A.3. Metabolizm w gla i azotu w dojrzałej brodawce
Znacznikiem fizjologicznym decyduj cym tradycyjnie o zakwalifikowaniu genu do grupy wczesnych b d pó nych nodulin, jest rozpocz cie wi zania azotu [Nap i Bisseling 1990]. W procesie tym azot cz steczkowy (N2) ulega wi zaniu i redukcji w
bakteroidach przy pomocy bakteryjnego enzymu – nitrogenazy. Nast pnie zostaje uwalniany do cytoplazmy komórki gospodarza w formie amoniaku (Rys. 5). Charakterystycznym wska nikiem dojrzało ci funkcjonalnej brodawek jest ich ró owe zabarwienie, wynikaj ce z produkcji du ej ilo ci białka leghemoglobiny – mo e ona stanowi nawet 30% białek obecnych w zainfekowanych komórkach tkanki bakteroidalnej. Leghemoglobiny to białka zawieraj ce hemow grup prostetyczn . Zazwyczaj kodowane s przez rodziny genów: u M. truncatula zidentyfikowano ich 6, a u L. japonicus i L. luteus - po 3 [Györgyey i wp. 2000; Szczygłowski i wsp. 1997, Szybiak-Stró ycka i wsp. 1987]. Od dawna uwa ano, e leghemoglobiny pełni wa n funkcj w regulacji st enia tlenu cz steczkowego w brodawce, wi c jego nadmiar i stopniowo uwalniaj c. W ten sposób st enie tlenu utrzymuje si na poziomie na tyle niskim, aby nie nast piła dezaktywacja kompleksu nitrogenazy, a jednocze nie wystarczaj cym do podtrzymania procesów oddechowych bakteroidów i produkcji ATP. Tez t udokumentowano bezpo rednio stosunkowo niedawno, wyciszaj c ekspresj trzech genów symbiotycznych leghemoglobin w L. japonicus technik RNAi [Ott i wsp. 2005]. Co ciekawe, okazało si , e w takich brodawkach obserwowano obni ony poziom mRNA nitrogenazy, jednocze nie nie wykrywaj c białka. Poniewa st enie wolnego tlenu w gł bszych partiach brodawki w dalszym ci gu było stosunkowo niskie, mo e to znaczy , e symbiotyczne leghemoglobiny pełni tak e inne funkcje poza buforowaniem tlenu (zob. te podrozdział A.4). Na dodatkow rol tych genów w symbiozie wskazuj te doniesienia, e u V. sativa transkrypty leghemoglobiny wykryto ju po 1 godzinie od podania czynnika Nod, cho gen ten uwa any jest za typow pó n nodulin [Heidstra i wsp. 1997].
Uwolniony do cytoplazmy komórki ro linnej amoniak jest wł czany w przemiany aminokwasów dzi ki aktywno ci syntetazy glutaminowej (GS, EC 6.3.1.2) oraz zale nej od NADH syntazy glutaminianowej (NADH-GOGAT, EC 1.4.1.14). Syntetyzowane w cyklu GS/GOGAT kwas glutaminowy oraz glutamina s dalej przekształcane w kwas asparaginowy i asparagin w reakcjach katalizowanych przez aminotransferaz kwasu asparaginowego (AAT, EC 2.6.1.1) oraz syntetaz asparaginy (AS, EC 6.3.5.4). Amidy te s jednocze nie podstawowymi transporterami azotu z brodawek typu niezdeterminowanego do pozostałych cz ci ro liny (Rys. 5). Analizy biochemiczne i molekularne wykazały, e za metabolizm w gla i azotu w brodawkach odpowiadaj głównie brodawkowo-specyficzne lub wzmocnione izoformy tych
podstawowych enzymów, kodowanych z reguły przez rodziny wielogenowe [Shi i wsp. 1997; Hohnjec i wsp. 1999; Trepp i wsp. 1999; Yoshioka i wsp. 1999]. Przykładowo, w brodawkach M. sativa zidentyfikowano trzy ró ne izoformy syntetazy glutaminowej, dwie cytozolowe i jedn plastydow , przy czym to głównie cytozolowe izoformy
Rysunek 5. Metabolizm w gla i azotu w symbiotycznej brodawce niezdeterminowanej. Pełne nazwy enzymów – w tek cie Wi zka przewodz ca Symbiosom Zainfekowana komórka asparagina sacharoza sacharoza UDP-glukoza + fruktoza UDP glukozo-1-fosforan glukozo-6-fosforan fruktozo-6-fosforan fruktozo-1,6-difosforan 2-fosfoglicerynian fosfoenolopirogronian pirogronian cykl Krebsa Mitochondrium Bakteroid bursztynian fumaran jabłczan szcawiooctan N2 HCO3 CO2 NH3 glutamina glutamina glutaminian glutaminian glutaminian aspargina asparginian asparginian szcawiooctan Plastyd α-ketoglutaran AS GOGAT GS MDH CA SuSy PEPC AAT NH4+
(brodawkowo wzmocniona GS13 oraz GS100) s zaanga owane w asymilacj amoniaku [Temple i wsp. 1995]. Z kolei syntaza glutaminianowa zale na od NADH wyst puje przede wszystkim w brodawkach, a jej poziom jest niewykrywalny w tkankach zielonych, gdzie dominuje forma enzymatyczna zale na od ferredoksyny [Gregerson i wsp. 1993]. Metod hybrydyzacji in situ okre lono lokalizacj transkryptów genów metabolizmu w gla i azotu w niezdeterminowanych brodawkach
M. sativa [Trepp i wsp. 1999]. W młodych brodawkach najsilniejsza ekspresja tych genów ma miejsce w strefie przej ciowej, a w dojrzałych, 33-dniowych organach – przede wszystkim w dystalnej cz ci strefy wi zania azotu, gdzie równie wykrywany jest wysoki poziom aktywno ci nitrogenazy. Znacz cy poziom ekspresji genów GS100 i AS wykryto równie w proksymalnej cz ci strefy III, gdzie nie zachodzi ju wi zanie azotu, a tkanka bakteroidalna zaczyna przejawia pierwsze objawy starzenia. Sugeruje to udział tych enzymów w re-mobilizacji i odzyskiwaniu zwi zków azotowych z komórek. Jest to równie zgodne z doniesieniami na temat ich aktywno ci w starzej cych si tkankach zielonych A. thaliana i Asparagus officinalis L [Bernhard i Matile 1994; Davies i King 1993].
W brodawkach zdeterminowanych form transportow zwi zanego azotu s ureidy, takie jak alantoina i kwas alantoinowy. U soi kluczowe enzymy w procesie oksydacji puryn – urykaza (homotetramer polipeptydu znanego jako nodulina 35) oraz alantoinaza, ulegaj ekspresji w peroksysomach niezainfekowanych komórek tkanki bakteroidalnej. Sie tworzona przez te komórki stanowi tak e drog transportu organicznych zwi zków azotowych do tkanki przewodz cej brodawki, inaczej ni w przypadku ro lin o brodawkach niezdeterminowanych, gdzie amidy s transportowane do wi zek przewodz cych za po rednictwem komórek transferowych. Co ciekawe, transkrypty genów homologicznych do urykazy/noduliny 35 zaobserwowano tak e w brodawkach niezdeterminowanych M. sativa, a wzorzec ich ekspresji był zbie ny z profilem opisanym dla brodawek zdeterminowanych. Wykrycie obecno ci ureidów w soku ksylemowym potwierdziło funkcjonalno tych genów w lucernie [Cheng i wsp. 2000].
Asymilacja amoniaku wymaga dostarczenia energii oraz ła cuchów w glowych niezb dnych do syntezy aminokwasów. ródłem w gla dostarczanym do brodawek s produkty fotosyntezy, głównie sacharoza, która nast pnie jest metabolizowana do
szczawiooctanu przy udziale szeregu enzymów, mi dzy innymi syntazy sacharozy (SuCS, EC 2.4.1.13) oraz karboksylazy fosfoenolopirogronianu (PEPC, EC. 4.1.1.31). Z kolei szczwiooctan jest nie tylko donorem w gla w procesie asymilacji amoniaku, ale słu y równie do produkcji innych zwi zków organicznych, np. jabłczanu, niezb dnego do podtrzymania metabolizmu bakteroidów (Rys. 5). Syntez jabłczanu katalizuje dehydrogenaza jabłczanowa (MDH, EC.1.1.1.37). Brodawkowo wzmocnione izoformy tego enzymu zidentyfikowano mi dzy innymi u grochu i lucerny [Appels i Haaker 1988; Miller i wsp. 1998]. Natomiast enzym anhydraza w glanowa (AC, EC 4.2.1.1) prawdopodobnie pełni w brodawkach podwójn funkcj – uczestniczy w przemianach fosfoenolopirogronianu do szczawiooctanu w komórkach strefy wi cej azot, ale tak e bierze udział w transporcie gazów maj cym miejsce w cz ci korowej brodawki [Coba de la Pena i wsp. 1997; Galvez i wsp. 2000].