Identyfikacja fenotypowa i genotypowa wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej

Dziesięć izolatów bakterii fermentacji mlekowej, wybranych na podstawie wcześniejszych oznaczeń, poddano charakterystyce fenotypowej w oparciu o analizę mikroskopową oraz zdolność do wytwarzania katalazy, a następnie poddano je identyfikacji genetycznej. Wymienione oznaczenia wykonano zgodnie z punktami 6.3.1, 6.3.2 i 6.3.3, opisanymi w części metodycznej. Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono w tabelach 23 i 24.

Analiza mikroskopowa preparatów wybranych bakterii kwasu mlekowego, barwionych przy użyciu metody Grama, wykazała, że wszystkie badane izolaty stanowiły gramdodatnie pałeczki. We wszystkich przypadkach zaobserwowano krótkie i dłuższe formy pałeczek, tworzące charakterystyczne układy (łańcuszki, palisady), jak również nieregularne formy (Y oraz V). Wybrane izolaty bakterii fermentacji mlekowej cechował również brak zdolności do wytwarzania enzymu katalazy, co stwierdzono na podstawie obserwacji wpływu hodowli bakteryjnej na roztwór nadtlenku wodoru na szkiełku zegarkowym. Niezdolność do syntezy enzymu katalazy jest cechą charakterystyczną dla bakterii fermentacji mlekowej.

Identyfikację genetyczną wybranych izolatów bakterii kwasu mlekowego przeprowadzono na podstawie sekwencjonowania genu kodującego 16S rRNA. Izolację genomowego DNA z komórek wybranych izolatów przeprowadzono zgodnie z punktem 6.3.2, opisanym w części metodycznej, a następnie oceniono skuteczność przeprowadzonej izolacji za pomocą elektroforezy (punkt 6.3.2). Na podstawie analizy elektroforegramu (fotografia 12), potwierdzono obecność genomowego DNA we wszystkich próbkach uzyskanych z komórek wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej. Następnym etapem identyfikacji wybranych izolatów było przeprowadzenie PCR w celu powielenia fragmentu genu podjednostki rybosomalnej 16S rRNA. Reakcję łańcuchowej polimerazy przeprowadzono zgodnie z punktem 6.3.2., opisanym w części metodycznej. Obecność zamplifikowanego genu 16S rRNA, po zakończeniu PCR, potwierdzano na podstawie rozdziału elektroforetycznego. Z obserwacji elektroforegramu (fotografia 12) można było zauważyć wyraźne prążki powielonego fragmentu DNA, o długości 1500 pz, co potwierdzało obecność zamplifikowanego genu kodującego 16S rRNA.

124

Fotografia 12. Obraz rozdziału elektroforetycznego A: genomowego DNA, gdzie M – marker wielkości DNA, oraz B: produktów PCR o długości 1500 pz, gdzie M – marker wielkości, 1 – 10 – izolaty bakterii fermentacji mlekowej (kolejno JKS 021, PSK 201, JKK 006, JKK 009, PKK, PKK 100, MYK 210, MYK 220, MLK 304, MLK 306 i MLK 324

Źródło: fotografie własne

Uzyskane w wyniku PCR powielone fragmenty genu kodującego 16S rRNA, przekazano następnie do sekwencjonowania, które wykonane zostało przez Pracownię Technik Biologii Molekularnej, Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Otrzymane sekwencje przeanalizowano w programie Finch TV 1.4.0 a następnie poprawione sekwencje łączono przy użyciu programu GeneDoc 2.7.000 (przykładowe analizy przedstawiono na fotografiach 13 i 14). Połączone sekwencje zostały porównane z bazą danych Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI) przy użyciu narzędzia BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool).

Fotografia 13. Analiza sekwencji zamplifikowanego genu 16S rRNA w programie FinchTV 1.4.0

1 2 3 4 5 10 9 8 7 6 M M JSK 021 PSK 201 JKK 006 JKK 009 1500 pz 1500 pz B A

125

Fotografia 14. Analiza sekwencji z amplifikowanego genu 16S rRNA w programie GeneDoc 2.7.000 Źródło: fotografie własne

Na podstawie wykonanej analizy porównawczej określono dokładną przynależność gatunkową i rodzajową wybranych izolatów bakterii kwasu mlekowego, przy stopniu pokrycia otrzymanych sekwencji z sekwencjami dostępnymi w bazie danych, na poziomie 98 – 100%. Po wykonaniu identyfikacji genetycznej stwierdzono, iż wybrane izolaty bakterii fermentacji mlekowej stanowiły bakterie z rodzaju Lactobacillus: L. buchneri (JSK 021, MYK 220 i MLK 324), L. paracasei (JKK 006 i JKK 009), L. plantarum (MYK 210, MLK 304 i 306), L. pentosus (PKK 100 i PSK 201). Charakterystykę wybranych szczepów bakterii fermentacji mlekowej przedstawiono w tabeli 23 z uwzględnieniem ich morfologii. Spośród dziesięciu wybranych szczepów, po trzy izolaty należały do gatunku L. plantarum i L. buchneri, natomiast po dwa do gatunków L. pentosus oraz L. paracasei.

126

Tabela 23. Charakterystyka fenotypowa i genotypowa wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej z sianokiszonki i kiszonki z kukurydzy I

Charakterystyka Opis Obraz mikroskopowy

JSK 021 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, występujące pojedynczo, w parach lub w

palisadach

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus buchneri

Procent

identyfikacji ⁹⁹

PSK 201 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo lub w parach, tworzą

układy V i Y

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus pentosus

Procent

identyfikacji ⁹⁹

JKK 006 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce spłaszczone, wsytępujące

pojedynczo lub w krótkich łańcuszkach, tworzą liczne układy V

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus paracasei

Procent

identyfikacji ⁹⁹

JKK 009 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce spłaszczone, wsytępujące

pojedynczo lub w krótkich łańcuszkach, tworzą liczne układy V

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus paracasei

Procent

identyfikacji ⁹⁹

PKK 100 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo, w parach lub krótkich

łańcuszkach, tworzą układy V i Y

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus pentosus

Procent

identyfikacji ⁹⁹

127

Tabela 24. Charakterystyka fenotypowa i genotypowa wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej z kiszonki z kukurydzy II i III

Charakterystyka Opis Obraz mikroskopowy

MYK 210 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, występujące pojedynczo lub tworzące krótkie

łańcuszki

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus plantarum

Procent

identyfikacji ⁹⁹

MYK 220 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo lub w parach, tworzą

krótkie łańcuszki

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus buchneri

Procent

identyfikacji ⁹⁹

MLK 304 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo, w parach lub w krótkich

łańcuszkach, tworzą układy V i Y

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus plantarum

Procent

identyfikacji ⁹⁹

MLK 306 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo, w parach lub palisadach,

tworzą krótkie łańcuszki i układy V

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus plantarum

Procent

identyfikacji ⁹⁹

MLK 324 Morfologia

gramdodatnie pałeczki, krótkie, końce zaokrąglone, wsytępujące pojedynczo, w parach lub palisadach,

tworzą krótkie łańcuszki

Test na obecność

katalazy ^ujemny

Gatunek Lactobacillus buchneri

Procent

identyfikacji ⁹⁹

128

Zidentyfikowane w niniejszej pracy gatunki bakterii o właściwościach antygrzybowych często są izolowane z surowców lub produktów pochodzenia roślinnego. Podobne rezultaty uzyskali inni autorzy. Crowley i.in., (2013) w swojej pracy również zaobserwowali dominację L. plantarum, jako najliczniejszej grupy bakterii kwasu mlekowego, charakteryzujących się wysoką aktywnością fungistatyczną, natomiast mniejszą grupę stanowiły bakterie z rodzaju Weisella confusa i P. pentosaceus. Sathe i in. (2007), badając bakterie fermentacji mlekowej pochodzących ze świeżych ważyw, zidentyfikowali szczepy takie jak L. plantarum, L. paracollinoides, P. pentosaceus oraz W. paramessenteroides. Bardzo różnorodną gatunkowo grupę bakterii kwasu mlekowego, zidentyfikowali w swoich badaniach Ennahar, Cai i Fujita (2003). Analizując przynależność genetyczną LAB wyizolowanych z kiszonki ryżowej, stwierdzili obecność bakterii z rodzaju Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Weissella, Enterococcus oraz Leuconostoc. Ni, Wang, Cai i Pang. (2015) wykazali, że izolowane bakterie z kiszonki z pszenicy, w dużej mierze zdominowane były (w 66,7%) przez heterofermentatywne bakterie takie jak Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc citreum, Weissella cibaria i Lactobacillus buchneri. Oprócz wspomnianych szczepów autorzy zidentyfikowali również szczepy LAB takie jak Lactococcus lactis subsp. Lactis oraz Lactobacillus plantarum subsp. plantarum. Przewagę różnorodnych gatunków bakterii fermentacji mlekowej, w zależności od źródła izolacji, zaprezentowali w swoich badaniach Pang i in. (2012). Analizując przynależność gatunkową LAB izolowanych ze świeżych roślin paszowych wykazali, że w przypadku kukurydzy dominowały bakterie Weissella paramesentroides, w lucernie Leuconostoc pseudomesentroides, w koniczynie Lactococcus lactis subs. lactis, natomiast w sparcecie dominowały bakterie z rodzaju L. paraplantarum i L. brevis. Bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Weissella, Leuconostoc, Lactobacillus i Pediococcus, obok bakterii innych gatunków, zostały zidentyfikowane w świeżych i zakiszanych materiałach z kukurydzy, lucerny i życicy włoskiej, w badaniach zaprezentowanych przez Ni i in. (2017). Z dostępnych danych literaturowych wynika, że zarówno świeże materiały roślinne, jak i kiszonki, są zasiedlane przez zrożnicowane gatunki bakterii fermentacji mlekowej. W zależności od prowadzonych doświadczeń, można zaobserwować duże zroźnicowanie gatunkowe, w przypadku zwykłej identyfikacji izolowanych bakterii, lub węższą grupę określonych gatunków, w przypadku identyfikacji bakterii o określonych właściwościach, co zostało również zaobserwowane w niniejszej pracy.

129

7.4. Określenie możliwości praktycznego zastosowania wybranych izolatów bakterii