Fragmenty uporz¡dkowane

Dla wielu biaªek glutenu pocz¡tek i koniec ich sekwencji ma du»o wi¦ksz¡ zªo»ono±¢ ni» reszta. Np.

domena A, znajduj¡ca si¦ na N-ko«cu gluteniny HMW, wykazuje wysoki stopie« homologii do ro±lin-nego inhibitora enzymów trawiennych [228]. Podobne poªo»enie par cystein w sekwencji sugeruje, »e tak jak w tych inhibitorach tworz¡ si¦ staªe mostki w ramach jednego ªa«cucha. Te i podobne wi¦zy strukturalne zostaªy uwzgl¦dnione poprzez wygenerowanie struktur o rozdzielczo±ci peªnoatomowej dla uporz¡dkowanych regionów, a nast¦pnie wykorzystanie ich do utworzenia map kontaktów, tak jak w modelu Go [229]. Potencjaª sztywno±ci ªa«cucha jest dla ustrukturyzowanych fragmentów taki sam jak dla nieustrukturyzowanych (tzn. taki jak opisany w podrozdziale 2.3).

Fragmenty ustrukturyzowane zostaªy wybrane na podstawie literatury [228] i podziaªu sekwencji na domeny wg bazy UniProt [227]. Rezultat podziaªu przedstawia tabela 5.1.

Struktury peªnoatomowe dla ustrukturyzowanych fragmentów zostaªy wygenerowane metod¡ mode-lowania homologicznego przy pomocy serwera ITASSER [230, 231]. Struktury te zostaªy wykorzystane do znalezienia mapy kontaktów, opartej na kryterium przekrywania ci¦»kich atomów (szczegóªy kon-strukcji mapy kontaktów s¡ podane w [229] oraz skrótowo w podpunkcie 2.5.2).

Dzi¦ki temu, »e do symulacji glutenu zostaª u»yty model quasi-adiabatyczny, mo»na bez trudu poª¡czy¢ zadan¡ z góry map¦ kontaktów dla fragmentów ustrukturyzowanych z chwilow¡ map¡ kon-taktów obliczan¡ w programie. Kontakty przewidziane przez serwer ITASSER s¡ zawsze wª¡czone, tzn. odpowiednie pary aminokwasów zawsze si¦ przyci¡gaj¡. Dlatego mo»na kontakty te okre±li¢

jako statyczne, w przeciwie«stwie do dynamicznych kontaktów dla fragmentów nieuporz¡dkowa-nych. Kontakty statyczne s¡ opisane potencjaªem LJ z minimum odpowiadaj¡cym odlegªo±ci mi¦dzy atomami Cα w peªnoatomowej strukturze wygenerowanej serwerem ITASSER. Aminokwasy tworz¡ce

statyczne kontakty mog¡ tworzy¢ tak»e kontakty dynamiczne z innymi (o ile nie nale»¡ do tego samego fragmentu ustrukturyzowanego). Istnienie kontaktu statycznego wlicza si¦ do limitu s danego aminokwasu.

5.3 Protokóª symulacji

Pudeªko, w którym symulowany jest gluten posiada (przez caªy czas symulacji) periodyczne warunki brzegowe dla ±cian prostopadªych do osi X oraz Y , natomiast ±ciany prostopadªe do osi Z nie pozwalaj¡

na przechodzenie przez nie aminokwasów (i s¡ przyci¡gaj¡ce b¡d¹ odpychaj¡ce).

Pocz¡tkowe wszystkie ªa«cuchy s¡ losowo¹ rozmieszczone w sze±ciennym pudeªku² o g¦sto±ci 0.1 aminokwasu/nm³(aa/nm³), a ich ksztaªt jest okre±lony przez samoomijaj¡ce si¦ bª¡dzenie przypadkowe¹.

Losowe rozmieszczenie biaªek jest umotywowane tym, »e w ziarnach biaªka glutenu te» s¡ od siebie oddzielone [232]. Ich agregacja zachodzi dopiero podczas mieszania m¡ki w ±rodowisku wodnym. Jest to odzwierciedlone w protokole symulacji: najpierw ukªad ma 125 000 ns (przyjmujemy 1 τ ≈ 1 ns) na doj±cie do stanu równowagi (w ramach pojedynczych biaªek) w maªej g¦sto±ci (ponad 30 razy mniejszej ni» g¦sto±¢ glutenu). G¦ste ukªady polimerów maj¡ bardzo dªugie czasy relaksacji [233], dlatego wa»ne jest, aby biaªka glutenu miaªy mo»liwo±¢ zwini¦cia si¦ (zwªaszcza je±li maj¡ fragmenty uporz¡dko-wane) przed agregacj¡. Oczywi±cie losowo dyfunduj¡ce ªa«cuchy mog¡ przypadkowo zagregowa¢ przed przyj¦ciem wªa±ciwej konformacji, dlatego wszystkie podawane tu wyniki s¡ ±redni¡ z co najmniej trzech symulacji. Takie przypadki s¡ jednak maªo prawdopodobne, patrz panel 1 na Rys. 5.2.

‘ciany prostopadªe do osi Z s¡ na pocz¡tku symulacji wyª¡cznie odpychaj¡ce. Odlegªo±¢ mi¦dzy tymi dwiema ±cianami (a zarazem dªugo±¢ boku pudeªka) jest oznaczona jako s. Odpychanie amino-kwasów przez ±ciany zapewnia uci¦ty potencjaª LJ z gª¦boko±ci¡ 4 i minimum 0.5 nm (dla r > 0.5 nm potencjaª wynosi zero, a minimum jest podniesione tak, aby równie» odpowiadaªo energii zero).

Po 125 µs przeznaczonych na doj±cie do równowagi, ±ciany podeªka zaczynaj¡ zbli»a¢ si¦ do siebie z pr¦dko±ci¡ 2 mm/s, a» zostanie osi¡gni¦ta g¦sto±¢ ρ0 (w wi¦kszo±ci symulacji odpowiadaj¡ca g¦sto±ci glutenu [234] ρ0 ≈ 3.5 aa/nm³, patrz podpunkt 5.3.2). Nast¦pnie ukªad ma kolejne 150 µs na doj±cie do równowagi (co przedstawia panel 2 na Rys. 5.2). Na tym etapie dªugo±¢ boku pudeªka ma warto±¢

s = s₀, okre±lon¡ przez g¦sto±¢ ρ0 i liczb¦ aminokwasów w pudeªku.

Kolejnym etapem po odczekaniu 150 µs jest wª¡czenie przyci¡gania dla ±cian prostopadªych do osi Z. Kiedy odlegªo±¢ mi¦dzy ±cian¡ a dowolnym aminokwasem stanie si¦ mniejsza ni» 0.5 nm, przyci¡gaj¡ca cz¦±¢ potencjaªu LJ o gª¦boko±ci 4 jest quasi-adiabatycznie wª¡czana (tak jak dla mostków dwusiarczkowych, patrz podpunkt 2.5.7). Potencjaª LJ jest okre±lony dla odlegªo±ci ri,w

mi¦dzy aminokwasem i oraz punktem w na ±cianie. Wspóªrz¦dna Z punktu w odpowiada poªo»eniu

±ciany, natomiast wspóªrz¦dne X oraz Y s¡ takie same jak wspóªrz¦dne aminokwasu i, kiedy po raz pierwszy przekroczyª próg r < 0.5 nm.

Kiedy aminokwas i oddali si¦ od punktu w dalej ni» na 2 nm, jest uznawany za odª¡czonego od

±ciany i kontakt mi¦dzy aminokwasem i i punktem w na ±cianie jest quasi-adiabatycznie wyª¡czany.

Aminokwas mo»e potem przyª¡czy¢ si¦ do ±ciany w innym miejscu w⁰.

1Nie jest to caªkowicie losowe rozmieszczenie ani losowe bª¡dzenie, poniewa» aminokwasy musz¡ by¢ w odlegªo±ci r>4Å od siebie, a k¡t pªaski mi¦dzy ka»d¡ trójk¡ aminokwasów w bª¡dzeniu przypadkowym musi by¢ wi¦kszy od 60^o.

2Je±li pocz¡tkowa konguracja biaªka przechodzi przez ±cian¦, pudeªko jest zwi¦kszane we wszystkich kierunkach, wi¦c

Odpychaj¡ca cz¦±¢ potencjaªu LJ jest zawsze wª¡czona dla r < 0.5 nm, aby »aden aminokwas nie przeszedª przez ±cian¦ prostopadª¡ do osi Z. Siªa dziaªaj¡ca na ±ciany jest sum¡ siª z jak¡ dziaªaj¡ na nie wszystkie aminokwasy. Jest ona u±redniana co 100 ns, aby zmniejszy¢ znaczenie szumu termicznego (aminokwasy odbijaj¡ si¦ od ±ciany). Powody, dla których zostaªa wybrana wªa±nie ta metoda realizacji przyci¡gania przez ±ciany, s¡ przedstawione w podpunkcie 5.3.1.

Kiedy przyci¡ganie ±cian zostanie wª¡czone, ukªad ma nast¦pne 150 µs na doj±cie do równowagi (co odpowiada panelowi 3 na Rys. 5.2). To, co stanie si¦ po tej (trzeciej ju») przerwie zale»y od tego, którego rodzaju symulacja jest wykonywana: rodzaje to odksztaªcenie normalne, ±cinaj¡ce oraz symulacja równowagowa. Dla odksztaªcenia normalnego obie ±ciany zbli»aj¡ si¦ do siebie wzdªu» osi Z a» osi¡gn¡ odlegªo±¢ s = s0− A, gdzie A =1 nm jest amplitud¡ oscylacji. ‘ciany prostopadªe do osi X i Y pozostaj¡ w odlegªo±ci s0, zatem pudeªko do symulacji przestaje by¢ sze±cianem.³ Po osi¡gni¦ciu s = s₀ − A (co pokazuje panel 4 na Rys. 5.2), odlegªo±¢ mi¦dzy ±cianami zmienia si¦ periodycznie:

s(t) = s₀− A cos (ωt). Podczas eksperymentów ω ∼ 1 Hz [90], czego nie da si¦ osi¡gn¡¢ w symulacji.

Domy±lny okres oscylacji to 40 µs, co odpowiada f ≈ 25 kHz. Najwi¦ksze s osi¡gni¦te podczas oscylacji pokazuje panel 5 na Rys. 5.2.

Dla symulacji odksztaªce« ±cinaj¡cych ±ciany tak»e przesuwaj¡ si¦ o tak¡ sam¡ amplitud¦ A, jednak oscylacje zachodz¡ w kierunku X i s¡ opisywane zale»no±ci¡ s⁰(t) = −A cos (ωt) (gdzie s⁰ = 0 odpowiada ±cianom prostopadªym do osi Z ustawionym jedna nad drug¡). Odksztaªcenia ±cinaj¡ce s¡

przedstawione na Rys. 5.3.

Trzeci, równowagowy rodzaj symulacji zakªada dodatkowe 100 µs czasu na dochodzenie do rów-nowagi zamiast periodycznych deformacji. W pierwszych dwóch rodzajach symulacji takich odksztaª-caj¡cych (normalnie b¡d¹ ±cinaj¡co) oscylacji jest pi¦¢. Po 5 oscylacjach (lub po odczekaniu 100 µ) zako«czonych powrotem do s = s0 nast¦puje kolejne 75 µs czekania na doj±cie do stanu równowagi.

Po nich nast¦puje ostatni ju» etap symulacji: ±ciany przyci¡gaj¡ce oddalaj¡ si¦ od siebie wzdªu» osi Z a» do osi¡gni¦cia odlegªo±ci s = 2s0. Umo»liwia to obliczenie caªkowitej pracy potrzebnej do takiego rozci¡gni¦cia, a tak»e najwi¦kszej siªy potrzebnej do rozerwania ukªadu (co odpowiada eksperymentowi rozci¡gania próbki wzdªu» jednej osi [238]). Panel 6 na Rys. 5.2 pokazuje takie rozci¡ganie. Szybko±¢

rozci¡gania to 0.5 mm/s, co odpowiada typowym szybko±ciom rozci¡gania mikroskopem siª atomowych [199, 229]. Najwi¦ksza szybko±¢ ±cian osi¡gana podczas oscylacji (vmax = Aω) jest jeszcze mniejsza.

3Zostaªa te» wypróbowana wersja programu, w której ±ciany (reprezentuj¡ce periodyczne warunki brzegowe) wzdªu»

X i Y tak»e si¦ przesuwaj¡, aby zachowa¢ staª¡ obj¦to±¢ pudeªka, jednak ta wersja nie wpªywa znacz¡co na wyniki.

Wspóªczynnik Poissona dla chleba wynosi ok. 0.1 [235], dla wi¦kszo±ci biaªek ro±linnych ok. 0.25 [236], a dla ciasta przyj¦ta zostaªa warto±¢ 0.46 [237], zatem nie ma jednoznacznego eksperymentalnego wskazania za lub przeciw

Rysunek 5.2: Zale»no±¢ od czasu odlegªo±ci s mi¦dzy dwiema ±cianami prostopadªymi do osi Z (czer-wony) i ª¡cznej siªy, z jak¡ aminokwasy oddziaªuj¡ na te 2 ±ciany (u±rednionej co 100 ns, zielony). Dane dotycz¡ symulacji glutenu (skªad wg tabeli 5.1), o g¦sto±ci 3.5 aa/nm³, z periodycznym odksztaªceniem normalnym o okresie 40 µs. 6 paneli pokazuje stan symulacji podczas jej kolejnych etapów (ka»da kulka reprezentuje 1 aminokwas, kolory rozró»niaj¡ ªa«cuchy). Ten sam ukªad wspóªrz¦dnych (na górze po lewej) jest u»yty dla wszystkich 6 paneli. Modykacja rys. 1 z artykuªu [V].

Rysunek 5.3: Górny panel pokazuje zale»no±¢ od czasu wychylenia ±cian s⁰ z poªo»enia równowagi w kierunku X (niebieski) oraz skªadowej X siªy dziaªaj¡cej na ±ciany (zielonkawy). Dolny panel i reszta oznacze« (w tym numeracja etapów symulacji) jak na Rys. 5.2, tyle »e z periodycznym odksztaªceniem