Fałdowanie się białek w obecności kofaktorów

archeowców zamiast TF, bezpośrednio na rybosomie działa NAC, a fragmenty łańcucha po-lipeptydowego dodatkowo stabilizowane są przez prefoldynę (PFD). Eukarioty wypracowały więcej ścieżek fałdowania de novo. Tutaj działają układy Hsp70, Hsp90 i chaperoniny w postaci TRiC lub CCT.

Sposób fałdowania się białka zależny jest także od typu białka. Odmiennie proces ten prze-biega w przypadku białek cytozolowych [34], sekrecyjnych [29] i transbłonowych [35]. Podobnie rozmiar białka oraz architektura struktury natywnej determinuje scenariusz fałdowania zarówno pod względem mechanizmów kontroli jak i aspektów kinetycznych oraz termodynamicznych [25].

Kolejnym czynnikiem jest funkcja biologiczna, do której pełnienia wymagane są modyfikacje po-sttranslacyjne, wiązanie kofaktorów czy tworzenie kompleksów w postaci asocjacji podjednostek.

Obecnie możliwa jest obserwacja procesów syntezy białka na rybosomie [18, 36–39] jak rów-nież oddziaływania z chaperonami [40, 41]. Opracowano także metody badania in vivo procesów niekorzystnych w postaci agregacji białek [42, 43]. Badania w całych komórkach możliwe są głów-nie przy wykorzystaniu technik NMR [44] oraz zjawiska fluorescencji i specjalnych znaczników [42, 43]. Pomimo znacznego rozwoju metod służących do badań in vivo ich zastosowanie ma swoje ograniczenia i wiąże się z różnymi trudnościami, dlatego głównym źródłem wiedzy na temat fałdowania się białek są badania in vitro.

1.2. Fałdowanie się białek w obecności kofaktorów

Rozszerzanie repertuaru funkcji biologicznych, w tym także reakcji katalitycznych, reali-zowane jest poprzez wprowadzanie kofaktorów, czyli niebiałkowych związków, które są w strukturze białka niezbędne dla jego pełnej aktywności. Ponad 30% białek występujących w komórkach żywych funkcjonuje z udziałem kofaktorów [45, 46]. Ze względu na trwałość wiąza-nia białko-kofaktor, wyróżwiąza-nia się grupy prostetyczne połączone z białkiem wiązaniem kowa-lencyjnym oraz koenzymy, w przypadku których połączenie to ma charakter niekowalencyjny.

Kofaktorami mogą być jony metali lub cząsteczki związków organicznych bądź nieorganicznych.

Najlepiej poznaną a zarazem największą grupą białek zawierających kofaktory są enzymy. Białko bez związanego kofaktora nazywane jest apobiałkiem (forma apo), natomiast pełna struktura białka ze związanym kofaktorem to holobiałko (forma holo). Często jednak terminy te używane są w szerszym kontekście, który dotyczy ogólnie obecności ligandów.

Białka fałdują się w środowisku komórki, w którym obecne są m.in. kofaktory w postaci jonów metali lub związane przez białka „dostarczające”. Dodatkowo zaobserwowana zdolność zachowywania oddziaływań pomiędzy kofaktorem a białkiem (nawet gdy nie są to wiązania kowalencyjne) po jego rozfałdowaniu [47–50], wskazuje że kofaktory mogą mieć kontakt z łań-cuchem polipeptydowym przed osiągnięciem struktury natywnej i wpływać na przebieg fał-dowania. Do białek pozostających w kontakcie z kofaktorem po rozfałdowaniu należą m.in.

cytochrom b₅₆₂ [48, 50], mioglobina [51], azuryna [52], domena CuA [53].

Struktura rozfałdowanego białka nie jest całkowicie przypadkowa (po rozfałdowaniu in vi-tro; po wyjściu z rybosomu in vivo), pomimo tego że nie zwiera większości elementów struktury drugo- i trzeciorzędowej [54]. Sekwencje aminokwasowe wykazują preferencje do przyjmowania określonych struktur (mimo że podlegają fluktuacjom pod wpływem czynników zewnętrznych).

Podobnie obecność kofaktora może być czynnikiem mającym wpływ na lokalną bądź nielokalną strukturę rozfałdowanego białka, warunkując tym samym powstanie zalążka nukleacji. Ogra-niczenie w ten sposób przestrzeni konformacyjnej może ukierunkowywać, a nawet przyspieszać proces fałdowania. Niewątpliwie obecność kofaktorów w wielu przypadkach ma wpływ na sta-bilność struktury białka [47, 48, 55, 56], natomiast ich rola w procesie fałdowania się białek dopiero zaczyna być poznawana o czym świadczy liczba prac poświęconych tej tematyce jak również opinie autorów [57, 58]. Poniżej zamieszczono doniesienia dotyczące badań wpływu kofaktora na fałdowanie i stabilność białek. Równocześnie zastosowano podział na kofaktory nieorganiczne oraz organiczne, przy czym hem zaliczono do drugiej grupy.

1.2.1. Kofaktory nieorganiczne

Do grupy kofaktorów nieorganicznych należą jony metali oraz centra żelazowo-siarkowe.

Metale są równocześnie najczęściej spotykaną grupą kofaktorów. Badania fałdowania się białek w ich obecności są jednak w fazie początkowej. Dotyczą one głównie jonów miedzi (azuryna, chaperony miedziowe) i wapnia (α-laktoalbumina, rybonukleaza HI, nukleaza A). Można zna-leźć także doniesienia na temat cynku (palce cynkowe, anhydraza węglanowa) oraz kobaltu (anhydraza węglanowa) jednak już w mniejszym wymiarze [59–62].

Miedź

Azuryna jest białkiem miedziowym, pełniącym funkcję transportu elektronów. Struktury azuryny w formach apo i holo są identyczne, przy czym obserwuje się większą stabilność struk-tury po związaniu miedzi [63]. Postuluje się, że stabilizacja ta jest wynikiem obniżenia szybkości rozfałdowania [64]. Wiązanie miedzi przez natywną strukturę azuryny w warunkach in vitro zachodzi samorzutnie, jednak jest to proces 4000 razy wolniejszy niż gdy łańcuch fałduje się w obecności miedzi [64]. Sama obecność miedzi nie ma jednak istotnego wpływu na szybkość fałdowania się tego białka. Nie wyklucza to jednak faktu, że in vivo szybkość powstawania ho-loenzymu ma duże znaczenie dla funkcji, przez co korzystniejszy wydaje się wariant fałdowania w obecności kofaktora.

Ze względu na dużą toksyczność miedzi jej stężenie in vivo utrzymywane jest na bardzo ni-skim poziomie (< 10⁻¹⁸M), który regulują m.in. metalotioneiny i chaperony miedziowe. Badania stabilności chaperonów miedziowych CopZ i Atox1 pokazują, że jest ona większa w przypadku form holo [65]. Niestety nie ma doniesień na temat ich fałdowania. Z kolei peryplazmowe białko CopC (transportujące miedź) zawiera dwa miejsca wiążące miedź, przy czym jedno ma wpływ

1.2 Fałdowanie się białek w obecności kofaktorów 5

na stabilność i ścieżkę rozfałdowywania, a drugie ma niewielki wpływ na stabilność [66], co może mieć znaczenie w transporcie in vivo.

Magnez i wapń

Struktura rybonukleazy HI jest stabilizowana przez jony dwuwartościowe (magnez, wapń) poprzez obniżenie szybkości rozfałdowywania [55]. Ścieżka fałdowania tego białka jest w mini-malnym stopniu zaburzona przez obecność metalu, który wiąże się w kieszeni w momencie gdy enzym osiąga strukturę natywną [55]. Podobnie stabilizowana jest struktura nukleazy A jest przez jony wapnia [67, 68]. Z kolei w przypadku α-laktoalbuminy nie obserwuje się wpływu na rozfałdowywanie, lecz przyspieszenie refałdowania w obecności wapnia [69, 70]. Jony te mają wpływ na stabilność struktury [71]. W innych badaniach dodatkowo zaobserwowano, że jony metali ziem alkalicznych przyspieszają fałdowanie α-laktoalbuminy, natomiast pozostałe me-tale z wyjątkiem manganu(II) nie mają takiego wpływu [69]. Wprowadzenie wapnia powoduje zmianę struktury miejsca wiążącego oraz zmiany w rejonie oddziaływań międzydomenowych.

Cynk i kobalt

Kofaktory w postaci jonów cynku(II) lub kobaltu(II) indukują refałdowanie anhydrazy wę-glanowej [59].

Rozważając jony cynku, warto też pamiętać o ich szczególnej roli w strukturach palców cynkowych. Wiązanie cynku lub innego metalu przejściowego jest w ich przypadku niezbędne dla prawidłowego przebiegu fałdowania [60, 61]. Indukowanie fałdowania palców cynkowych badano także stosując metody obliczeniowe [62].

Klastry żelazowo-siarkowe

Fałdowanie ferredoksyny zaliczanej do białek żelazowo-siarkowych jest indukowane poprzez wprowadzenie kofaktora [72]. Oddysocjowanie klastrów żelazowo-siarkowych powoduje, że re-fałdowanie jest niemożliwe. Dlatego też sugeruje się, że pod nieobecność klastrów żelazowo-siarkowych białko to jest w stanie osiągnąć struktury natywnej. Podobnie w warunkach in vivo wiązanie klastrów żelazowo-siarkowych może być koniecznym etapem poprzedzającym właściwe fałdowanie [46].

Badania NMR częściowo rozfałdowanej struktury wysokopotencjałowego białka żelazowo-siarkowego (HiPIP) wskazują, że obecność Fe₄S₄ wprowadza preferencje strukturalne w oto-czeniu kofaktora [73]. Wyniki te nakierowują uwagę na rolę tego typu kofaktorów w tworzeniu miejsc nukleacji. Centra żelazowosiarkowe utrzymują uporządkowanie w warunkach silnie dena-turujących. Pojawiają się także hipotezy mówiące, że tworzenie połączeń Fe-S(Cys) może być

kluczowym etapem w fałdowaniu się aktywnej formy białka HiPIP również w warunkach in vivo [47].

Niestety nadal mało wiadomo na temat mechanizmów transferu i inkorporacji klastrów żelazowo-siarkowych do struktur białkowych [74].

1.2.2. Kofaktory organiczne

Do grupy kofaktorów organicznych należy wiele witamin, ich pochodnych, związki zawie-rające fragmenty nukleotydowe takie jak NAD, FAD, CoA oraz wiele innych w tym struktura hemu. Ich wpływ na proces fałdowania się białek jest jednak mało poznany. Najwięcej doniesień na ten temat dotyczy mononukleotydu flawinowego (FMN) oraz hemu.

Mononukleotyd flawinowy

Flawodoksyna jest białkiem intensywnie badanym pod względem wiązania mononukleotydu flawinowego (FMN), jego wpływu na stabilność i fałdowanie [57, 75–81]. Struktury apo- i ho-loenzymu są identyczne, pomimo różnicy w dynamice pętli wiążących FMN. Struktura holo flawodoksyny charakteryzuje się większą stabilnością w odniesieniu do formy apo [76, 82, 83], choć znane są także doniesienia, że stabilizacja ta nie jest duża (< 2kJ/mol) [84]. Zbadano także, że wiązanie FMN do struktury natywnej jest szybsze w porównaniu ze strukturą rozfałdowaną, równocześnie sugerując, że wiązanie kofaktora następuje w końcowym etapie fałdowania [26].

Wcześniej jednak stwierdzono, że obecność kofaktora wpływa na kinetykę fałdowania flawodok-syny równocześnie powodując jego przyspieszenie w porównaniu z formą apo [75]. Równocześnie inne doniesienia wyraźnie wskazują, że fałdowanie flawodoksyny jest niezależne od obecności kofaktora, FMN nie działa jako zalążek nukleacji, a rozfałdowanie przebiega po wcześniejszym uwolnieniu FMN i zachodzi dopiero w warunkach silnie denaturujących [57]. Dopiero późniejsze prace badające mutanty w rejonie miejsca wiążącego potwierdzają przyspieszenie refałdowa-nia pod wpływem obecności FMN [78], równocześnie wskazując, że różnice w określeniu roli kofaktora najprawdopodobniej wynikają z budowy badanych łańcuchów polipeptydowych fla-wodoksyny (długi występujący u np. A. vinelandii i krótki pochodzący z np. D. desulfuricans).

Oznacza to, że to samo białko pochodzące z różnych organizmów może mieć różne mechani-zmy fałdowania, a same badania tych procesów są trudne ze względu na brak metod dających bezpośredni wgląd i wymagają ostrożnej interpretacji.

Hem

Różnorodność struktur i funkcji hemoprotein jest ogromna, a wspólnym ich elementem jest obecność hemu [85]. Znaczenie tej grupy białek przekłada się na ogromny wysiłek poświęcony badaniom ekspresji, lokalizacji w komórce z jednej strony, oraz chemii i struktury z drugiej.

Podobnie dobrze poznany jest proces syntezy hemu in vivo. Pomimo to, z wyjątkiem