Identyfikacja fizjologicznych substratów dla holdazowej aktywności

Poszukiwanie fizjologicznych substratów dla holdazowej aktywności opiekuńczej AtDeg2 wykonano za pomocą podejścia eksperymentalnego w oparciu o elektroforezę diagonalną, tj. rodzaj analizy dwukierunkowej użytecznej dla badania składu podjednostek wieloskładnikowych białek zawierających międzybiałkowe wiązania dwusiarczkowe. Białka, które są połączone międzycząsteczkowymi mostkami dwusiarczkowymi migrują w drugim kierunku poniżej przekątnej żelu. Zastosowanie elektroforezy diagonalnej w poszukiwaniu fizjologicznych substratów białkowych dla aktywności opiekuńczej AtDeg2 jest oparte na założeniu, że:

 AtDeg2 poprzez swoją aktywność holdazową może uczestniczyć – u roślin WT poddanych działaniu stresu wysokiego natężenia światła – w hamowaniu agregacji białko-białko poprzez mostki dwusiarczkowe (przykładem potwierdzającym, że białka chloroplastowe mogą ulegać w warunkach stresu agregacji poprzez mostki dwusiarczkowe jest homogagregacja LS Rubisco zachodząca u zielenic Chlamydomonas poddanych działaniu nadtlenku wodoru – Esquivel i wsp., 2006 – oraz u roślin A. thaliana podddanych działaniu stresu zmiany natężenia światła z umiarkowanego na niskie – Grabsztunowicz i wsp., 2015),

 AtDeg2 pozbawione aktywności holdazowej – w roślinach 35S:AtDEG2^ΔPDZ1 -GFP 4.23 poddanych działaniu stresu wysokiego natężenia światła – może być całkowicie lub częściowo niezdolne do hamowania agregacji białko-białko poprzez mostki dwusiarczkowe.

Opierając się na powyższych założeniach, fizjologiczne substraty dla aktywności opiekuńczej identyfikowano jako białka wyizolowane z chloroplastów liści transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 rosnących w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu, które:

 migrują poniżej przekątnej żelu po elektroforezie diagonalnej białek wyizolowanych z chloroplastów liści transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 rosnących w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu,

 występują znacznie bardziej obficie niż w chloroplastach roślin WT.

Zgodnie z powyższym lizaty chloroplastów z liści roślin obu genotypów w podfazie 6.0 rozdzielono za pomocą elektroforezy diagonalnej i przez porównawczą analizę żeli wykryto białko reprezentowane przez plamkę, która:

1) znajdowała się poniżej przekątnej żelu i

2) była prawie trzykrotnie intensywniejsza na żelach z rozdzielonymi lizatami chloroplastowymi transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 niż na żelach, w których rozdzielono lizaty z roślin WT (Rysunek 52).

Białko to zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas jako podjednostkę γ1

kompleksu F1 syntazy ATP (Tabela 10 i Rysunek 53A), która tak jak AtDeg2 znajduje się na powierzchni błony tylakoidowej od strony stromy, a w swojej strukturze posiada 3 reszty cysteinowe (Rysunek 53B), z których część mogła uczestniczyć w procesie tworzenia homoagregatów podjednostki γ1 syntazy ATP.

Uzyskany wynik wskazuje, że podjednostka γ1 kompleksu F1 syntazy ATP jest substratem aktywności holdazowej AtDeg2, tzn., że AtDeg2 może hamować agregację za pośrednictwem mostków dwusiarczkowych podjednostek γ1 syntazy ATP, do jakiej może dochodzić w warunkach ekspozycji roślin na światło o wysokim natężeniu.

Istnieje jednak alternatywna możliwość wytłumaczenia akumulacji w chloroplastach transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 znacznych ilości podjednostki γ1 syntazy ATP, większych niż w przypadku chloroplastów roślin WT, mianowicie niższa aktywność reduktazy dwusiarczkowej w chloroplastach transformantów. Do białek o aktywności reduktazy dwusiarczkowej należą tioredoksyny oraz glutaredoksyny, które poprzez tą aktywność działają antyoksydacyjnie, redukując drogą tzw. wymiany tiolowo-dwusiarczkowej mostki dwusiarczkowe powstające wewnątrz białek lub pomiędzy białkami chloroplastowymi w wyniku stresu oksydacyjnego (Rouhier, 2010). Niższa aktywność reduktazy dwusiarczkowej w chloroplastach transformantów prowadziłaby do mniej efektywnego – w porównaniu z roślinami WT – usuwania powstających agregatów podjednostki γ1 syntazy ATP, co z kolei prowadziłoby do wyższego poziomu agregatów tego białka u transformantów (w porównaniu z roślinami WT).

Rysunek 52. Identyfikacja substratów dla holdazowej aktywności opiekuńczej AtDeg2. Chloroplasty (wyizolowane z liści roślin WT i transformantów 35S:AtDEG2ΔPDZ1-GFP 4.23, które hodowano w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu do momentu otwarcia się pierwszego kwiatu – podfaza 6.0) poddano lizie osmotycznej, a próbki lizatów rozdzielono za pomocą elektroforezy diagonalnej. Ilość preparatów lizatów normalizowano w oparciu o taką samą ilość białka. Żele wybarwiono za pomocą techniki Blue Silver i analizowano densytometrycznie. Strzałki wskazują lokalizację na żelach białka, któregosygnał dla lizatu chloroplastów roślin35S:AtDEG2ΔPDZ1-GFP4.23byłistotnie intensywniejszy niżw przypadku lizatu chloroplastów roślin WT (100%). M – markery masy cząsteczkowej; kDa – kilodaltony.

Tabela 10. Wynik spektrometrii mas wykrytej plamki

Białko Wartość

score Pokrycie

sekwencji Masa

białka Lokalizacja

wewnątrzchloroplastowa ATPC1 | ATPaza,

kompleks F1, podjednostka γ1

1660 41% 41kDa Stroma

Rysunek 53. Struktura krystaliczna kompleksu F0 i F1 chloroplastowej syntazy ATP ze Spinacia oleracea (PDB ID: 6FKH) z wyróżnioną kolorem niebieskim podjednostką γ1 (z prawej strony) (A) oraz sekwencja aminokwasowa podjednostki γ1 (At4G04640, na podstawie Hisabori i wsp., 2013) chloroplastowej syntazy ATP A. thaliana z wyróżnionymi kolorem żółtym resztami cysteinowymi (B). Wizualizację struktury krystalicznej otrzymano z bazy danych PDBe (http://www.ebi.ac.uk/pdbe/node/1).

Test na aktywność reduktazy dwusiarczkowej wykonano z wykorzystaniem insuliny, która w obecności DTT ulega spontanicznej agregacji. Wynika to z faktu, że łańcuchy A i B w strukturze insuliny połączone są mostkami dwusiarczkowymi, których redukcja prowadzi do denaturacji i agregacji wolnych łańcuchów B. Reakcja ta może być katalizowana przez białka o aktywności reduktazy dwusiarczkowej, prowadząc do zwiększenia stopnia agregacji insuliny. Poziom powstających agregatów może być oznaczony przez pomiar absorpcji światła o długości 650 nm spowodowanej rozproszeniem światła przez powstające w mieszaninie inkubacyjnej agregaty białkowe (Holmgren, 1979). W badaniach wstępnych wykazano, że do spontanicznej agregacji dochodzi po 25-30 minutach inkubacji insuliny w obecności DTT. Rozproszenie światła obserwowane w 30 minucie inkubacji uznano za 100%.

Do analizy aktywności reduktazy dwusiarczkowej wykorzystano stromę chloroplastową uzyskaną z liści roślin WT i transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 (hodowanych w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu w momencie otwarcia się pierwszego kwiatu), gdyż chloroplastowe białka o aktywności reduktazy dwusiarczkowej tj. tioredoksyny i glutaredoksyny są białkami zlokalizowanymi w stromie (Rouhier, 2010; Nikkanen i Rintamäki, 2014). Obecność białek o aktywności reduktazy dwusiarczkowej zgodnie z oczekiwaniem doprowadziła po 30 minutach do wzrostu rozproszenia światła przez mieszaninę inkubacyjną do poziomu wyższego niż obserwowany w obecności tylko insuliny i DTT. Poziom agregatów insuliny w mieszaninie zawierającej stromę roślin WT nie różnił się w sposób istotny statystycznie od poziomu agregatów w mieszaninie zawierającej stromę transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23. Oznacza to, że zwiększony poziom homoagregatu podjednostek γ1 syntazy ATP u transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23 nie jest efektem obniżonej aktywności reduktazy dwusiarczkowej.

A zatem wyniki opisane powyżej wskazują, że:

 wersja rekombinowana AtDeg2 ΔPDZ1 nie posiada aktywności holdazowej, ale jest aktywna proteolitycznie,

 w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu w chloroplastach transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23, zagregowane za pośrednictwem mostków dwusiarczkowych podjednostki γ1 syntazy ATP

gromadzą się na trzykrotnie wyższym poziomie niż w chloroplastach roślin WT,

 efekt ten nie jest wynikiem niższej aktywności reduktazy dwusiarczkowej w chloroplastach transformantów 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23, lecz najprawdopodobniej nieefektywnego hamowania powstawania agregatów wynikającego z posiadania AtDeg2 pozbawionego aktywności holdazy.

Rysunek 54. Aktywność reduktazy dwusiarczkowej w chloroplastach roślin WT oraz 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23. Chloroplasty (wyizlowowane z roślin WT i 35S:AtDEG2^ΔPDZ1-GFP 4.23, które hodowano w warunkach ekspozycji na światło o wysokim natężeniu do momentu otwarcia się pierwszego kwiatu – podfaza 6.0) poddano lizie osmotycznej, a lizaty frakcjonowano. Aktywność reduktazy dwusiarczkowej analizowano, inkubując przez 0-30 min mieszaninę zawierającą insulinę wołową, DTT i stromę chloroplastową. Poziom powstających agregatów łańcuchów B insuliny rejestrowano, mierząc zmiany absorpcji światła mieszanin inkubacyjnych przy 650 nm, do jakich dochodzi na skutek rozproszenia światła przez powstające agregaty. Gwiazdki oznaczają istotność różnicy poziomu agregatów pomiędzy mieszaninami zawierającymi preparaty stromy, insuliny i DTT a mieszaniną zawierającą tylko insulinę i DTT (p < 0,01).