Kolekcja plazmidów opornościowych w komórkach E. coli DH5α

Kolekcję plazmidów opornościowych pochodzących z badanych środowisk próbowano założyć na trzy sposoby. Dwa pierwsze miały pozwolić na uzyskanie plazmidów R z metaplazmidomów (bez etapu namnażania mikroorganizmów) poprzez: (1) bezpośrednią koniugację mikroflory badanych środowisk z wybranym biorcą oraz (2) transformację plazmidowego DNA izolowanego bezpośrednio z próbek do wybranego biorcy. Jednak żadna z wymienionych metod nie pozwoliła na uzyskanie pożądanego celu.

Kolekcję plazmidów opornościowych założono dopiero po elektroporacji komórek E. coli DH5α uprzednio wyizolowanym ze wzbogaconych kultur plazmidowym DNA. Należy zaznaczyć, że zastosowanie jednego konkretnego gospodarza (E. coli) jest dużym ograniczeniem puli pozyskiwanych plazmidów (Smalla i in., 2015). Wychwycono tylko te

Dyskusja 80 badanych metagenomach udział plazmidów zdolnych do replikacji i ekspresji w komórkach E. coli był na tyle niski, że zastosowanie metod bez hodowli wzbogaconych nie pozwoliło na wychwycenie tych wektorów. Natomiast wprowadzenie etapu hodowli badanej mikroflory w bogatym podłożu, jakim jest LB i w obecności ampicyliny przyczyniło się do proliferacji heterotroficznych mikroorganizmów opornych na ten antybiotyk (w tym posiadających plazmidy opornościowe).

Pomyślnie przeniesiono plazmidy opornościowe z próbek ścieków surowych, osadu czynnego, ścieków oczyszczonych, wód Soły oraz osadów Soły i jeziora. Natomiast (pomimo zastosowania metody z hodowlą wzbogaconą) nie powiódł się transfer plazmidów izolowanych z próbek wody jeziora. To niepowodzenie mogło być spowodowane najniższym wśród badanych metagenomów środowiskowych udziałem genów warunkujących oporność na β-laktamy w wodach jeziora, co wykazała analiza metagenomiczna. Natomiast wyizolowanie plazmidów opornościowych z osadu jeziora może świadczyć o kumulowaniu się ARGs w populacjach bakterii zasiedlających osady denne. Na co również wskazują wyniki metody płytkowej.

W kolekcji plazmidów niosących oporność na ampicylinę znalazło się łącznie 56 wektorów. Na podstawie typowania replikonów 10 spośród nich przypisano do grup niezgodności. 8 plazmidów pochodzących z wód Soły (pSŁWa/b/c/e/f/h/i/ł) należało do grupy IncF, natomiast 1 wyizolowany ze ścieków oczyszczonych (pŚOe) i 1 z osadu jeziora (pJOh) przypisano do grupy IncN. Podobnie typowanie replikonów niesionych przez oporne na β-laktamy bakterie izolowane z angielskiej rzeki wykazało największy udział plazmidów z grupy IncF (Amos i in., 2014a). Co więcej tę grupę plazmidów powiązano z rozprzestrzenianiem β-laktamaz CTX-M, których różnorodność w wodzie Soły była wysoka. Plazmidy należące do grupy IncF mają wąski, bo ograniczony do rodziny Enterobacteriaceae, zakres gospodarza i są powszechnie spotykane zarówno u szczepów pochodzących od ludzi, jak i od zwierząt. Wąski zakres gospodarzy tłumaczy brak zaobserwowanych transkoniugantów po przeprowadzonej koniugacji z A. tumefaciens. Wektory pSŁWc i pSŁWh warunkowały oporność na ceftazydym (cefalosporynę III generacji), ale nie na meropenem (karbapenem). Wrażliwość na karbapenemy i jednoczesna oporność na cefalosporynę III generacji może wskazywać na aktywność β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (Bush i Jacoby, 2010).

Oprócz warunkowania antybiotykooporności, plazmidy IncF często odpowiadają za

Dyskusja 81 Woerther i in., 2013).

Choć w przeszłości wektory z grupy IncN częściej występowały u bakterii kałowych izolowanych od zwierząt, obecnie odgrywają one coraz większą rolę w rozprzestrzenianiu antybiotykooporności wśród izolatów klinicznych (Eikmeyer i in., 2012). Z tymi wektorami powiązano m.in. geny kodujące β-laktamazy KPC, które dominowały w wodzie jeziora (Carattoli, 2009, 2013). Z największą częstością z oczyszczalni ścieków izolowano plazmidy należące do IncP. Te zdolne do własnego transferu plazmidy zostały już dobrze opisane (Schlüter i in., 2007). Natomiast plazmidy z grupy IncN w oczyszczalniach obserwowano znacznie rzadziej. 4 wektory należące do grupy IncN wyizolowano ze ścieków oczyszczonych z oczyszczalni w Bielefeld (Niemcy).

Charakteryzowały się one wąskim zakresem gospodarzy oraz bardzo wysoką częstością koniugacji (0,3-0,5), a także niosły oporność na wiele antybiotyków (Eikmeyer i in., 2012).

Należący do tej samej grupy plazmid pŚOe również wykazywał najwyższą obserwowaną częstość koniugacji. Jednak była ona aż o 6 rzędów wielkości niższa niż w przypadku wektorów pochodzących z Bielefeld. Plazmidy pŚOe i pJOh nie niosły oporności na karbapenem, co oznacza, że nie kodowały β-laktamaz typu KPC. Omawiane wektory warunkowały także oporność na ciprofloksacynę (fluorochinolon). Geny warunkujące oporność na ten antybiotyk obserwowano również u innych plazmidów należących do tej grupy niezgodności (Eikmeyer i in., 2012).

Dwa inne pochodzące z wód Soły replikony (pSŁWd, pSŁWj), których przynależności nie udało się ustalić, wykazywały zdolność do koniugacyjnego transferu.

U pSŁWd stwierdzono najwyższą częstość koniugacji wśród plazmidów izolowanych z tego środowiska (2,07x10^-6±5,68x10^-7). Ponadto oprócz oporności na ampicylinę warunkował on również niewrażliwość na ceftazydym, co może świadczyć o aktywności β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym. Podobną sytuację zaobserwowano u transformanta niosącego mobilizowalny plazmid pOCZc.

Plazmidy niezdolne do własnego transferu mogą zostać zmobilizowane do przeniesienia przez współistniejące z nimi w komórce plazmidy koniugacyjne. Wyniki doświadczenia z zastosowaniem szczepu E. coli S17-1 jako dawcy badanych plazmidów wykazały, że aż 40 spośród 43 niezdolnych do własnego przeniesienia plazmidów zostało zmobilizowanych do transferu. Co interesujące najwyższy udział plazmidów mobilizowalnych obserwowano wśród wektorów wyizolowanych z próbek z oczyszczalni

Dyskusja 82 uzyskanych z wód Soły to plazmidy koniugacyjne.

Zakres gospodarzy plazmidów koniugacyjnych sprawdzono jedynie z zastosowaniem A. tumefaciens (Alphaproteobacteria). Było to związane z trudnościami w pozyskaniu odpowiednich szczepów biorców, które z jednej strony posiadałyby właściwy marker umożliwiający selekcję, a z drugiej byłyby niewrażliwe na ampicylinę.

Powszechna oporność na ampicylinę wśród bakterii środowiskowych wykluczyła także możliwość zastosowania środowiskowych izolatów znajdujących się w kolekcji Katedry Mikrobiologii. Określenie potencjalnego zakresu gospodarzy było możliwe w przypadku tych wektorów, które udało się zaklasyfikować do grup niezgodności.

Zastosowanie wektorów pułapkowych umożliwia identyfikację funkcjonalnych elementów transpozycyjnych. Wykorzystany w badaniach pMAT1 został skonstruowany z użyciem mobilizowalnego plazmidu pBBR1MCS-2 o szerokim zakresie gospodarzy.

Umożliwia on wychwycenie wszystkich typów elementów transpozycyjnych. Za pomocą pMAT1 uzyskiwano elementy transpozycyjne z takich rodzajów, jak Halomonas, czy Paracoccus (Sołyga i Bartosik, 2004; Szuplewska i Bartosik, 2009; Dziewit i in., 2012; Dziewit i in., 2013;). Z wykorzystaniem wektora pułapkowego pMAT1 nie uzyskano niosących oporność na ampicylinę elementów transpozycyjnych z żadnego z badanych plazmidów. Plazmidowo kodowane geny warunkujące oporność na wspomniany antybiotyk mogą być ulokowane poza elementami transpozycyjnymi, bądź też te elementy nie są aktywne np. z powodu mutacji.