Meta-omiki – nowe strategie w analizie mikrobiomu i właściwości funkcjonalnych fermentowanych warzyw
3. Meta-omiczne badania fermentowanych warzyw
Istnieją różne rodzaje fermentowanych warzyw na całym świecie, na przykład kimchi w Korei, Doubanjiang i Paocai w Chinach i soido w Indiach (Chen i in. 2017). Różne typy bakterii kwasu mlekowego, takie jak Leuconostoc, Lactobacillus, Weissella, zostały zidentyfikowane i zastosowane w fermentowanych warzywach. Poza licznymi analizami sukcesji drobnoustrojów, omiczne podejścia zostały zastosowane w kilku fermentowanych warzywach w ostatniej dekadzie, a ich wyniki mogą wpłynąć na poprawę jakości i bezpieczeństwa otrzymanych produktów.
Badano zmiany związków smakowych, aminokwasów i różnorodności drobnoustrojów w chińskiej suan-cai podczas jej naturalnej fermentacji (Chen i in. 2017). Analiza GC-MS wykazała ponad dwukrotny wzrost lotnych składników smakowych w środkowym etapie fermentacji, a największą różnorodność stanowiły estry i aldehydy, które determinowały aromat suan-cai. PCR-DGGE zidentyfikował większą liczbę i różnorodność bakterii niż grzybów, z 14 gatunkami bakterii z rodzajów Leuconostoc, Bacillus, Pseudomonas i Lactobacillus oraz gatunkami grzybów jak Debaryomyces hansenii, Candida tropicalis i Penicillium expansum. Występowanie bakterii i związków smakowych zostało przeanalizowane i skorelowane w Doubanjiang, chińskiej tradycyjnej paście z czerwonej papryki (Li i in. 2016). Bakterie kwasu mlekowego i rodzinę Enterobacteriaceae zidentyfikowano za pomocą metody PCR-DGGE. Sekwencjonowanie amplikonu dopasowało podstawowy mikrobiom do gromady Proteobacteria, Cyanobacteria i Firmicutes. Metodą mikroekstrakcji do fazy stałej w połączeniu z GC-MS (HS-SPME-GC-MS) wyizolowano i zidentyfikowano łącznie 29 lotnych związków organicznych, głównie alkoholi, estrów, aldehydów, ketonów i fenoli. Wysoce kowariancyjną zależności pomiędzy lotnymi związkami a taksonami bakteryjnymi ujawniono metodą częściowej regresji najmniejszych kwadratów i współczynnikiem korelacji Pearsona. Wykazano, że rodzaj Pseudomonas najbardziej istotnie związany był z 3-metylo-butanalem, 2-metylo-3-metylo-butanalem, benzenoacetaldehydem i 2-acetylopirolem (P <0,001) i znacząco skorelowany z 5-metylofurfuralem i 5-metylo-2-fenylo-2-hekselem (P <0,01). Metodę metabolomiczną opartą na GC-MS zastosowano w tradycyjnym chińskim Paocai w celu zidentyfikowania związków jako markerów decydujących o jego smaku (Zhao i in. 2016). Jako markery smaku, kwas glutaminowy (umami), sacharoza (słodki), glicyna (słodki), kwas mlekowy (kwaśny) i kwas γ-aminomasłowy znacznie wzrosły w wyniku wzrostu cokultury LAB (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri i Pediococcus ethanoliduran). Ten raport zintegrował określone LAB i ich metabolity mające istotny udział w kreowaniu cech smakowych, a zatem może ułatwić wstępny skrining i optymalizację procesu fermentacji.
Kimchi to warzywa (kapusta, por, rzodkiewka itp.) z dodatkiem różnych przypraw (mielona papryka czerwona, czosnek, imbir itp.) fermentowane spontanicznie lub z udziałem kultury starterowej. Zmiany metaboliczne w kimchi były śledzone podczas fermentacji lub długoterminowego przechowywania i skorelowane z sukcesją drobnoustrojów w kilku badaniach (Jeong i in. 2013a, 2013b; Park i in. 2016). W dongchimi, koreańskiej wodnistej kimchi, analiza mikrobiologiczna za pomocą pirosekwencjonowania ujawniła Leuconostoc jako dominujący rodzaj podczas 100-dniowej fermentacji (Jeong i in. 2013a). Tymczasem analiza metabolitów za pomocą 1H NMR wykazała, że stężenia wolnych cukrów (fruktoza i glukoza) gwałtownie wzrosły; natomiast po 30 dniach fermentacji, szybkie zużywanie wolnych cukrów i wytwarzanie glicerolu oraz etanolu obserwowano równocześnie ze wzrostem Saccharomyces. Podobną obserwację opisano w 120-dniowej fermentacji i przechowywaniu kimchi (Jeong i in. 2013b). Różnorodne LAB, w tym Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus i Weissella przyczyniły się do obniżenia pH podczas
wczesnego etapu fermentacji. Spadek występowania bakterii i wzrost ilości Saccharomyces obserwowano jednocześnie ze zwiększonym zużyciem cukru i produkcją glicerolu i etanolu. Analiza
1H NMR wykazała, że kwasy organiczne, mannitol i kwas gamma-aminomasłowy (GABA) zostały wytworzone podczas fermentacji, a szczepy Leuconostoc i Lactobacillus sakei zostały zidentyfikowane jako producenci odpowiednio mannitolu i GABA. W celu oceny wpływu kultury starterowej Lactobacillus plantarum na kimchi, zastosowano GC-MS i wielowymiarową analizę statystyczną (PCA) (Park i in. 2016). Jego wpływ na metabolomikę obejmował wzrost poziomu kwasu mlekowego, glicerolu i spadku waliny, leucyny, kwasu cytrynowego i sacharozy podczas fermentacji.
Wykorzystanie metod metagenomicznych i metatranskryptomicznych w kimchi ujawniło interesujące wyniki (Jung i in. 2011, 2013). Jung i in. (2011) opisali analizę metagenomiczną za pomocą układu 454 GS FLX Titanium i skorelowali ją z analizą metaboliczną uzyskaną metodą 1H NMR podczas 29-dniowego procesu fermentacji. Analiza filogenetyczna oparta na genach 16S rRNA z metagenomu wykazała, że dominowały rodzaje takie jak, Leuconostoc, Lactobacillus i Weissella.
Przypisanie sekwencji metagenomowych ujawniło profil genetyczny charakterystyczny dla heterotroficznej fermentacji mlekowej węglowodanów, co było zgodne z wykrywaniem w próbkach mannitolu, mleczanu, octanu i etanolu jako produktów fermentacji. Większość sekwencji metagenomicznych kimchi wykazała bardzo wysoką identyczność z genami Leuconostoc mesenteroides i Lactobacillus, co wskazuje na znaczenie tych dwóch rodzajów bakterii w fermentacji kimchi. Zaskakująco zidentyfikowano również dużą liczbę sekwencji faga DNA w metagenomowym zbiorze danych, co sugeruje infekcję bakteriofagów podczas fermentacji jako złożonych społeczności mikroorganizmów. Kompletne sekwencje genomu sześciu reprezentatywnych bakterii kwasu mlekowego (LAB), Leuconostoc (Lc.) mesenteroides, Lactobacillus (Lb.) sakei, Weissella (W.) koreensis, Lc. gelidum, Lc. carnosum i Lc. gasicomitatum, zostały wykorzystane jako genomy odniesienia w celu zbadania profili metatranskryptomicznych w pięciu etapach 29-dniowej fermentacji. Odczyty sekwencjonowania mRNA mapowano na genomy sześciu szczepów LAB i wykazano, że podczas wczesnej fazy fermentacji Lc. mesenteroides był najbardziej aktywnym gatunkiem, podczas gdy ekspresje genów Lb. sakei i W. koreensis była wysoka podczas późniejszych etapów procesu. Przypisanie sekwencji mRNA szlakom metabolicznym ujawniło, że wiele genów związanych z transportem węglowodanów i hydrolizą oraz fermentacją mleczanową ulegało aktywnej ekspresji, co wskazuje na typową fermentację kwasu mlekowego. Geny dehydrogenazy mannitolu (mdh) zidentyfikowano u wszystkich gatunków Leuconostoc, a zwłaszcza Lc. mesenteroides, który zawierał trzy kopie mdh o różnych wzorach ekspresji. Powyższe informacje wskazują, że wyniki analiz metagenomicznych i metatranskryptomicznych zwiększają wiedzę na temat aktywnych populacji i ekspresji genów w procesie fermentacji kimchi (Jung i in. 2013).
4. Podsumowanie
Wzrasta liczba publikacji wykorzystujących metagenomikę, metatranskryptomikę i metaproteomikę w badaniach fermentowanej żywności. Takie podejścia są jednak zależne od dostępności odpowiednich referencyjnych baz danych genomu, z którymi można porównać odczytane sekwencje lub dane widm masowych. Bez odpowiednich referencyjnych baz danych genomu część danych sekwencjonowania lub danych widm masowych byłaby daremna. Na przykład, analiza metagenomiczna mikroflory w dwóch tureckich ziarnach kefiru zmapowała 88,16% i 93,81%
odczytów, ale odczytała 4 Mpb danych, które nie wykazywały żadnej homologii ze znanymi sekwencjami bakteryjnymi (Nalbantoglu i in. 2014). Na szczęście w ciągu ostatnich kilku lat opisano sekwencje całych genomów i analizę porównawczą genomów u coraz większej liczby drobnoustrojów wyizolowanych z fermentowanej żywności, takich jak bakterie kwasu octowego i pałeczki Lactobacillus, pochodzące ze spontanicznej fermentacji ziaren kakaowca. Taka analiza genomowa pojedynczego szczepu stanowi podstawę jako genom odniesienia dla przyszłej analizy transkryptomicznej i proteomicznej, jak również metagenomicznej, metatranskryptomicznej i metaproteomicznej (Chen i in. 2017).
Tradycyjna fermentowana żywność jest cennym źródłem genów dla naturalnych środków konserwujących, takich jak bakteriocyny, które zapobiegają zanieczyszczeniu i psuciu się żywności.
Przy użyciu starterów PCR ukierunkowanych na konserwatywne motywy, kilka homologów bakteriolizyn amplifikowano z metagenomowego DNA sześciu chińskich tradycyjnych fermentowanych produktów (Zhang i in. 2013). Nienaruszone geny dla enterolizyny A i helweryny J zostały sklonowane, a rekombinowane białko wykazywało aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko patogenom, w tym Listeria monocytogenes i Staphylococcus aureus. W innym przykładzie, analiza genomowa trzech genomów Weissella cibaria zidentyfikowała szereg genów fosfotransferazy nadających zdolność asymilacji związanego z rośliną polisacharydu i rozległego układu proteolitycznego (Lynch i in. 2015). Tak więc sfermentowane produkty spożywcze są bogatym źródłem cennych genów, składników funkcjonalnych i substancji bioaktywnych oczekujących na dalszą eksplorację.
Wciąż istnieją pewne ograniczenia obecnej analizy meta-omicznej, takie jak ograniczenie wykrywalności gatunków o niskiej liczebności, niska rozdzielczość metaproteomiki, zwykle kilka powtórzeń biologicznych ze względu na wysokie koszty. Jednakże, w oparciu o postępy w sekwencjonowaniu i technologiach MS, większą dostępność sekwencji genomu, a także silną interpretację danych bioinformatycznych i statystycznych, pewne jest, że zintegrowane podejścia meta-omiczne, w tym metagenomika, metatranskryptomika, metaproteomika i metabolomika, oferują szeroki zakres zastosowań w złożonym systemie fermentowanej żywności. Doprowadzą one do szczegółowej charakterystyki funkcjonalnej oraz bardziej wydajnych i zrównoważonych praktyk produkcyjnych produktów w nadchodzącym dziesięcioleciu.
5. Literatura
Ahn GH, Moon JS, Shin SY i in. (2015) A competitive quantitative polymerase chain reaction method for characterizing the population dynamics during kimchi fermentation. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 42: 49-55.
Alessandria V, Ferrocino I, De Filippis F i in. (2016) Microbiota of an Italian Grana-like cheese during manufacture and ripening, unraveled by 16S rRNA-Based approaches. Applied and Environmental Microbiology 82: 3988-3995.
Chen G, Chen C, Lei Z (2017) Meta-omics insights in the microbial community profiling and functional characterization of fermented foods. Trends in Food Science & Technology 65: 23-31.
Franzosa EA, Hsu T, Sirota-Madi A i in. (2015) Sequencing and beyond: Integrating molecular 'omics' for microbial community profiling. Nature Reviews Microbiology 13: 360-372.
Jeong SH, Jung JY, Lee SH i in. (2013a) Microbial succession and metabolite changes during fermentation of dongchimi, traditional Korean watery kimchi. International Journal of Food Microbiology 164: 46-53.
Jeong SH,, Lee, SH, Jung JY i in. (2013b) Microbial succession and metabolite changes during long-term storage of kimchi. Journal of Food Science 78: 763-769.
Jung JY, Lee SH, Jin HM i in. (2013) Metatranscriptomic analysis of lactic acid bacterial gene expression during kimchi fermentation. International Journal of Food Microbiology 163: 171-179.
Jung JY, Lee SH, Kim JM i in. (2011) Metagenomic analysis of kimchi, a traditional Korean fermented food. Applied and Environmental Microbiology 77: 2264-2274
Li Z, Dong L, Huang Q I in. (2016) Bacterial communities and volatile compounds in Doubanjiang, a Chinese traditional red pepper paste. Journal of Applied Microbiology 120: 1585-1594.
Lynch KM, Lucid A, Arendt EK i in. (2015) Genomics of Weissella cibaria with an examination of its metabolic traits. Microbiology-Sgm 161: 914-930.
Mangiapane E, Mazzoli R, Pessione A i in. (2015) Ten years of subproteome investigations in lactic acid bacteria: A key for food starter and probiotic typing. Journal of Proteomics 127: 332-339.
Mozzi F, Ortiz ME, Bleckwedel J i in. (2013) Metabolomics as a tool for the comprehensive understanding of fermented and functional foods with lactic acid bacteria. Food Research International 54: 1152-1161
Nair MRB, Chouhan D, Sen Gupta S i in. (2016) Fermented foods: Are they tasty medicines for helicobacter pylori associated peptic ulcer and gastric cancer? Frontiers in Microbiology, 7 (2016), p. 1148
Nalbantoglu U, Cakar A, Dogan H i in. (2014) Metagenomic analysis of the microbial community in kefir grains. Food Microbiology 41: 42-51.
Park SE, Yoo SA, Seo SH i in. (2016) GC-MS based metabolomics approach of Kimchi for the understanding of Lactobacillus plantarum fermentation characteristics. Lwt-Food Science and Technology 68: 313-321.
Tamang JP, Watanabe K, Holzapfel WH (2016) Review: Diversity of microorganisms in global fermented foods and beverages. Frontiers in Microbiology 7: 1-28.
Wang Z, Zang N, Shi JY i in. (2015) Comparative proteome of acetobacter pasteurianus Ab3 during the high acidity rice vinegar fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology 177: 1573-1588.
Wilmes P, Heintz-Buschart A, Bond PL (2015) A decade of metaproteomics: Where we stand and what the future holds. Proteomics 15: 3409-3417.
Wolfe BE, Button JE, Santarelli M i in. (2014) Cheese rind communities provide tractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity. Cell 158: 422-433.
Zhang T, Pan Y, Li B i in. (2013) Molecular cloning and antimicrobial activity of enterolysin A and helveticin J of bacteriolysins from metagenome of Chinese traditional fermented foods. Food Control 31: 499-507.
Zhao N, Zhang CC, Yang Q i in. (2016) Selection of taste markers related to lactic acid bacteria microflora metabolism for Chinese traditional Paocai: A gas chromatography-mass spectrometry -based metabolomics approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry 64: 2415-2422.