Metabolizm pochodnych bisakrydyny wobec enzymów mikrosomalnych

Na tym etapie badań w pierwszej kolejności przeprowadzono doświadczenia mające na celu zoptymalizowanie procedury pod kątem określenia:

• końcowego stężenia bisakrydyny w mieszaninie reakcyjnej,

• końcowego stężenia NADPH w mieszaninie reakcyjnej,

• środowiska reakcji enzymatycznej (rodzaj buforu o pH 7,4)

• warunków zatrzymywania reakcji enzymatycznej,

• czasu inkubacji.

Ze względu na to, iż przyjęte do badań pochodne w porównaniu do ich monomerycznych substratów wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne, takie jak rozpuszczalność, właściwości kwasowo-zasadowe oraz charakter widm UV-vis, optymalizacja warunków prowadzenia reakcji enzymatycznej okazała się procesem bardzo czasochłonnym. W efekcie wielu serii eksperymentów określono najkorzystniejsze warunki dla przebiegu badanych reakcji enzymatycznych jako:

• 0,05 mM bisakrydyny,

• 2mM NADPH,

• bufor HEPES o pH 7,4,

• zatrzymanie enzymów mikrosomalnych poprzez dodatek 1 M kwasu solnego.

IV.4.1. Metabolizm pochodnych bisakrydyny C-2028, C-2041, C-2045 i C-2053 wobec nieaktywowanych enzymów mikrosomalnych wątroby szczura

Prace nad metabolizmem bisakrydyn rozpoczęto od analizy podatności badanych związków ( C-2028, C-2041, C-2045 i C-2053) na utlenianie (I faza biotransformacji), wobec nieaktywowanych frakcji enzymów mikrosomalnych komórek wątroby szczura. W tym celu przygotowano mieszaniny reakcyjne zawierające: 0,05 mM związek C-2028/C-2041/C-2045/C-2053, frakcję mikrosomalna RLM (2mg/ml), 2mM kofaktor NADPH, 2 mM MgCl2 w buforze HEPES o pH 7,4, po czym inkubowano je przez 30 min w 37°C. Analizy RP-HPLC badanych mieszanin reakcyjnych przeprowadzono zarówno przed jak i po inkubacji. Otrzymano chromatogramy, które zestawiono i zamieszczono poniżej (Rys.IV.15.).

0

Rys. IV.15. Zestawienie analiz chromatograficznych mieszanin reakcyjnych zawierających 0,05mM związek A – C-2028, B – C-2041, C – C-2045, D – C-2053, 2mM NADPH, 2 mg/ml RLM i bufor HEPES o pH 7.4, inkubowanych przez 0 i 30 min w 37ºC. Analiza prowadzona metodą RP- HPLC (Shimadzu).

Analizując powyższe chromatogramy można dostrzec, że badane związki ulegają, choć w różnym stopniu, metabolizmowi wobec nieaktywowanych enzymów mikrosomalnych wątroby szczura. Najefektywniej przemiany metaboliczne zachodzą w przypadku związku C-2028, C-2045 i C-2053 dając co najmniej 4 główne produkty. Natomiast związek C-2041 wykazał najniższą podatność na metabolizm wobec RLM. Ponadto jako jedyny nie pojawia się w formie jednego, ostrego piku, lecz dwóch. C-2041 wykazuje znacznie mniejszą rozpuszczalność w roztworach wodnych w porównaniu do pozostałych trzech związków (C-2028, C-2045 i C-2053). Zatem obraz ten może wynikać z faktu, iż związek C-2041 występuje w roztworze podlegającym podziałowi w dwóch formach. Mogą one być różnymi, pozostającymi w równowadze, formami zjonizowania związku. Ponadto związek ten wykazuje słabsze właściwości hydrofilowe i trudniej ulega podziałowi na kolumnie chromatograficznej, co obserwuje się jako wyższy czas retencji (ok. 19 min). Przyczyna tych różnic może być związana z obecnością w strukturze związku C-2041 dodatkowego pierścienia piperazynowego. Należy również dodać, iż wydłużenie czasu inkubacji do 60 min nie powodowało przyrostu stężenia

IV.4.2. Metabolizm pochodnych bisakrydyny C-2028, C-2045 wobec ludzkich enzymów mikrosomalnych

Pierwszym etapem badań było zbadanie przemian metabolicznych dwóch pochodnych wobec nieaktywowanych, szczurzych enzymów mikrosomalnych oraz ludzkich aktywowanych deksametazonem (Dex), fenobarbitalem (PB) i 3-metylocholantrenem (3MC), czyli o podwyższonej aktywności izoenzymów P450, odpowiednio z podrodzin 3A, 2B i 1A [Monostory i in. 1994, Yoon i in. 2002, Mączka i in. 2016]. Badania te miały na celu określenie wobec której grupy enzymów cytochromu P450 przemiany metaboliczne bisakrydyn zachodzą najefektywniej.

Przygotowano mieszaniny reakcyjne zawierające 0,05 mM związek, odpowiednią frakcję mikrosomalną (2mg/ml), 2mM kofaktor NADPH, 2 mM MgCl2 i bufor HEPES o pH 7,4. Inkubację prowadzono przez 30 min w 37^oC, rejestrując również chromatogramy mieszanin na starcie inkubacji. Otrzymane analizy RP-HPLC dla dwóch najbardziej różniących się strukturą, badanych bisakrydyn tj. C-2028 i C-2045 zestawiono i zamieszczono poniżej (Rys.IV.16.).

Rys.IV.16. Zestawienie analiz chromatograficznych mieszanin reakcyjnych zawierających 0,05mM bisakrydynę po inkubacji z frakcją mikrosomalną (2mg/ml) A – po 30 minutowej inkubacji z nieaktywowanymi RLM i aktywowanymi 3MC, PB, Dex, B – po 2, 5, 10 min inkubowania związku z aktywowanymi mikrosomami Dex. Jako kofaktor zastosowano 2mM NADPH. Analiza prowadzona metodą RP- HPLC (Shimadzu).

Na wykresie (Rys.IV.16a) wykazano, że niezależnie od rodzaju zastosowanych frakcji enzymów mikrosomalnych, związki C-2028 i C-2045 ulegają przemianom metabolicznym, dając co najmniej 4 główne produkty. Największy stopień przereagowania substratu nastąpił wobec mikrosomów aktywowanych deksametazonem (Dex), czyli o podwyższonej ekspresji izoenzymów P450 3A. Najsłabszy efekt obserwuje się wobec mikrosomalnych enzymów

Pobrano z mostwiedzy.pl

nieaktywowanych (RLM). W przypadku frakcji aktywowanych fenobarbitalem (PB) i 3-metylocholantrenem (3MC), podobnie jak w przypadku RLM stężenia powstałych wobec nich metabolitów są dużo niższe niż w wypadku Dex. Ponadto związek C-2028 metabolizuje dużo szybciej w porównaniu z C-2045, czyli analogiem zawierającym grupę hydroksylową w pierścieniu imidazoakrydonu (Rys.IV.16b.) Po 10 minutach inkubacji związku C-2028 z frakcją mikrosomalną Dex widać, iż związek ten przereagował praktycznie w 100%, natomiast w przypadku C-2045 po takim czasie inkubacji nie zidentyfikowano produktów przemiany metabolicznej. Otrzymane wyniki dowodzą, iż szlaki metaboliczne badanych pochodnychbisakrydyn są dość skomplikowane. Ponadto przemiany bisakrydyny nie posiadających w swojej strukturze grupy hydroksylowej w pierścieniu imidazoakrydonu w badanych warunkach zachodzą dużo szybciej, w porównaniu ze swoimi analogami hydroksylowymi.

IV.4.3. Analiza widm UV-vis metabolitów pochodnych bisakrydyny otrzymanych wobec mieszaniny enzymów mikrosomalnych

Podczas analiz chromatograficznych zebrano również widma UV-vis produktów biotransformacji badanych związków, C-2028 i C-2045 powstających wobec różnych enzymów frakcji mikrosomalnych i przedstawiono na (Rys.IV.17)

Rys.IV.17. Porównanie widm UV-vis związków A – C-2028, B – C-2045 i ich monomerów oraz metabolitów powstałych wobec ludzkich enzymów mikrosomalnych Dex. Analiza prowadzona metodą RP- HPLC (Shimadzu).

Analizując powyższe dane można dostrzec, iż widma absorpcyjne metabolitów różnią się, niektóre w mniejszym (Met C-2045), niektóre w większym stopniu (Met C-2028) od widm UV-vis związków macierzystych. Sugeruje to, iż po przemianie zmiany nastąpiły w strukturze chromoforu badanych dimerów. Na podstawie badań prowadzonych dla monomerów badanych bisakrydyn [Potęga i in. 2011, Wiśniewska i in. 2012] można wstępnie wnioskować, że w dimerze modyfikacje nastąpiły prawdopodobnie w pierścieniu 1-nitroakrydyny, ponieważ tylko monomery 1-nitroakrydyny, a nie imidazoakrydonu wykazywały wcześniej podatność na metabolizm wobec enzymów P450. Ponadto stwierdzono, iż widma UV-vis otrzymanych produktów mają inny kształt niż widma monomerów (Rys. IV.17.), zatem można twierdzić, że otrzymane metabolity pozostają dimerami.

Pobrano z mostwiedzy.pl