia z wynikami liczby kopii dla każdej z prób jasno widać, że gdy maleje stężenie to wraz z nim spada liczebność kopii mRNA (Tab. 15). Jest to logiczny wniosek, aczkolwiek przy niedbale przygotowanych krzywych standardowych ta zależność nie występuje (Bustin i in. 2005).

Reasumując, przyjęta metoda real-time PCR z dwoma zestawami krzywych standardowych okazała się w porównaniu do dotychczas stosowanych bardziej czuła

w detekcji i kwantyfikacji ekspresji genu hormonu wzrostu. Pozwoliło to na stwierdzenie aktywności genu gh w tkance mięśniowej, która dotychczas nie była uważana za takie miejsce, w którym następuje transkrypcja mRNA gh.

Oprócz analizy poziomu genu hormonu wzrostu niniejsza praca miała na celu określenie zmian stężeń hormonu wzrostu (GH) oraz insulinopodobnego czynnika wzrostu typu I (IGF-I) w hepatocytach oraz plazmie krwi w oparciu o kompetycyjny test ELISA. Przed sekrecją dojrzałego białka do krwioobiegu mRNA ulega translacji, po czym po jej zakończeniu może być ponownie wykorzystany w kolejnej rundzie tego procesu. Dlatego też na podstawie ilości mRNA nie można określić dokładnego stężenia białka we krwi. Ponadto po przeprowadzeniu translacji łańcuchy peptydowe ulegają obróbkom posttranslacyjnym, podczas których powstaje dojrzałe białko. W zależności od rodzaju oraz przeznaczenia białka mogą one ulegać specyficznemu fałdowaniu, proteolitycznemu rozszczepieniu, modyfikacjom chemicznym (przyłączenie grup chemicznych do aminokwasów) bądź wycinaniu intein. Po wprowadzeniu wszystkich koniecznych modyfikacji białko przyjmuje formę dojrzałą (Brown 1999, Lodish i in. 2007). Dodatkowo na ostateczny poziom białek wpływa wiele czynników działających antagonistycznie (Benedet i in. 2010). W przypadku hormonu wzrostu dojrzałe białko wydzielane jest z komórek somatotropowych na zasadzie egzocytozy. Następnie hormon poprzez dyfuzję przemieszcza się w kierunku błon podstawnych, które wraz z komórkami gwiaździstymi tworzą usieciowaną strukturę. Dokładny mechanizm procesu dyfuzji oraz wydzielenia hormonu do krwioobiegu nie jest znany. Uważa się, że u karasia pospolitego sekrecja tego hormonu jest regulowana stężeniem tlenku azotu produkowanym z L-argininy w przysadce przez enzym syntazę tlenku azotu (Uretsky i Chang 2000). Ponadto dzięki badaniom nad sekrecją GH in vivo i in vitro okazało się, że hormon w układzie krążenia musi podlegać dodatkowym modyfikacjom strukturalnym. Podejrzewa się także, że może on się łączyć z białkami transportowymi podobnymi do tych, jakie występują u ludzi (Carmignac i in.

1993, Holloway i in. 1996). Nadal jednak nie ma informacji na temat istnienia takich białek u ryb. Dlatego w celu poznania rzeczywistego potencjału wzrostowego ryby koniecznym jest przebadanie możliwie wszystkich znanych wskaźników mogących charakteryzować możliwości wzrostowe osobnika. W omawianej pracy wybrano jako takie wskaźniki stężenia GH i IGF-I w hepatocytach i plazmie krwi.

Analizując uzyskane wyniki stężeń dla hormonu wzrostu, można zauważyć, że jego stężenie w plazmie krwi oraz komórkach wątroby osiągnęło maksymalną wartość

w temperaturze 20 ºC. Stężenie GH w plazmie krwi niezależnie u obu płci zostało także potwierdzone analizą statystyczną. Podobnie jak w przypadku drugiego badanego białka (IGF-I), wyniki uzyskane dla temperatury 20^oC wskazują na najwyższe możliwości wzrostowe ryb. Wynika to z wielkości uzyskanych stężeń IGF-I. Podobne zależności otrzymano w trakcie badań nad doradą (Pérez-Sánchez i in. 1994). Według autorów w wodzie o temperaturze 20^oC, stężenie hormonu wzrostu było największe, gdyż receptory dla GH nie przyjęły jeszcze prawidłowej konformacji przestrzennej.

Zmiany konformacyjne w budowie receptorów uważane są za jeden ze sposobów kontrolowania osi somatotropowej. W przypadku GH krąży on we krwi i nie może poprzez GHR aktywować kaskady czynników wewnątrzkomórkowych. Stan taki u organizmów określany jest mianem GH oporności komórek które posiadają GHR (Sumpter i in. 1991, Gray i in. 1992). Konsekwencją tejże oporności jest niskie stężenie IGF-I w plazmie krwi, wynikające z braku aktywacji GHR a tym samym transdukcji sygnału warunkującego transkrypcję genu dla tego białka. Odwrotną zależność dla dorady zaobserwowano, gdy temperatura wody oscylowała wokół 25 °C (Pérez-Sánchez i in. 1994). Inne interesujące wyniki badań nad rybą Rhabdosargus sarba przedstawili Dane i Woo (2006). Wykazali oni, że wzrost temperatury z 12 do 25 ºC spowodował 1,6 krotne zmniejszenie ilości transkryptu mRNA gh oraz 1,8 krotne obniżenie stężenia GH w plazmie krwi tej ryby. Wyjaśnieniem stanu, w którym stężenie GH w wyższych temperaturach spada jest to, że GHR przyjmuje właściwą konformację przestrzenną do związania GH. Dzięki temu wiąże on GH z krwioobiegu, co automatycznie powoduje spadek jego stężenia w plazmie krwi. Związanie GH powoduje aktywację GHR oraz transdukcję sygnału we wnętrzu komórki do inicjacji transkrypcji genu insulinopodobnego czynnika wzrostu typu I, czego następstwem jest zwiększające się stężenie IGF-I w plazmie krwi w miarę wzrostu temperatury.

Jednocześnie w hepatocytach maleje stężenie IGF-I, ponieważ jest on wydzielany do krwioobiegu Takiej zależności nie stwierdzono w omawianej pracy. Pérez-Sánchez i in.

(1994) zauważyli także istotną zależność między tempem wzrostu mierzonym wskaźnikiem SGR a stężeniami GH i IGF-I w plazmie krwi. SGR było najmniejsze w momencie, gdy stężenie GH w plazmie krwi było najwyższe i odwrotnie, jeśli stężenie GH było niskie a IGF-I wysokie to przyrost osobników był największy. Ponadto zależność wartości SGR od stężenia GH i IGF była identyczna, jak współczynnika PER, czyli przyrostu masy ciała na 1 kg spożytego białka. Oba współczynniki w temperaturze 25 °C, czyli w okresie najwyższego stężenia IGF-I, osiągały największe wartości. Jak

można zauważyć, najwyższe wartości stężenia IGF-I, a nie GH, znajdowały się w plazmie krwi kiedy tempo wzrostu było największe (Deane i Woo 2009, Pérez-Sánchez i in. 1994, Marchant i Peter 1986). Inną przyczyną spadku GH w plazmie krwi (oprócz związania go w GHR) jest mechanizm kontroli sprawowany w obrębie dużej pętli.

Wzrastające stężenie IGF-I powoduje zahamowanie syntezy i sekrecji GH poprzez aktywację SRIF (somatostatyny) (Canosa i in. 2007). Istnieją także dowody na to, że wzrastająca temperatura stymuluje transkrypcję genu kodującego czynnik GABA (kwas gamma-aminomasłowy), który następnie hamuje wydzielanie GH z przysadki mózgowej (Fraser i in. 2002).

Przebieg krzywych (Ryc. 60 i 61) obrazujących zależność między stężeniem GH w hepatocytach i plazmie krwi a temperaturą wody w akwarium jest praktycznie identyczny. Wskazują one, że ilość hormonu wzrostu w temperaturze 20°C była największa. Jednakże wyliczone ze wzoru stężenia, na podstawie których stworzono wykres, są bardzo niskie a różnice między nimi nieznaczne. Obraz taki może wynikać z faktu, że hormon wzrostu związany z receptorem nie może się już przyłączyć do przeciwciała użytego w teście ELISA. Należy w tym miejscu podkreślić, iż wybór kompetycyjnego testu ELISA był słuszny. Wynika to z faktu przebiegu omawianych tu krzywych (GH vs temperatura, hepatocyty), które swym przebiegiem przypominały te wykreślone dla stężenia GH w plazmie krwi, a wyliczone wartości stężeń były na granicy standardu bądź poniżej. Zatem, dzięki wysokiej czułości testu oraz ekstrapolowaniu wartości stężeń na podstawie przekształconego wzoru możliwym było wykazanie tak subtelnych zmian stężeń GH w wątrobie.

Interesującym jest także to, że stężenie obu białek u samic, było zawsze wyższe niż u samców niezależnie od wariantu temperaturowego. Stan taki jest zbieżny z wcześniej opisywanym dla mRNA gh w próbach wątroby samic i znajduje odzwierciedlenie w fenomenie SSD opisanym wielokrotnie dla lina (Milkau 1921, Müller 1961, Kennedy i Fitzmaurice 1970, Wang i in. 2006a). Literatura naukowa dostarcza wielu przykładów gdzie poziom GH lub IGF-I był zależny od płci badanego osobnika.

Badania przeprowadzone nad karasiem złocistym (Carassius auratus), pstrągiem tęczowym bądź łososiem atlantyckim (Salmo salar) potwierdziły, że samice mają wyższy poziom GH we krwi (Marchant i Peter 1986, Björnsson i in. 1994, Holloway i Leatherland 1998). Natomiast odwrotny stan, gdzie samce charakteryzują się wyższym poziomem GH we krwi stwierdzono w badaniach nad halibutem

atlantyckim (Hippoglossus hippoglossus). Różnica w poziomie GH miedzy płciami została u nich określona na jeden rząd wielkości (Einarsdóttir i in. 2002).W innych badaniach nad poziomem IGF-I stwierdzono, że u krzyżówki skalników ♀Morone chrysops × ♂Morone saxatilis poziom tego białka był nieznacznie wyższy u samców niż u samic (Davis i McEntire 2010). Natomiast wyższe stężenie IGF-I u samic potwierdzono u kiżucza, pstrąga tęczowego oraz sterleta (Acipenser ruthenus) (Fukada i in. 2003, Wuertz i in. 2007, Tymchuk i in. 2009).

Jak wskazują powyższe przykłady, charakterystyczny poziom GH bądź IGF-I nie jest jedynie przypisany do danej płci w obrębie gatunku. Istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że poziom badanych białek w plazmie i hepatocytach linów jest ściśle powiązany z czynnikami ze strony osi gonadotropowej. Szczególnie było to widoczne na podstawie badań nad sterletem, gdzie obie płcie na powierzchni gonad miały porównywalną ilość receptorów dla IGF-I. Istotna różnica występowała natomiast w poziomie mRNA igf-I, który u samic był znacznie wyższy. Zwiększony poziom powyższego transkryptu u samic sugeruje silną współzależność między IGF-I a rozwojem gonad, w który zaangażowanych jest wiele hormonów gonadotropowych (Wuertz i in. 2007). Shearer oraz Swanson (2000) przeprowadzili pomiar mRNA igf-I u samców czawyczy (Oncorhynchus tshawytscha) i stwierdzili ogromny wpływ hormonów: luteinizującego (LH) oraz folikulotropowego (FSH) na aktywność genu kodującego IGF-I. Autorzy porównali aktywność tego genu w okresie przed oraz w

W dokumencie Zastosowanie metody real-time PCR oraz kompetycyjnego testu ELISA do określania potencjału wzrostowego lina Tinca tinca L. (Stron 87-98)