Otrzymane ko-kryształy charakteryzuje się poprzez zastosowanie różnych technik eksperymentalnych w celu jasnego i jednoznacznego zidentyfikowania otrzymanej postaci stałej, a także ustalenia jej składu i struktury. Istotne jest również określenie właściwości fizycznych i chemicznych [Cherukuvada i in., 2016]. Najczęściej stosowane metody zostały scharakteryzowane w kontekście ich użyteczności do opisu krystalicznych układów wieloskładnikowych.
4.1. Metody rentgenowskie
Do scharakteryzowania struktury stosuje się między innymi metody rentgenowskie (zarówno rentgenografię proszkową, jak i monokrystaliczną). Rentgenografia proszkowa
(PXRD) jest jedną z najczęściej stosowanych technik identyfikacji i charakteryzacji ko-kryształów, zwłaszcza, że w wielu przypadkach otrzymane fazy mają postać
drobnokrystalicznego proszku. Na podstawie analizy dyfraktogramów proszkowych, poprzez porównanie obrazów dyfrakcyjnych poszczególnych składników użytych do syntezy, można potwierdzić lub wykluczyć otrzymanie nowej fazy stałej [Hiendrawan i in., 2016] lub wywnioskować, czy nowootrzymana faza stała faktycznie jest ko-kryształem, czy też nieprzereagowaną mieszaniną składników [Horst i in., 2009]. W zasadzie, rentgenografia proszkowa może posłużyć do wyznaczenia struktury prostego związku, wtedy, gdy otrzymanie monokryształów jest niemożliwe [Mukherjee i in., 2013]. Rozwiązanie struktury z danych proszkowych jest o wiele bardziej skomplikowane ze względu na jednowymiarowy obraz dyfrakcyjny [McCusker, 1999]. Rentgenografia proszkowa jest użyteczną metodą służącą do badań zmiany struktury fazy podczas przejść fazowych lub chemicznych transformacji zachodzących w ciele stałym w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, ciśnienie czy wilgotność [Pindelska i in., 2017].
Rentgenografia monokryształów odgrywa istotną rolę w badaniach podstawowych i daje pełną charakterystykę strukturalną otrzymanej fazy krystalicznej [Friščić, Jones, 2010]. Jest to główna i preferowana metoda służąca do wyznaczania struktur cząsteczek i kryształów.
Rozwiązanie struktury kryształu umożliwia dokładne poznanie między innymi składu chemicznego, a także, co ważniejsze, wyznaczenie parametrów geometrycznych opisujących budowę cząsteczek i kryształów, takich jak długości wiązań, kątów walencyjnych, kątów torsyjnych, odległości międzypłaszczyznowych, a także geometrii oddziaływań między-cząsteczkowych [Glusker, Trueblood, 1977]. Rentgenowska analiza strukturalna dostarcza pełnych informacji na temat sposobu upakowania cząsteczek w krysztale oraz motywów wiązań wodorowych w sieci krystalicznej.
Pomiar dyfrakcyjny wykonany dla monokryształu powinien zostać uzupełniony o analizę dyfraktogramu proszkowego, z tego względu, że monokryształ wybrany do badań, niekoniecznie musi stanowić reprezentację całej próbki. Ostatecznie, dokonuje się porównania zmierzonego eksperymentalnie dyfraktogramu oraz dyfraktogramu obliczonego dla
rozwią-24
fazy proszkowej i monokrystalicznej [Swapna i in., 2014].
4.2. Metody spektroskopowe
Oprócz omówionych metod dyfrakcyjnych, duże znaczenie mają także metody spektroskopowe (spektroskopia FT-IR, Ramana, spektroskopia NMR w fazie stałej).
Spektroskopia IR jest bardzo dobrą i użyteczną metodą służącą po pierwsze do potwierdzenia otrzymania nowej fazy krystalicznej (soli lub ko-kryształu) zwłaszcza, gdy jako ko-formery stosowane są kwasy karboksylowe, jak również do monitorowania przebiegu reakcji mechanochemicznych oraz do charakteryzacji produktów tych reakcji [Hiendrawan i in., 2016; Schultheiss, Newman, 2009]. Spektroskopia w podczerwieni jest szeroko stosowana do rozróżnienia postaci krystalicznych, takich jak odmiany polimorficzne, klatraty, solwaty czy ko-kryształy.
Metody spektroskopowe odgrywają także znaczącą rolę w analizie oddziaływań międzycząsteczkowych (głównie jeśli chodzi o tworzenie międzycząsteczkowych wiązań wodorowych typu O-H∙∙∙N) oraz identyfikacji syntonów supramolekularnych występujących w sieci krystalicznej [Mukherjee i in., 2013]. Zadanie to niekiedy jest utrudnione przez niewielkie różnice w położeniu pasm pochodzących od tych samych drgań grupowych.
Technika IR pozwala na rozróżnienie alternatywnych krystalicznych form farmaceutyków, jakimi są np. odmiany polimorficzne czy hydraty. Szczególnie przydatna jest technika ATR-FTIR zwłaszcza, jeżeli przeanalizujemy uzyskane wyniki w obszarze średniej podczerwieni.
Zaletą tej metody jest niewielka ilość preparatu, jak również brak specjalnego przygotowania próbki potrzebnej do badań. Technika ta jest także szybka i niedestrukcyjna [Bowmaker, 2013]. Ogólnie ujmując, metody spektroskopowe są przydatne do badań substancji organicznych zarówno w postaci krystalicznej, jak i amorficznej, w celu ich identyfikacji, a także do charakterystyki różnic strukturalnych. Za pomocą tych metod możliwe jest także badanie przejść fazowych w ciele stałym oraz monitorowanie różnego rodzaju procesów, takich jak na przykład desolwatacja [Pindelska i in., 2017].
Spektroskopia NMR w fazie stałej umożliwia różnicowanie chiralnych i racemicznych ko-kryształów o podobnej strukturze. Warto wspomnieć, że spektroskopia NMR ciała stałego jest komplementarną techniką w stosunku do metod rentgenograficznych, kiedy struktura ko-kryształu nie może być wyznaczona metodą rentgenowskiej analizy strukturalnej [Friščić, Jones, 2010].
4.3. Metody termoanalityczne
Poprzez pojęcie „analizy termicznej” rozumie się zespół technik, które opierają się na pomiarze zmian wybranych właściwości fizycznych badanej substancji w funkcji temperatury.
Spośród technik termoanalitycznych największe znaczenie w praktyce zyskała różnicowa analiza termiczna, różnicowa kalorymetria skaningowa, termograwimetria oraz termo-mikroskopia [Giron, 2002].
Zmiany temperatury próbki są spowodowane reakcjami chemicznymi oraz przemianami fazowymi (np. topnieniem, parowaniem, reakcjami dehydratacji, dysocjacji, krystalizacji, sublimacji, rozkładu), którym towarzyszy zmiana entalpii [Vioglio i in., 2017]. W poniższej Tabeli zostały ujęte najważniejsze procesy fizyczne i chemiczne, które mogą być badane metodami analizy termicznej (Tabela 3) [Findorkova i in., 2013].
25
W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat metody termoanalityczne zyskały znaczenie w nauce i przemyśle farmaceutycznym. Analiza termiczna jest stosowana m.in. w jakościowej i ilościowej analizie składu fazowego i chemicznego substancji leczniczych, w badaniach ich czystości, trwałości, termostabilności oraz w badaniach fizykochemicznych do wyznaczania parametrów termodynamicznych oraz kinetycznych reakcji [Brandão i in., 2008].
Tabela 3. Przemiany fizyczne i chemiczne, które można badać przy użyciu analizy termicznej [Findorkova i in., 2013]
przemiany termiczne efekt termiczny zmiana masy
przemiany fizyczne endo egzo ubytek przyrost
przemiana krystaliczna
reakcje chemiczne endo egzo ubytek przyrost
dehydratacja / desolwatacja rozkład
reakcje ciało stałe – ciało stałe reakcje ciało stałe – ciecz reakcje ciało stałe – gaz reakcje redoks
W skaningowej kalorymetrii różnicowej mierzy się różnicę temperatur pomiędzy próbką, a materiałem odniesienia (dT/dt) i analizuje się ją w funkcji czasu lub temperatury.
Eksperyment polega na ogrzewaniu lub chłodzeniu próbki zgodnie z ustawionym programem temperaturowym. Jeżeli w badanej próbce zachodzi przemiana egzotermiczna (np. krystalizacja, utlenianie), więcej ciepła musi być dostarczone do substancji referencyjnej, co jest równoważne z pobieraniem energii z próbki. Podczas procesu endotermicznego (np. dehydratacja), dodatkowa ilość ciepła musi zostać dostarczona do próbki. Głównym zastosowaniem DSC jest badanie przejść fazowych, temperatury topnienia oraz kontrola czystości substancji. Technika DSC to również doskonała metoda badania polimorfizmu substancji aktywnych biologicznie [Höhne i in., 1996].
Pomiary termograwimetryczne wykorzystywane są przede wszystkim do określenia składu (także układów wieloskładnikowych) i stabilności termicznej substancji. Z badań tych można również uzyskać informacje na temat kinetyki rozkładu materiałów, wilgotności czy zawartości lotnych substancji w próbce [Pindelska i in., 2017].
Termomikroskopia stanowi połączenie mikroskopii optycznej (z wykorzystaniem mikroskopu polaryzacyjnego) oraz analizy termicznej. Metodę tę stosuje się w badaniach właściwości fizycznych substancji w funkcji temperatury i czasu. Polega ona na obserwowaniu zachowania próbki umieszczonej na szkiełku mikroskopowym podczas cyklu ogrzewania oraz
26
badania krystalicznych układów wieloskładnikowych, odmian polimorficznych oraz solwatów [Haines, 2012; Steed, 2013]. Warto zaznaczyć, że termomikroskopia jest metodą komplementarną w stosunku do skaningowej kalorymetrii różnicowej oraz analizy termograwimetrycznej [Simek i in., 2016].