Metody analityczne wykorzystywane w badaniu metabolomu

Metabolomika jest najmłodszą z dziedzin genomiki funkcjonalnej. Postęp w zakresie metod analitycznych wykorzystywanych do badania związków niskocząsteczkowych umoŜliwia coraz bardziej precyzyjne określanie zawartości analizowanych substancji w poszczególnych próbkach. Ze względu na duŜe zróŜnicowanie fizykochemiczne metabolitów nie ma jednej metody analitycznej, która byłaby odpowiednia dla całej puli

związków. W badaniach transkryptomu, analizujemy polimer składający się z czterech jednostek budulcowych zbliŜonych do siebie pod względem struktury i grup funkcyjnych, podobnie w przypadku białek, gdzie analizowanych jest ok. 20 jednostek budulcowych – aminokwasów z moŜliwymi modyfikacjami. Badania metabolomu prowadzone są zwykle w połączeniu z analizą pozostałych poziomów molekularnych. Trudności w analizie metabolitów w porównaniu z transkrypcją oraz białkami wynikają z następujących własności:

- braku bezpośredniego odniesienia do kodu genetycznego,

- metabolity są produktami złoŜonych szlaków reakcji enzymatycznych w komórkach i tkankach,

- zróŜnicowania strukturalnego metabolitów - nie tworzą w duŜej części przypadków polimerów zbudowanych z ograniczonej liczby jednostek monomerycznych,

- braku obecnie moŜliwości zastosowania techniki uniwersalnej w analizie cząsteczek o zróŜnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych (Saghatelian i Cravatt, 2005; Sumner i in., 2003).

W związku ze zróŜnicowaniem właściwości strukturalnych obserwowanych dla produktów naturalnych istniała konieczność opracowania róŜnych podejść analitycznych, wykorzystywanych do analiz całej puli metabolitów lub wybranych związków syntezowanych w jednym ze szlaków biosyntezy w komórce. KaŜda z dróg obranych przez eksperymentatora wpisuje się w jedną z dwóch strategii - analizę celowaną (ang. target

analysis), polegającą na badaniu określonych klas związków, niekoniecznie o znanej i

zweryfikowanej strukturze, bądź analizę niecelowaną, w której nie ma sprecyzowanej docelowej grupy metabolitów (Morgenthal i in., 2006; Goodacre i in., 2004).

Strategie analityczne stosowane podczas analizy metabolomu (Rys. 3-8) (Fiehn, 2002; Goodacre, 2007):

- metaboliczny odcisk palca – umoŜliwia szybką analizę semi-ilościową jak największej ilości związków, niekoniecznie prowadzącą do identyfikacji, stosuje się w celu szybkiej klasyfikacji próbek ze względu na ich biologiczny związek i pochodzenie, wykorzystywane metody analityczne: LC/DIMS (ang. liquid

chromatography/ direct infusion mass spectrometry), LC/NMR (ang. liquid chromatography/ nuclear magnetic resonance),

- metaboliczny odcisk stopy – odmiana metabolicznego odcisku palca, podejście, w którym bada się metabolity zewnątrzkomórkowe, wykorzystywane metody analityczne: LC/DI MS, LC/NMR,

- profilowanie metabolitów – najbardziej powszechne podejście do badania metabolomu, polega na określaniu zmian ilościowych oraz jakościowych w grupie metabolitów naleŜących do jednej klasy związków (np. lipidy, flawonoidy, alkaloidy), LC/UV/MS/MS (ang. liquid chromatography/ultraviolet/tandem mass

spectrometry), GC/MS (ang. gas chromatography/mass spectrometry), GC/GC/MS

(ang. two dimensional gas chromatography mass spectrometry), CE/MS (ang.

capillary electrophoresis/mass spectrometry), LC/NMR,

- analiza celowana – stosowana do śledzenia zmian ilościowych określonego związku np. substratu lub produktów badanej reakcji enzymatycznej, zastosowana metoda ekstrakcji powinna być selektywna dla badanej klasy produktów naturalnych, wykorzystywane metody analityczne: LC/UV/MS, GC/MS.

Rys. 3-8 RóŜne strategie analizy metabolomu (wg Dunn i Ellis, 2005).

Występowanie w tkankach roślinnych szerokiej gamy metabolitów o silnie zróŜnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych oraz stęŜeniach sprawiają, Ŝe badanie metabolomu roślinnego stanowi wyzwanie dla badaczy wykorzystujących róŜne techniki analityczne. Obecnie szereg metod identyfikacji niskocząsteczkowych produktów naturalnych jest wykorzystywanych w analizie metabolomu. Dobranie właściwej metody analitycznej do badanego materiału oraz informacji, jakie chce się uzyskać z analizy jest

kluczowym krokiem w planowaniu eksperymentu. Kryteriami przy wyborze odpowiedniej techniki są jej czułość i specyficzność oraz czas trwania i koszty analizy (Rys. 3-9). Najbardziej popularnymi metodami stosowanymi do identyfikacji związków w metabolomice są NMR i spektrometria mas. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego jest, jak dotąd jedyną metodą instrumentalną, która dysponuje odpowiednią specyficznością podczas analizy strukturalnej i dzięki której moŜna zidentyfikować nieznany związek de novo bez korzystania ze standardów. Charakteryzuje się jednak niską czułością, co sprawia, Ŝe zastosowanie tej metody jest ograniczone w przypadku mieszanin metabolitów oraz związków o niskim stęŜeniu. Technika spektrometrii mas natomiast jest metodą o wysokiej czułości i niewiele niŜszej selektywności niŜ NMR, pozwalającą na identyfikację związku na podstawie wyznaczenia jego masy oraz sposobu fragmentacji. Otrzymane tą techniką dane nie umoŜliwiają jednak określenia kompletnej struktury nieznanego wcześniej związku. Metody spektroskopii promieniowania w ultrafiolecie, w podczerwieni oraz fluorescencyjnej mogą dopełnić charakterystykę strukturalną badanego związku, ale z racji swej niskiej specyficzności nie mogą być narzędziem przeznaczonym do jednoznacznej identyfikacji substancji (Sumner i in., 2003).

Niezbędnym elementem podczas badań metabolomu są narzędzia bioinformatyczne, które stosowane są do analizy danych i pomagają w uzyskaniu wartościowych informacji dla eksperymentatora. Takimi narzędziami są analiza skupień (ang. Cluster Analysis) oraz analiza składowych głównych (ang. principal components

analysis - PCA) (Roessner i in., 2001; Fhien, 2002). W bardziej ogólnym podejściu do

analizy metabolomu, metaboliczny odcisk palca, przedstawiono moŜliwość zastosowania metody analizy niezaleŜnych komponentów (ang. independent component analysis – ICA) (Scholz i in., 2004). Droga od rejestracji danych do interpretacji wyniku eksperymentu wiedzie przez odpowiednią klasyfikację rejestrowanych sygnałów, przekształcenie ich w format umoŜliwiający zastosowanie poŜądanego algorytmu (formowanie macierzy, normalizacja, uzupełnienie brakujących wartości), pozwalającego na sprawne przeprowadzenie czasochłonnych obliczeń oraz wizualizację wyników (Steinfah i in., 2008).

Rys.3-9 ZaleŜność czułości od specyficzności metod analitycznych stosowanych w analizie metabolomu (Sumnner i in., 2003).

Bazy danych obrazujące zróŜnicowanie na poziomie transkryptomu są juŜ powszechnie dostępne (Shmid i in., 2005; Craigon i in., 2004). Choć powstało równieŜ kilka baz danych metabolitów udostępnionych publicznie jak np. Golm Metabolite Database, KNApSAcK, Tomato Metabolome Database (TOMET), Metabolome Tomatoe Database (MoToDB), MassBank, potrzebne jest dalsze tworzenie powszechnie dostępnych zbiorów identyfikacji metabolitów w celu pokrycia szerszego zakresu struktur substancji występujących w metabolomie (Kopka i in., 2005; Moco i in., 2006; Shinbo i in., 2006). Baza danych dotycząca metabolitów pierwotnych, identyfikowanych techniką GC-MS powstała najwcześniej, poniewaŜ stosowana metoda analityczna charakteryzuje się najlepszą powtarzalnością wyników. Bazy widm metabolitów wtórnych analizowanych na układach LC-MS wymagają większej precyzji w kontroli warunków eksperymentu oraz dokładniejszego opisu stosowanych parametrów ze względu na mniejszą powtarzalność procesów jonizacji i fragmentacji związków. W komercyjnie dostępnych bazach danych takich jak Fiehn-Library, NIST, Wiley oraz Mass Spectrometry Database Committee zawarte są zarówno dane z eksperymentów LC-MS jak i GC-MS. ZłoŜoność przebiegu procesów metabolicznych oraz próbę połączenia danych z róŜnych poziomów genomiki funkcjonalnej obrazuje baza danych MetaCyc, w której zebrane są wszystkie eksperymentalnie poznane reakcje biochemiczne związków niskocząsteczkowych zachodzące w komórce (Caspi i in., 2006, 2008).

Podobnie jak w eksperymentach na poziomie transkryptomu i proteomu zaistniała potrzeba standaryzacji badań w dziedzinie metabolomiki. Propozycja ustalenia protokołów zawierających minimum informacji o eksperymentach przeprowadzanych na związkach niskocząsteczkowych została opracowana przez grupę czołowych badaczy skupionych w

grupie Metabolomics Standard Initiative (MSI) w zakresie metabolomiki (Jenkins i in. 2004, Keurentjes i in., 2006; Weckwerth, 2007; Goodacre i in., 2007; Sanson i in., 2007; Fihen i in., 2007). Precyzyjne określenie warunków przeprowadzania eksperymentów metabolomicznych umoŜliwia porównanie wyników uzyskiwanych w róŜnych laboratoriach, co jest kluczem do zintegrowanego podejścia w badaniach organizmów.