METODY

Odczyty wyników testów oceniających procesy biologiczne (śmierć komórek, proliferację) z wykorzystaniem przeciwciał sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi zostały wykonywane z wykorzystaniem cytometru przepływowego FAC Calibour flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) w Katedrze i Zakładzie Fizjopatologii GUMed.

4.1. I

Fragmenty błony śluzowej umieszczano w roztworze dyspazy o stężeniu 5 mg/ml (GIBCO); po całonocnej inkubacji w 4°C oddzielony mechanicznie nabłonek od warstwy podnabłonkowej umieszczano w roztworze 0,25% trypsyny z EDTA (SIGMA-ALDRICH) na 30 minut w temperaturze 37°C [31]. Po tym czasie neutralizowano enzym poprzez dodanie medium DMEM z 10% surowicą bydlęcą (SIGMA-ALDRICH, GIBCO). Następnie komórki płukano dwukrotnie w roztworze PBS. Otrzymana w ten sposób zawiesina pojedynczych komórek stanowiła materiał do dalszych badań. Z fragmentu błony śluzowej od jednego pacjenta uzyskiwano od 0,6×10⁶ do 1,2×10⁶ komórek nabłonka o żywotności powyżej 80% ocenianej błękitem trypanu.

W celu oceny zawartości keratynocytów, izolowane komórki znakowano mieszaniną przeciwciał monoklonalnych wykrywających większość ludzkich cytokeratyn nabłonków [anti human cytokeratin clone AE1/AE3 (DAKO)]; oznaczenia wykonano w Zakładzie Patomorfologii GUMed. To badanie immunohistochemiczne wykazało, iż w pozyskiwanym materiale około 97% komórek stanowiły keratynocyty.

Rycina 1 ilustruje morfologiczne zróżnicowanie pozyskiwanych komórek nabłonka jamy ustnej.

Metody

25 Rycina 1. Zróżnicowana morfologia komórek nabłonka jamy ustnej po izolacji widziana w mikroskopie świetlnym w kontraście Hoffmana. Numerem 1 oznaczono komórki duże, płaskie z warstw górnych nabłonka. Mikroskop NIKON TS-100F (powiększenie 200×); Katedra i Zakład Fizjopatologii GUMed.

4.2. O

4.2.1. Parametr FSC (wielkość komórki) i SSC (ziarnistość komórki)

Wykorzystanie metody cytometrii przepływowej, umożliwiło analizę parametrów morfometrycznych takich jak FSC (Farward Side Channel; sygnał rozproszenia światła laserowego do przodu) – względna wielkość komórki, oraz SSC (Scatt Side Channel;

sygnał rozproszenia bocznego światła laserowego) – złożoność struktury wewnętrznej, np. obecność ziarnistości, co pozwala na ocenę morfologicznego zróżnicowania badanych komórek.

Przeprowadzona w ten sposób ocena umożliwiła porównanie wielkości oraz stopnia dojrzałości komórek wszystkich badanych pacjentów. Dodatkowo oceniano stopień aktywacji kaspaz w odniesieniu do wielkości i ziarnistości komórek, co pozwoliło na stwierdzenie, czy aktywność tych proteaz zmienia się wraz ze zmianą

Metody

wielkości komórki i ilości wewnątrzkomórkowych ziarnistości, a więc wraz z procesem dojrzewania keratynocytów.

4.2.2. Obraz komórek w mikroskopie konfokalnym

Izolowane komórki po odpowiednich barwieniach analizowano przy pomocy systemu mikroskopii konfokalnej (Nikon, Japonia) i programów: Laser Sharp 2000 i Laser Pix V. 4. 001 (BioRad, GB) w Katedrze Anatomii GUMed.

4.3. O

Ocena cytometryczna utrwalonych komórek, barwionych jodkiem propidyny (PI) (dawka PI wiążąca się z DNA), pozwala na oznaczenie zawartości DNA i określenie odsetka komórek znajdujących się w poszczególnych fazach cyklu komórkowego:

G0/G1, S i G2/M. Metoda ta określa również odsetek komórek o obniżonej zawartości DNA (m.in. komórki apoptyczne będące w fazie rozpadu na ciałka apoptyczne), lokalizujące się w obszarze sub G0/G1. Izolowane keratynocyty nabłonka jamy ustnej zawieszano w PBS, następnie utrwalano przez minimum 24 godz. w temperaturze -20^°C w 70% alkoholu etylowym. Po odpłukaniu alkoholu etylowego roztworem PBS, komórki zawieszano w 1 ml roztworu barwiącego (RNaza A 100 µg/ml, PI 40µg/ml w PBS), inkubowano przez 30 minut w 37^oC w ciemności. Następnie przy pomocy cytometrii przepływowej oceniano zawartość DNA oraz odsetek komórek w poszczególnych fazach cyklu. Dane z 20000 komórek w każdym doświadczeniu analizowano przy pomocy programu Cyflogic 1.2.1 (CyFloltd.).

4.4. M

Ze względu na złożony mechanizm śmierci komórki, w tym apoptozy, i różnorodne drogi jej przebiegu Komitet ds. Nomenklatury Śmierci Komórki (Nomenclature Committee on Cell Death) proponuje, aby przy ocenie tego procesu wybierać kilka testów obrazujących różne parametry apoptozy i szczegółowo je nazywać opisując wyniki. Jest to niezmiernie ważne, aby móc porównywać wyniki poszczególnych prac dotyczących śmierci komórek. Proces dojrzewania komórek nabłonka jamy ustnej prowadzi do fizjologicznej śmierci komórek, przebiegającej z wykorzystaniem mechanizmów apoptozy – głównej drogi fizjologicznej śmierci komórek. W związku z powyższym w obecnej pracy, aby określić odsetek komórek ginących drogą apoptozy wybrano ocenę zmian w strukturze błony komórkowej polegającą na przemieszczeniu

Metody

27 fosfatydyloseryny do zewnętrznej warstwy fosfolipidowej (tzw. eksternalizacja PS) oraz aktywację kaspaz, proteaz szczególnie zaangażowanych w tę drogę śmierci komórek.

4.4.1. Zmiany w strukturze błony komórkowej – eksternalizacja fosfatydyloseryn – jednoczesne barwienie aneksyną V oraz jodkiem propidyny

Jedną z wczesnych zmian w komórce podczas procesu apoptozy jest przemieszczenie fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy fosfolipidowej błony komórkowej (tzw. eksternalizacja fosfatydyloseryny).

Obecność fosfatydyloseryny w błonie komórkowej wykrywana jest dzięki aneksynie V swoiście wiążącej się z PS. Zastosowanie jednoczesnego barwienia aneksyną V sprzężoną z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i jodkiem propidyny PI (wiążę się z DNA) pozwala na wykrycie komórek z uszkodzoną błoną komórkową (Annexin-V-FLUOS, ROCHE). Komórki w liczbie 200 × 10³ inkubowano 20 min w 50 µl roztworu aneksyny V-FITC w buforze z PI w temperaturze pokojowej. Roztwór barwiący przygotowano zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta.

Metoda ta pozwala wyróżnić następujące populacje komórek:

· nie wiążące aneksyny i nie wiążące PI (An-/PI-); komórki uznawane za komórki żywe

· wiążące aneksynę i nie wiążące PI (An +/PI-); komórki wczesnoapoptyczne

· wiążące aneksynę i wiążące PI (An+/PI+); komórki te przyjmowane są za komórki późnoapoptyczne/nekrotyczne.

Ocena stopnia wiązania aneksyny V-FITC wykonana została metodą cytometrii przepływowej. Dane z 10000-20000 komórek w każdym doświadczeniu analizowano przy pomocy programu Cyflogic 1.2.1 (CyFlo ltd.).

4.4.2. Aktywacja kaspaz – metoda FLICA

Do oceny zawartości komórek z aktywnymi kaspazami zastosowany został test FLICA (Fluorochrome-Labeled Inhibitors of Caspase) z wykorzystaniem znakowanego fluorochromem inhibitora kaspaz/y swoiście wiążącego się z centrum aktywnym enzymu. W wykonywanych badaniach zastosowany został znakowany FITC pan-inhibitor VAD-FMK, który wykrywa większość zaktywowanych kaspaz. Jednoczesne barwienie komórek FITC-VAD-FMK i PI pozwoliło na wyróżnienie komórek:

Metody

· wczesnoapoptycznych (kaspazo+/PI-; zaktywowane kaspazy przy nie uszkodzonej błonie komórkowej)

· późnoapoptycznych (kaspazo+/PI+; zaktywowane kaspazy oraz uszkodzenia w błonie komórkowej pozwalające na wnikanie PI do komórki)

· w finalnej fazie apoptozy (kaspazo-/PI+; komórki barwią się PI, ale nie wykazują już aktywności kaspaz)

Wyróżnienie wyżej wspomnianych komórek znajdujących się na różnych etapach apoptozy pozwala prześledzić przebieg procesu apoptozy.

Komórki w liczbie 200 × 10³ inkubowano z 5 µM FITC-VAD-FMK (caspACE^TM -FITC-VAD-FMK, PROMEGA PROBES) w 100 µl przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, po odpłukaniu, umieszczano w PBS z PI o stężeniu 25 µg/ml, a stopień natężenia fluorescencji oceniano metodą cytometrii przepływowej.

Dane z 10000-20000 komórek w każdym doświadczeniu analizowano przy pomocy programu Cyflogic 1.2.1 (CyFloltd.).

4.5. O

Analiza statystyczna wykonana została za pomocą programu STATISTICA 10 (StatSoft, Inc.). Dane w tabelach przedstawione zostały w postaci średnich arytmetycznych ± odchylenie standardowe (OS). Zgodność rozkładu danych dla oznaczeń sprawdzono testem Shapiro-Wilka, a jednorodność wariancji testem Levene`a. Analiza znamienności różnic między badanymi grupami przeprowadzona została nieparametrycznymi testami ANOVA Kruskall’a Wallis’a i testem Dunn’a; za różnice statystycznie znamienne przyjęto wartość p≤ 0,05.

29